Los Anticuerpos Monoclonales

8/3/2019 Los Anticuerpos Monoclonales

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Los anticuerpos monoclonales

Brevsima historia.

En 1975 Georges Khler y el investigador argentino Csar Milstein

fusionaron por primera vez linfocitos con clulas de un mieloma y obtuvieron un

hibridoma: una lnea celular inmortal capaz de producir anticuerpos especficos

(monoclonales). Por este trabajo, que no patentaron, recibieron el premio Nobel

de Fisiologa y Medicina en 1984. La importancia de la produccin de

anticuerpos monoclonales no se evidenci hasta 1987 cuando estos anticuerpos

se produjeron en forma regular en ratones y fueron utilizados en el diagnstico

ya que son anticuerpos de pureza excepcional capaces de reconocer y unirse a

un antgeno especfico.

Los anticuerpos monoclonales se utilizan de rutina en muchos

procedimientos diagnsticos como por ejemplo:

mediciones de niveles de protenas y drogas presentes en el suero

tipificacin de tejidos y de sangre

identificacin de agentes infecciosos

tipificacin de leucemias y linfomas

identificacin de antgenos tumorales

identificacin de clulas especficas involucradas en la respuesta

inmune.

identificacin y cuantificacin de hormonas.

Cmo surgi la idea de obtener anticuerpos monoclonales?

Qu mejor respuesta que recurrir a las palabras del Dr. Milstein1:

Imaginemos una gran mezcla de sustancias qumicas entre las cuales

nos interesa slo una de ellas. Una sustancia entre millones y millones. Es como

una aguja en un pajar. Si tenemos un anticuerpo especfico contra una

sustancia, ese anticuerpo puede funcionar como un imn capaz de ignorar la

existencia del pajar y reconocer exclusivamente la aguja. A los ojos de unanticuerpo, el pajar no existe. Este simple concepto dio lugar a lo que se dio en


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llamar Inmunoensayos (ver captulo 9) que permitieron la medicin precisa de

hormonas y otras muchas sustancias no slo en medicina sino en qumica

analtica en general. Los inmunoensayos introdujeron los anticuerpos para su

uso como herramienta analtica de importancia fundamental en reas que nada

tenan que ver con la inmunologa. El problema era que para preparar unanticuerpo especfico era necesario utilizar agujas puras.

Algo ms sobre los anticuerpos

Vimos en el captulo 9 la estructura bsica de los anticuerpos, vamos a repasar

y agregar aqu, una serie de conocimientos sobre esas molculas mgicas. Las

inmunoglobulinas o anticuerpos o abreviados (Ab) son una mezcla heterognea

de protenas que presentan dos tipos de variaciones estructurales. Cambios

sutiles en la estructura de los sitios de combinacin al antgeno (regiones

variables) que determinan la especificidad de unin al antgeno

(reconocimiento de un antgeno entre varios parecidos) y diferencias

estructurales fuera de la regin de unin al antgeno, en las llamadas regiones

constantes que se relacionan con otras funciones del anticuerpo denominadas

efectoras. Estas actividades efectoras son por ejemplo: activar al complemento

o unirse a ms de un receptor conocido con el nombre de Fc que estn

presentes en las membranas de los monocitos y granulocitos (ver captulo 7).

Existen cinco clases de inmunoglobulinas que adems de las IgG incluyen a las

IgA, IgD, IgE, e IgM. Cada clase de anticuerpos se distinguen entre s por

algunas de sus funciones efectoras y constitucin estructural. No vamos a

complicar las explicaciones pero para dar una idea concreta diremos que el

primer tipo de anticuerpos que aparece en una persona infectada con un virus

es del tipo IgM y que recin pasado cierto tiempo aparecen las IgG que son ms

duraderas. Como las molculas son estructuralmente diferentes se pueden

distinguir fcilmente mediante procedimientos de rutina en el laboratorio clnico.

Esta situacin es vital para el diagnstico clnico. Volviendo al virus de la

rubola si una mujer embarazada tiene un contacto con un enfermo de rubola

es importante averiguar si ya est protegida o no. Si se le detectan anticuerpos

IgM se trata de una infeccin reciente y hay que preocuparse por el porvenir del

beb ya que el virus de rubola es teratognico (puede producir malformaciones

en el embrin). Si la mujer tiene anticuerpos IgG la infeccin fue anterior y no

hay de qu preocuparse.

Modo de obtencin de los anticuerpos monoclonales.


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Problemas que hubo que resolver:

Pasaje de la heterogeneidad a la homogeneidad o del anticuerpo policlonal

al anticuerpo monoclonal.

