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CONCEPTO DE ESTRÉS TRADICIONAL YMODERNO

El concepto de estrés ha adquiridoconsiderable importancia en medicinahumana ya que cada vez es mayor elnúmero de personas que experimentaproblemas, incluidos los de tiporeproductivo. En medicina veterinariaexiste también una preocupacióncreciente (que es compartida por lapoblación en general) por el bienestaranimal que se ha traducido en labúsqueda de estrategias paracontrarrestar los efectos negativos delestrés, tanto en animales domésticos ensistemas de producción, como en faunasilvestre mantenida en cautividad.

No existe un consenso universal en ladefinición de estrés ni tampoco en lasvariables que puedan medirlo de unaforma objetiva. Frecuentemente sedefine como factores estresantes a

todos aquellos que producen unaalteración en la homeostasis. Lacorrespondiente respuesta de defensafrente a esta agresión se conoce comomecanismo de respuesta frente al estrés.Hans Seyle describió la respuestaorgánica común a todos los factores quecausan estrés como un síndrome generalde adaptación en el que se produce unarespuesta primaria o de alerta a travésde la activación del eje simpático-adrenomedular con la liberación decatecolaminas (Ferin 2006).Posteriomente, se produciría unarespuesta secundaria, de resistencia,que incluye la activación del ejehipotálamo-hipofisiario-adrenal y laliberación de corticosteroides de lacorteza adrenal. Aunque algunos de losaspectos de la teoría acuñada por Seylesiguen en vigor en la actualidad, elconcepto de estrés ha ido evolucionando(para más información, ver McEwen yWingfield 2003; Ferin 2006) y

actualmente se acepta que la respuestaorgánica es específica para cada factor yque la respuesta de adaptación al estrésnecesita de la participación ycoordinación de vías neuroendocrinascentrales y periféricas (Ferin 2006). Encondiciones prolongadas de estrés,funciones no esenciales como lareproducción pueden verse alteradas oinhibidas a favor de la supervivencia.

NIVELES EN LOS QUE LA REPRODUCCIÓNPUEDE VERSE AFECTADA POR LOSGLUCOCORTICOIDES

En general, está ampliamente aceptadoque la reproducción se ve negativamenteafectada por los efectos del estréscrónico, pero los efectos que el estrésagudo, o agudo repetitivo, podrían teneren la reproducción aún no están bienesclarecidos (Tilbrook et al. 2000). Loscorticosteroides, la hormona ACTH y elestrés pueden tener efectos inhibitorios

LOS GLUCOCORTICOIDES Y LA REPRODUCCIÓN FEMENINAGlucocorticoids and female reproduction

Raquel González, Montserrat Gomendio y Eduardo R. S. Roldan* Grupo de Ecología y Biología de la Reproducción, Museo Nacional de CienciasNaturales (CSIC), c/José Gutiérrez Abascal 2, 28006 Madrid, Spain. http://www.gebir.csic.es Correspondencia: E.R.S. Roldan,roldane@mncn.csic.es

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RESUMEN

Los glucocorticoides ejercen multitud de funciones en el organismo para mantener la homeostasis, pero en condiciones deestrés, puede producirse la secreción de elevadas cantidades de éstos. Está ampliamente aceptado que los efectos del estréspueden tener consecuencias negativas en la reproducción. Esta acción negativa está mediada principalmente a través de laalteración del eje hipotálamo-hipofisiario-adrenal, aunque existen evidencias que indican que los glucocorticoides tienentambién un efecto directo sobre la esteroidogénesis y la oogénesis. Las acciones encaminadas a reducir los efectos negativosdel estrés durante la aplicación de técnicas de reproducción asistida pueden favorecer el éxito de estas biotecnologías.

Palabras clave: estrés, glucocorticoides, reproducción

SUMMARY

Glucocorticoids exert their actions throughout the body to maintain homeostasis, but in stressful conditions, they can besecreted in high amounts. It is generally accepted that stress can negatively influence reproduction. This deleterious actionis mediated mainly through the alteration of hyphotalamus-pituitary-adrenal axis. However, evidence suggests thatglucocorticoids also have direct effects on steroidogenesis and oogenesis. Actions to reduce the negative effects of stressduring the use of assisted reproductive technologies may enhance the outcome of these techniques.

