Leucemias Agudas II
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LEUCEMIAS AGUDAS CLASIFICACION, DIAGNOSTICO, TRATAMIENTO Y APORTACION DE LAS NUEVAS TECNICAS DIAGNOSTICAS
Carolina Martínez Laperche
FIR 3 Año de Análisis Clínicos
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LEUCEMIAS AGUDASLEUCEMIAS AGUDASEN LA INFANCIAEN LA INFANCIA
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NUEVAS TECNICAS DIAGNOSTICAS
CITOMETRIA DE FLUJO
CITOGENETICA
BIOLOGIA MOLECULAR
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CITOMETRIA DE FLUJOFUNDAMENTOS:� Análisis celular multíparamétrico.
Tamaño(FSC)
Complejidad(SSC)
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� Se analizan dos tipos de parámetros:
1.Características intrínsecas de la célula: tamaño y complejidad de núcleo y citoplasma, mediante dispersión.
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� 2.Características antigénicas de cada célula (inmunofenotipo):
Se determina mediante fluorescencia, esta procede de uniones Ag-Ac unido a un fluorocromo
CD 10
fluorescente
anti-CD 10
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IMPORTANCIA DE LA CFM EN LAS LEUCEMIAS
� Permite el diagnostico mas completo y una mejor tipificación de las leucemias.
� Permite predecir determinadas alteraciones genéticas.
� Identifica marcadores que implican peor pronóstico.
� Identifica fenotipos patológicos que permiten seguimiento y detección de enfermedad mínima residual.
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CFM: LEUCEMIA AGUDA
BLASTOS
LINFOCITOS
MONOCITOS
POBLACIONMIELOIDE
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VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
� Análisis de múltiples parámetros en una misma célula.
� Rapidez: 5000 células /segundo.
� Específico: distingue distintas poblaciones celulares.
� Cuantifica la intensidad antigénica.
� Sensible ( 1 célula / 10000) y objetivo.
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APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA:
1.Detección y cuantificación de Ag celulares:
2.Cuantificación de ácidos nucleicos.
• Estudio de subpoblaciones linfocitarias
• Inmunofenotipaje de leucemias y linfomas.
• Inmunodeficiencias.
• Trasplante: subpoblaciones de linfocitos y recuento de progenitores hematopoyéticos (CD34).
• Inmunofenotipaje de plaquetas.
• Enfermedades autoinmunes.
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CD4 T cellsCD4 T cells
CD8 T cellsCD8 T cells
Cuantificación del número de linfocitos T CD4 en pacientes con HIV
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CITOGENÉTICA
� Estudio de los cromosomas y las enfermedades relacionadas
� Causadas por una alteración en el número y/o estructura de los cromosomas
� Tiene interés diagnóstico y pronóstico
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ANALISIS CITOGENETICO� Citogenética convencional:Estudio de alteraciones cromosomicas en las
metafases de las células tras el cultivo “in vitro”Se suele teñir con Banda G ( Tripsina- Giemsa)Detecta alteraciones en todo el genoma
� Citogenética molecular : FISHHibridación de una sonda de DNA marcada con una
sustancia fluorescente sobre la secuencia complementaria del genoma
Metafase poca calidad o alteraciones cromosomicascrípticas
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CITOGENETICA CONVENCIONAL Y FISH
Citogenética convencional
Ventajas•Permite análisis de todo
el genoma•Técnicamente sencillo
•Bajo coste
Inconvenientes
•Cromosomas metafasicos•Requiere material fresco•Interpretación personal
experimentado
FISHVentajas
• Permite la localización de secuencias especificas•Técnicamente sencillo•No necesita material fresco•No necesita metafases, puede analizar nucleos en interfase •Detecta alteraciones pequeñas con cromosomas de mala calidad
Inconvenientes•Coste•Solo aporta información de la región estudiada, no sirve como técnica de screening
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NUMERICAS
ESTRUCTURALES
numéricas
estructurales
PRINCIPALES ALTERACIONES CROMOSOMICAS EN LAL
�50 cromosomas�Mas frecuente
�Pronostico favorable
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GENES INVOLUCRADOS EN ANOMALIAS CROMOSOMICAS
Pronostico desfavorable
Mas frecuentePronostico desfavorable
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LEUCEMIA AGUDAS LINFOBLASTICAS
CASI-HAPLOIDE *t (9;22)t (4;11)
DESFAVORABLE
HIPERPLOIDIA (47-50)CARIOTIPO NORMALdel (6q)t (1;19)t (8;14), t (2;8), t (8;22)
INTERMEDIO
HIPERPLOIDIA (>50)t (12;21) y del (12p) en niños
FAVORABLE
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UTILIDAD DE LA CITOGENETICA EN LA
� DIAGNOSTICO:1. La clasificacion de la OMS(2001) incluye algunas
anomalias geneticas
� PRONOSTICO:1. Asociacion emtre anomalias citogeneticas y grupos
pronosticos
� TRATAMIENTO:1. Algunas anomalías genéticas condicionan el tratamiento
LMA con t (15;17) ATRALAL con t(9;22) GLIVEC
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BIOLOGIA MOLECULAR
NUEVAS MUTACIONES
INTERMEDIAALTO++SECUENCIACION
CUANTIFICACION
EXPRESION
TRASLOCACION
MUTACION PUNTUAL
ALTAINTERMEDIO
GRAN AVANCE DIAGNOSTICO DE LEUCEMIAS
++++
PCR TIEMPO REAL
TRASLOCACIONES
MUTACION PUNTUAL
EXPRESION
ALTABAJO+++PCR convencional
TRASLOCACIONBAJABAJO-SOUTHERN BLOT
UsoDisponibilidadCosteAplicabilidad
clínica
Técnicas
Análisiscualitativos
Análisis cuantitativos
Investigación
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�TRATAMIENTO
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CONDUCTA ANTES DE QUIMIOTERAPIA
� Tratamientos de soporte: para minimizar efectos tóxicos inmediatos del tto.