Mientras algo de la heterogeneidad de los anticuerpos deriva de la

existencia de clases y subclases de Ig lo ms importante radica en la naturaleza

polimrfica de sus regiones variables. Se han hecho estimaciones del nmero

de anticuerpos diferentes que pueden producir las clulas B del organismo y se

llega al fantstico nmero de ms de 10 millones.

En resumen: la respuesta del sistema inmune a cualquier antgeno por

ms simple que sea ste, es una respuesta policlonal. Lo que quiere decir que el

sistema fabrica anticuerpos contra un rango amplio de estructuras presentes en

el antgeno que involucran tanto a la regin de unin al antgeno como a las

zonas efectoras. Por otro lado, MacFarland Burnet (premio Nobel 1960) postul

la teora clonal de la generacin de anticuerpos es decir la generacin de

molculas idnticas en su estructura y en su capacidad de reconocer a un

antgeno (qu alivio!, gracias a Dolly todos saben qu es un clon).

Cada clula plasmtica B (clon B) fabrica un solo tipo de anticuerpo.

Este hecho vino en ayuda de Milstein y Khler que pensaron que si aislaban

clones de clulas B y las cultivaban en placas de plstico de cubetas mltiples,

el anticuerpo que produciran las clulas sera monoclonal. Pero... haba un gran

inconveniente, las clulas B mueren a los pocos das de ser cultivadas in-vitro.

Entonces, se les ocurri que si las fusionaban con una clula con potencial de

inmortalidad, los hbridos de ambas clulas podran fabricar anticuerpos

monoclonales casi indefinidamente. Efectivamente fue as, obtuvieron

hibridomas la clave para producir anticuerpos monoclonales.

Fusin celular

La fusin celular es un procedimiento que permite que dos clulas se

fusionen entre s al poner en contacto sus membranas externas citoplasmticas.

En el esquema que sigue se muestra el caso de la fusin celular mediada por un

virus, pero tambin se puede producir la fusin por otros mtodos utilizando

algunos reactivos qumicos. A los efectos de entender el procedimiento vale

tanto un virus como una sustancia qumica. Como vemos hay dos clulas cuyos

diferentes ADN nucleares se pintaron en amarillo y rojo para diferenciarlos. La

fusin de las membranas permite la obtencin de una clula con dos ncleos.

Cuando se produce la mitosis algunas de las clulas hijas van a heredar los

cromosomas de ambos padres, estos son los hibridomas.


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Clulas de mieloma.

Una clula B, como cualquier clula del organismo, puede convertirse en

cancerosa, cuando esto ocurre la proliferacin de un cultivo de estas clulas in-

vitro se mantiene por perodos prolongados, casi para siempre, a menos que

alguna razn accidental lo impida. Khler y Milstein para salvar el escollo de la

vida efmera de las clulas B en cultivo tuvieron la idea de fusionarlas con

clulas de un mieloma. De este modo combinaron el potencial de crecimiento

ilimitado con la especificidad de un anticuerpo producido por clulas normales B

presentes en el bazo de un ratn inmunizado. Esta tcnica se conoce con el

nombre de hibridizacin de clulas somticas que da lugar a un hibridoma.

El procedimiento se detalla en el dibujo siguiente. Se inmuniza un ratn

con un antgeno, al cabo de un tiempo se sacrifica, se extrae el bazo, se

separan las clulas y se cultivan in-vitro en placas de plstico u otro material

apropiado (circulitos rojos). Se dispone de un cultivo de clulas de un mieloma

(circulitos azules) y se procede a fusionar ambos cultivos.


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Anticuerpos monoclonales

Ahora hay que seleccionar los clones que sean hibridomas (1) y esto no

es tan simple como hacer pur de papas. Las clulas de mieloma que eligieron

los investigadores perdieron la capacidad para sintetizar la enzima hipoxantina-

guanina-fosforribosil-transferasa. (HGPRT). Por eso son HGPRT- (negativas

para HGPRT) (ver dibujo) y a raz de ello se cultivan en un medio especial

llamado HAT ( contiene hipoxantina/ aminopterina/ timidina) porque la enzima

de la que carecen las clulas sintetiza purinas utilizando como fuente precursora

a la hipoxantina. La ausencia de la enzima no perjudica el crecimiento de estas

clulas de mieloma ya que en ausencia de la enzima utilizan un camino

metablico alternativo para sintetizar purinas. Sin embargo, la presencia de

aminopterina en el medio HAT anula la posibilidad de sobrevida y hay una total

dependencia del compuesto (HGPRT).