Key words: stress, glucocorticoids, reproduction

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Raquel González et al. Los Glucocorticoides y la reproducción femenina.

o, incluso, facilitatorios en lareproducción (Fig. 1) (Brann y Mahesh1991; Sapolsky et al. 2000; Tilbrook etal. 2000). La reproducción femenina esmás sensible a las alteracionesprovocadas por el estrés que lamasculina, debido a la sincronizaciónque debe existir entre la secreciónhormonal y los cambios morfológicos atodos los niveles del eje hipotálamo-hipofisiario-ovario y útero.

Existe abundante información que indicaque los glucocorticoides afectan al ejehipotálamo-hipofisiario (Breen y Karsch2006; Ferin 2006; Matteri et al. 2000;Vermeulen 2000). La mayoría de losfactores que causan estrés inhiben lapulsatilidad tónica de la secreción de LHcomo resultado de la inhibición delgenerador de pulsos de GnRH o porcambios en la sensibilidad de las célulasgonadotropas a la estimulación por laGnRH (Ferin 2006). Las alteracionesfrecuentemente observadas son laprolongación de la fase folicular, una faselútea inadecuada y un pico preovulatoriode LH prematuro (Ferin 2006). Cuando lascausas del estrés se cronifican oinstauran pueden desarrollarse estadosde hipogonadismo. En la mujer, el estréspsicogénico es el factor etiológico de laamenorrea funcional hipotalámicacrónica, caracterizada por la supresióndel ciclo menstrual e infertilidad yregresión del ovario a un estado similaral anterior a la pubertad. Esta amenorreafuncional hipotalámica está asociada auna secreción de cortisol elevada encomparación a mujeres con menstruaciónnormal u otras causas de anovulación(Berga et al. 1997).

Sin embargo, la función gonadal podríaverse afectada también de forma directaa nivel del ovario, tanto en laesteroidogénesis como en la oogénesis.El ovario es susceptible a la accióndirecta de los glucocorticoides; suacción está mediada por la presencia dereceptores para glucocorticoides en lascélulas ováricas (Schreiber et al. 1982; Tetsuka et al. 1999). Esta acción de los glucocorticoides en elovario se encuentra modulada por laactividad de las 11b-hidroxiesteroide-deshidrogenasas (11b-HSD). Hay dosisoenzimas que regulan la acciónfisiológica de los glucocorticoidescatalizando la interconversión del

cortisol/corticosterona (biológicamenteactivos) a sus respectivos metabolitos inertes (cortisona/11-dehidrocorticosterona). La isozima 11b-HSD 1 actúa predominantemente comouna reductasa para incrementar laconcentración local del cortisol, mientrasque la 11b-HSD 2 actúa exclusivamentecomo una deshidrogenasa con elevadaafinidad inactivando el cortisol (revisiónen Michael et al. 2003).

El cortisol no se sintetiza de novo en elovario (Omura y Morohashi, 1995) sinoque se transporta desde las glándulasadrenales por la circulación sanguínea.La mayor parte del cortisol se transportaunido a proteínas plasmáticas y sólo una pequeña porción es libre ybiológicamente activa. El cortisol se uneprincipalmente a la proteína de unión acortisol (CBP) o transcortina y con bajaafinidad a la albúmina y a la proteína deunión a hormonas sexuales (SHBG)(Andersen 2002; Pugeat et al. 1981). Losniveles de cortisol libre en el fluidofolicular son más elevados que enplasma (Andersen y Hornnes 1994;Harlow et al. 1997). Este incrementopodría deberse al desplazamiento delcortisol de la proteína transportadora,transcortina, por parte de las altasconcentraciones de progesterona y 17-a-OH-progesterona presentes en el fluido folicular de folículospreovulatorios (Andersen 2002).

RELACIÓN ENTRE EL METABOLISMO DE LOSGLUCOCORTICOIDES Y LA CONCEPCIÓN ENCICLOS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

En la especie humana podría existir unarelación entre el metabolismo delcortisol y la probabilidad de concebir enciclos de fecundación asistida (Michael2003). La tasa cortisol:cortisona reflejala actividad enzimática de las 11b-HSDsmodulando la interconversión de estosglucocorticoides y la concentraciónlocal de los mismos. Varios estudioshan encontrado una asociación entreuna tasa elevada de cortisol:cortisonaintrafolicular (consistente con una bajaactividad ovárica de 11b-HSD) y unamayor probabilidad de éxito en losprotocolos de reproducción asistida(Keay et al. 2002; Lewicka et al. 2003;Thurston et al. 2003). Otros estudios nohan encontrado una relación entre laconcentración en el fluido folicular de