-profilaxis y tratamiento de infecciones.
-corrección de desequilibrios metabólicos.
-prevención de síndrome de lisis tumoral (SLT) con hiperhidratacioncon solución glucosalina para aumentar la diuresis.
SLT
-prevención y tratamiento de la nefropatia urática con Rasburicasa ivde 3-7 días con suero salino fisiológico.
Solo excepcionalmente será necesario hemodiálisis.
-HIPERURICEMIA.
-HIPERPOTASEMIA.
-HIPERFOSFATEMIA
-HIPOCALCEMIA
![Page 22: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/22.jpg)
PRIMEROS TRATAMIENTOS
� Antes años 50: supervivencia 5 meses
� Años 50: Mercaptopurina, Ciclofosfamida, corticoides
� 60-70: Antraciclicos, Asparraginasa, Epipodofilotoxinas
� 70: Skipper: Poliquimioterapia
Se empezaron a aplicar protocolos de quimioterapia
� 80: Tratamientos cada vez mas individualizados (según el riesgo)
� Supervivencia: 70% a los 7 años
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SITUACION ACTUAL
� Y el 30%?????
� Elegir tratamiento estándar o supraintensivo
� Nuevos tratamientos para las recaídas
� Analizar factores de peor pronostico
Factores que conllevan alto riesgo: 10% No alcanzan RC tras 4-5 semanas de tto>25% blastos en MO +14< 1 Año>200000/ul leucocitosPortadores de t (9;22) t (4;11)EMR > 1% en MO después 5 semanas de tratamientoUso de tratamientos supraintensivos
![Page 24: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/24.jpg)
PROTOCOLOS DE QUIMIOTERAPIA
DOS PROTOCOLOS: PETHEMA Y SHOP.
� FASE DE INDUCCION:3 drogas que intentan conseguir una remisión completa (< 5% blastos en MO).
� -FASE DE CONSOLIDACION/INTENSIFICACION .� -FASE DE MANTENIMIENTO.� -QUIMIOTERAPIA INTRATECAL
RC: Recuperacion de la actividad medular con:-Hb > 10 g/dl.-granulocitos > 1.5 x 109/l.-plaquetas > 120 x 109/l.-MO NORMOCELULAR o < 5% blastos.-LCR sin blastos.-EMR< 1 % después del tratamiento de inducción.
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TRASPLANTE DE PRECURSORES HEMATOPOYETICOS
El TPH alogénico en LAL se reserva solo a pacientes de muy alto riesgo que:
1.Día +14 MO :> 10% blastos en el examen citomorfológico.
2.Día +35 MO :≥5 % blastos y/o EMR (punto 1)≥1% células de fenotipo leucémico.
3.Después 1 ciclo tratamiento CI si EMR (punto 2) >0.1%.
4.Después 2 ciclo tratamiento CI si EMR >0.01%.
Hasta encontrar donante sigue una pauta de tratamiento: REINDUCCION CON INTENSIFICACION
MANTENIMIENTO CON REFUERZO.
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TRASPLANTE DE CPH
1.Pasos para decidir TCPH:
• Selección del receptor.
• Estudio D-R compatibilidad HLA.
• Tipo de trasplante y fuente de CPH.
• Régimen de acondicionamiento
• Ejecucción del trasplante .
• Seguimiento paciente trasplantado.
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2.Tipos de trasplante
� Alogénico: HLA compatible familiar o no.
Eliminar hematíes y plasma (ABO) y linfocitos T ( EICH).
� Singénico: donante y receptor gemelos homocigotos.
� Autólogo o autotrasplante MO.
![Page 28: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/28.jpg)
3.Fuentes de CPH
.
Ventajas de SP como fuente de CPH:-Disminuye morbilidad y mortalidad.-Recuperación hematológica mas precoz.-Coste económico menor.
EN 90% T AUTOLOGOS
EN 30% T ALOGENICOS.
Medula óseaCordón umbilicalHígado fetal
Sangre periférica
![Page 29: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/29.jpg)
AFERESIS: Recolección de CPH
Administración de fármacos al donante que movilicen precursores a la circulación (G-CSF) 5 días
Pre-Aféresis: contaje CD34 en SP
Aféresis: Se usan separadores
celulares de flujo continuo
por selección positiva de CD34+
usando AC monoclonales contra Ag CD34+.