Qu va a ocurrir despus de la fusin y cultivo en medio carente de

HGPRT? Las clulas de mieloma no fusionadas no pueden crecer porque

carecen de la enzima HGPRT, las clulas provenientes del bazo no pueden

multiplicar porque tienen una vida corta en cultivo. Slo van a persistir los

hibridomas porque tienen la enzima HGPRT heredadade las clulas del bazo y

las de mieloma aportan la inmortalidad.

En el paso 2 se prueban los sobrenadantes por la presencia de los

anticuerpos deseados. Debido a que los cultivos iniciales de hibridomas se

pudieron haber iniciado con ms de un clon es necesario clonar nuevamente los

cultivos productores de anticuerpos y subcultivarlos (paso 3). En el paso (4) se

testean los cultivos por la presencia de anticuerpos y dado que las clulas

productoras constituyen un clon los anticuerpos son monoclonales lo que

significa que cada cultivo secreta una sola clase de molcula de anticuerpo

dirigida a un solo determinante antgnico de un antgeno preseleccionado. Acontinuacin (paso 5) se realiza un escalamiento (cultivo mayor) de los


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hibridomas, que cultivados apropiadamente, se mantendrn para siempre ya sea

in-vitro con un rendimiento de 10-60 mg/ml o in-vivo en un ratn en el que la

concentracin de anticuerpo en el suero puede alcanzar valores de 1-10 mg /ml.

Sin embargo, hay que tener en cuenta que hay un movimiento mundial tendiente

a no utilizar animales en investigacin que combate activamente el uso deratones.

Tecnologa de la produccin de anticuerpos monoclonales (AbM) y

aplicaciones.

Como vimos el primer paso para producir AbM es inmunizar a un ratn

con un antgeno. Cuando el ratn comienza a producir anticuerpos contra el

antgeno se le remueve el bazo. Luego se fusionan las clulas del bazo con

clulas de una lnea de mieloma que no sea productora de anticuerpos y que se

mantenga en cultivo. La nueva lnea celular proveniente de la fusin que s

produce anticuerpos se inyecta en el peritoneo de otro ratn y el fluido asctico

que contiene los anticuerpos se cosecha.

Entre los factores que afectan la pureza del antgeno se encuentran la

edad, el sexo del ratn y la tolerancia inmunolgica de cada animal y otros

factores que afectan la produccin, por eso se estila utilizar adyuvantes para

estimular la respuesta inflamatoria.

Test de ELISA y aplicaciones.

Este ensayo biolgico descripto en el captulo 9 fue desarrollado por

Engvall y Perlman en 1971. En este ensayo con anticuerpos monoclonales stos

se pegan a la superficie de la placa plstica. La presencia de este anticuerpo se

detecta mediante el uso de un anticuerpo policlonal unido a un producto

coloreado, si el test es positivo para el monoclonal aparece el color. Los usos

comerciales de estos ELISA son de gran demanda as por ejemplo: el test o

prueba de embarazo consiste en un anticuerpo monoclonal preparado contra

una protena presente en la orina de mujeres embarazadas. A esto podemos

agregar tests para diabetes, para la presencia de antibiticos residuales en la

leche y otros.

Otras aplicaciones, no tan universales como las que se han descripto, es

utilizar los anticuerpos monoclonales como proyectiles dirigidos a los receptores

de la membrana de las clulas cancergenos, asociados a sustancias radiactivas

para matar las clulas.

Nos queda recorrer un solo tema, la humanizacin de los anticuerpos

monoclonales, como estos anticuerpos se producen en el ratn puede que


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administrados al hombre con fines teraputicos, su organismo los rechace, para

eso se ha aplicado ingeniera gentica y se han unido regiones de los genes que

codifican por la protena de mieloma humano con regiones de un anticuerpo de

ratn. Pero la explicacin detallada de estas tcnicas no las consideraremos

aqu. La tecnologa del ADN amerita la escritura de nuevos captulos.

Glosario:

adjuvante: una sustancia que ayuda a aumentar la respuesta antignica

produciendo una inflamacin que retiene al antgeno en el sitio de inoculacin

fluido asctico: lquido de caractersticas similares al suero que se acumula por

extravasacin en la cavidad peritoneal del abdomen.

hipoxantina: derivado natural de una purina raramente se la puede encontrar

formando parte de la cadena de ADN.

mieloma: tumor de clulas B que se origina en la mdula sea.

purina: compuestos orgnicos aromticos heterocclicos que forman los cidos

nucleicos. En el ADN existen dos bases purnicas que son la adenina y la

guanina.

secretar: segregar.

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