cortisol, cortisona o la proporción entreambos y el potencial de implantaciónde los embriones derivados de lostratamientos de fecundación asistida(Andersen et al. 1999). Sin embargo, en la especie porcina las enzimas 11b-HSDs actúan en el oocito y en lascélulas del cúmulo inactivando losglucocorticoides, mecanismo quepodría ser importante para limitarposibles efectos negativos durante lamaduración del oocitos (Webb yMichael, 2006). Un estudio reciente hademostrado que la inactivación delcortisol por parte de las 11b-HSDs enlas células de la granulosa en el cerdoincrementa a medida que el folículo sedesarrolla y esta inactivación delcortisol está reducida de formasignificativa en los quistes folicularesováricos, implicando al cortisol en elcrecimiento folicular y en el desarrollode quistes (Sunak et al. 2007).

El éxito de los tratamientos dereproducción asistida puede verseafectado por el estrés asociado a laaplicación de estas técnicas. En laespecie humana la fecundación in vitro(FIV) o inyección intracitoplasmáticade espermatozoides (ICSI) sontécnicas que generan ansiedad y susresultados pueden verse afectados.Así, se ha observado que los niveles deadrenalina en el momento de larecuperación de oocitos y lasconcentraciones de adrenalina ynoradrenalina en el momento de latransferencia de embriones fueronmás bajos en mujeres en los que elciclo de FIV/ICSI fue exitoso que en lasque no lo fue (Smeenk et al. 2005). Seha asociado la vulnerabilidad al estréscon la FIV y transferencia deembriones, de tal forma que lasmujeres que se someten atratamientos de FIV y que presentanuna mayor frecuencia cardiaca ypresión arterial en respuesta al estrés,tienen un menor número de oocitosfecundables en comparación a lasmujeres con respuestas menosexacerbadas (Facchinetti et al. 1997).Se ha observado igualmente en ciclosnaturales, que el “distress”psicológico puede ser consideradocomo un factor de riesgo en el éxito dela concepción en mujeres con ciclosmenstruales prolongados (Hjollund etal. 1999).

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EFECTOS DIRECTOS DE LOS GLUCORTICOIDESEN LA ESTEROIDOGÉNESIS

La esteroidogénesis ovárica puede verseafectada por los glucocorticoides, cuyoefecto podría estar mediado por laalteración de la actividad de las enzimasque participan en su biosíntesis (Adashiet al. 1981; Schoonmaker et al. 1983).Estudios in vitro han mostrado que ladexametasona puede alterar laesteroidogénesis mediante la inhibiciónde la secreción de la LH (Huang y Li2001) y que el cortisol inhibe la síntesisde pregnenolona estimulada por la LH(Michael et al. 1993). Ben-Rafael et al.(1988) encontraron un aumento en laproducción de progesterona y estradiolpor parte de las células de la granulosa,estimulada por el cortisol, pero a dosissuprafisiológicas.

EFECTOS DIRECTOS DE LOSGLUCOCORTICOIDES EN LA OOGÉNESIS

No se ha definido cuál es el papel delcortisol en el fluido folicular. Existedurante el pico de LH un incremento delos niveles de cortisol total y libre en elfolículo (Andersen y Hornnes 1994;Harlow et al. 1997). Algunos estudiossugieren que el cortisol podría ejercerfunciones en el desarrollo folicular ymaduración del oocito (Fateh et al.1989; Harlow et al. 1997) o que podríaestar implicado en la respuesta anti-inflamatoria tras la ovulación (Andersen2002). En mujeres a las que se aplicarontratamientos de estimulación ováricacon hormonas se encontraron niveles decortisol más bajos en el fluido folicularde folículos que contenían oocitosinmaduros que en folículos con oocitosmaduros (Fateh et al. 1989). De igualforma, la concentración de cortisol fuesignificativamente superior en losfluidos foliculares de folículos quecontenían oocitos maduros que no sefecundaron que oocitos maduros que sefecundaron y dividieron (Fateh et al.1989).