![Page 30: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/30.jpg)
LABORATORIO: CONTAJE CD34 POR CITOMETRIA
� Recuento rápido y reproducible de (CD34).
� Mínimo de células CD34+ que garantice repoblación de MO
� 2 x 106/Kg células CD34: injerto estable.
� Relación directa CD34+ infundidas y recuperación hematológica postrasplante.
![Page 31: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/31.jpg)
![Page 32: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/32.jpg)
PERSPECTIVAS FUTURAS:� Detectar resistencias celulares a citostáticos
� Características farmacológicas de citostáticos
� Disminuir toxicidad de transplantes de progenitores hematopoyéticos
� Disminuir toxicidad de quimioterápicos sin perder eficacia
� Nuevos tratamientos biológicos
![Page 33: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/33.jpg)
ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL
� Persistencia de un clon anormal de células en niveles bajos, durante o tras finalizar tratamiento de inducción, consolidación o mantenimiento.
� Estas células residuales deben tener un inmunofenotipo y/o citogenética igual al de las células al diagnostico.
� Esto ha llevado a un cambio en el concepto de remisión completa la cual se realiza en función de EMR y no de el numero de blastos en MO.
� La presencia de EMR postinducción es uno de los factores pronósticos mas importantes por su asociación a las recaídas.
![Page 34: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/34.jpg)
EMR. TECNICASEMR. TECNICAS
Sensibilidad: 1 - 5/102
• Morfología
• Citogenética convencional
Sensibilidad: 1/103
• FISH
Sensibilidad: 1/104 - 1/105
• PCR : Reordenamientos específicos
TCR/ IgH (LLA)
• CFM (Citometría de flujo multiparamétrica)
![Page 35: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/35.jpg)
EMR. CITOMETREMR. CITOMETRÍÍA DE FLUJOA DE FLUJOMULTIPARAMMULTIPARAMÉÉTRICATRICA
PASOS:
• En el momento del diagnóstico:
1. Inmunofenotipos Leucémicos (IFL)
2. Diseñar paneles de seguimiento específicos
• Durante el seguimiento:
3. Obtención de muestras adecuadas
4. Aplicación de los paneles de seguimiento
5. Adquisición: Live gate
![Page 36: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/36.jpg)
Características de la muestra
• Aspirado medular
• Debe ser representativo de médula ósea
aspirado enérgico
1,5 mL de muestra
evitar la dilución con sangre medular
• Procesar en < 24 horas
Evitar pérdidas selectivas de células
EMR. CFMEMR. CFM
![Page 37: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/37.jpg)
EMR. CMF
Inmunofenotipo leucémico al diagnóstico: CD19+CD34+CD10- y CD19+CD20-CD10-
![Page 38: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/38.jpg)
EMR .CMF
Post-Inducción : 0,14% de células CD19+CD13+ (histogramas 1 y 2).
Inmunofenotipo leucémico al diagnóstico: CD19+CD13+.
Post-Consolidación: EMR no detectable (histogramas 3 y 4).
![Page 39: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/39.jpg)
Normal
IFL: CD19+ CD20- CD10- (LAL Pro-B)
EMR: 1,43%
CD
19-P
C5
CD
20-P
C5
CD
20-P
C5
SSC CD10-FITC CD10-FITC
EMR. LLAEMR. LLA --B MLL+B MLL+
![Page 40: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/40.jpg)
PROTOCOLO LAL-RA
Inducción
DIA + 14MO >10% BLASTOS
MO < 10% BLASTOS
TCPH?
DIA + 35MO >5% Y EMR >1%
MO< 5% y EMR <1%
TCPH?
ConsolidaciónIntensificación1 ciclo
RC Y EMR< 0,01%
No RC O EMR>0,01%
ReinducciónMantenimiento
ConsolidaciónIntensificación2 ciclo
C+I
2 Ciclo
EMR<0,01%
EMR>0,01%
TCPH?
![Page 41: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/41.jpg)
Estudio EMR 2 objetivos:
1. Conocer velocidad de destrucción de la masa leucémica, factor pronostico fundamental para cambiar decisiones terapéuticas
2. Predecir cualquier recaída antes de la aparición de manifestaciones clínicas
![Page 42: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/42.jpg)
EMR en LLA. ConclusionesEMR en LLA. Conclusiones
• La persistencia de EMR durante el tratamiento tiene un valor pronóstico adverso independiente de otras variables
• Cantidad de EMR significativa:
Post-tratamiento de Inducción: ≥ 0,1%
Durante el resto del tratamiento: ≥ 0,01%
• Muy mal pronóstico:
Pacientes con EMR ≥ 1% post-Inducción
EMR persistente
• Muy buen pronóstico:
EMR- post-Inducción y post-Consolidación
EMR- precozmente (d. 19)
![Page 43: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/43.jpg)
EVOLUCION DE LA EMR
Día + 1
Día + 35….
![Page 44: Leucemias Agudas II](https://reader034.fdocuments.co/reader034/viewer/2022052304/55721237497959fc0b903ba3/html5/thumbnails/44.jpg)
MUCHAS GRACIAS