Podrían existir diferencias especie-específicas en lo que se refiere al efectodirecto de los glucocorticoides y lamaduración del oocito. En peces elcortisol parece estimular la maduracióndel oocito (Greeley et al. 1986). Estudiosrealizados en mamíferos sobre lainfluencia de los glucocorticoides en la

oogénesis son contradictorios. Así, losestudios realizados in vitro en oocitos decerdo han mostrado que la maduración seve inhibida en forma tiempo- y dosis-dependiente (en un rango de 0.1-10μg/ml) cuando los oocitos se exponen a la dexametasona o al cortisol (Yang et al.1999). Sin embargo, la capacidad de los oocitos madurados in vitro de serfecundados no se vio afectada por su exposición previa a la dexametasona(Yang et al. 1999). Este efecto inhibitoriono se produjo cuando se empleó el antagonista de receptores deglucocorticoides RU-486, lo que podríaimplicar al receptor de losglucocorticoides en procesos de reinicio ymaduración del oocito (Yang et al. 1999).

Por otro lado, estudios realizados enratón no mostraron efecto inhibitorio delos glucocorticoides (dexametasona, 1-20 μg/ml y cortisol, 0.1-10 μg/ml) en lamaduración de oocitos in vitro tanto enmaduración espontánea como en lamaduración inducida por FSH enpresencia de hipoxantina (Andersen2003).

El posible mecanismo de acción de losglucocorticoides sobre el oocito no seconoce. El efecto inhibitorio de losglucocorticoides encontrado en elestudio de Yang et al. (1999), ha sidoparcialmente atribuido a la reducidacantidad del complejo p34cdc2-ciclinaB1 (MPF, factor promotor de la meiosis)(Chen et al. 2000), complejo clave en laregulación del ciclo celular en el oocito(Abrieu et al. 2001).

En un estudio reciente en ratón se haevaluado el efecto de la dexametasonaen un bioensayo a nivel folicular,evaluando la foliculogénesis, laproducción de esteroides, la oogénesisy la calidad del oocito. Este trabajoreveló una ausencia de efecto de ladexametasona, cuando se empleó aconcentraciones de hasta 40 μg/ml, enla foliculogénesis y oogénesis. Cuandose empleó una concentración de 80μg/ml la dexametasona impidió ladiferenciación folicular y maduracióndel oocito (Fig. 2). La esteroidogénesisse vio afectada a partir de unaconcentración de 5 μg/ml y eldesarrollo embrionario temprano apartir de 10 μg/ml (Fig. 3) (Van Merriset al. 2007).

Estos estudios sobre el papel directo delos glucocorticoides en la oogénesis hanmostrado que el efecto negativopotencial de los glucocorticoides seobserva a dosis relativamente elevadasfuera del rango fisiológico, al menos invitro, por lo que es probable que esteefecto sea más farmacológico quefisiológico. Sin embargo, es necesarioevaluar el efecto directo de losglucocorticoides sobre la oogénesis invivo. Además, en casos de perturbacióndel eje hipotálamo-hipófisis-adrenalque conlleven una producción elevadade glucocorticoides, se pueden producirdisrupciones en el ciclo reproductivo y lafunción ovárica, alterándose elambiente folicular en el que el oocitomadura. Si el ambiente folicular no esadecuado, la competencia del oocitopuede verse afectada negativamenterepercutiendo en su capacidad posteriorpara generar embriones de calidad.

ESTRÉS Y REPRODUCCIÓN ASISTIDA ENANIMALES SILVESTRES EN PELIGRO DEEXTINCIÓN

En los últimos años se ha producido unaumento en la preocupación por elbienestar animal y por los efectos que lasprácticas de manejo tienen en losanimales domésticos e igualmente porlas condiciones en las que se mantieneny manejan a los animales silvestres encautividad. El estrés de manejo ymiopatía de captura son consecuenciasimportantes y frecuentes en animalessalvajes. Puesto que las situacionesestresantes podrían alterar el correctofuncionamiento de cada componente deleje hipotálamo-hipófisis-ovario, lareproducción puede verse afectada (verDobson y Smith 2000; Dobson et al.2001).

La reproducción natural de animalessalvajes en cautividad se encuentralimitada y el estrés está consideradocomo uno de los factores que contribuyena esta reducida reproducción (Hutchingset al. 1996; Zhang et al. 2004; Swaisgoodet al., 2006).

Las tecnologías reproductivas tienen ungran potencial en su posible aplicaciónen especies de fauna amenazada. Eléxito de las biotecnologíasreproductivas es aún muy limitado enestas especies (Comizzoli et al. 2000;

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Pope 2000; Pukazhenthi and Wildt 2004)por numerosas causas entre las que sepodrían destacar el desconocimientogeneral de la fisiología reproductiva dela mayoría de los animales salvajes, elescaso número de animales disponiblespara la realización de estudios o ladeficiente calidad del material obtenidopara investigación. Además, el estrésderivado de las condiciones decautividad y la mayor susceptibilidad delas especies salvajes al manejo intensivosuponen un factor adicional quecontribuye al reducido éxito obtenido enestas especies.

El estrés inducido durante el manejoasociado a los tratamientos dereproducción asistida en muflones (Ovismusimon) podría contribuir a la reducidarespuesta ovárica obtenida tras lasuperovulación. Además, la altaincidencia de regresión lútea tempranaen hembras de muflón podría estartambién asociada en parte al estrésrepetitivo por la inmovilización de losanimales durante los tratamientos(Ledda et al. 1995). El estrés de manejose ha descrito como limitante en laaplicación de biotecnologíasreproductivas en bisonte americano(Bison bison) (Dorn 1995). En nuestrotrabajo de obtención de oocitosinmaduros mediante “ovum pick-up” porlaparotomía, para su posteriormaduración y fecundación in vitro en lagacela Mohor (Gazella dama mhorr), unade las hembras tuvo que ser retirada delexperimento por estrés de manejodurante las capturas repetidas para laadministración de FSH. Además, larespuesta general de las hembras degacela al tratamiento de superovulacióncon FSH fue en general reducida(Berlinguer et al. 2008). El efecto delestrés asociado a las capturas repetidasdurante el tratamiento hormonal, podríaser una causa que haya contribuido enparte a la limitada respuesta a laestimulación folicular.

El hecho de que el estrés pueda tenerefectos deletéreos en la reproducciónsubrayan la importancia de evitarlo, o almenos minimizarlo en todo lo posible,bien sea para facilitar la reproducciónnatural o para aumentar lasposibilidades de éxito en las ocasionesen que se requiera la aplicación debiotecnologías reproductivas.

La aplicación de tranquilizantes durantelos citados procedimientos podría serútil en la reducción del estrés de manejo,captura y contención en estas especies.Fernández-Arias et al. (2000) describióque el estrés de manejo durante lostratamientos asociados con protocolosde superovulación en cabra montés(Capra pyrenaica) puede conllevar unfallo completo en la tasa defecundación. Estos autores encontraronque el tratamiento con tranquilizantesde acción prolongada permitió lasuperovulación de estos animales y laobtención de embriones con capacidadde desarrollo posterior (Fernández-Ariaset al. 2000). En un estudio en muflones,la administración de decanoato deflufenacina permitió una mejora en larespuesta folicular tras lasuperovulación hormonal, además defacilitar la manipulación de los animales(Ptak et al. 2002). En un estudioreciente realizado por nosotros engacela Mohor el uso de enantato deperfenacina durante la superovulacióncon FSH nos permitió mejorar lascondiciones de manejo ya que losanimales pudieron ser capturados amano por los cuidadores y las hembrasse mantuvieron más tranquilas haciendoque su manejo fuera más fácil y seguro.Además, en las hembras tratadas con eltranquilizante, el cortisol plasmáticopermaneció a niveles inferiores respectoa los controles durante los días demanejo más intenso (Fig. 4). Esimportante señalar que las tasas derecuperación, fecundación y división nosólo no se vieron negativamenteafectadas por la aplicación deltranquilizante de acción prolongada enel grupo de las gacelas donantesrespecto al grupo control, sino que elporcentaje medio de maduración de losoocitos fue significativamente superioren el grupo tratado y la tasa dedesarrollo embrionario fue ligeramentemayor en el grupo con tranquilizante, sibien las diferencias en este últimoparámetro no alcanzaron diferenciassignificativas probablemente porlimitaciones en el número de animalesdisponibles para este estudio (Gonzálezet al. 2008).

CONCLUSIONES

El estrés puede afectar el éxitoreproductivo a distintos niveles. Los

distintos factores que generan estrésafectan a la reproducción de formaindirecta a través de la reducción degonadotropinas actuando a través deleje hipotálamo-hipofisiario, perotambién pueden ejercer efectos directosa nivel del ovario alterando laesteroidogénesis y la oogénesis,pudiendo afectar finalmente a lacompetencia del oocito para suprogresión en la meiosis y durante eldesarrollo embrionario. La reducción delestrés asociado a los tratamientos dereproducción asistida tanto en medicinahumana como en veterinaria puedeconducir a una mejora en los resultadosobtenidos tras la aplicación debiotecnologías reproductivas.

AGRADECIMIENTOS

RG ha disfrutado de una beca delprograma I3P-CSIC. La financiación parael desarrollo de nuestra investigación haprovenido de los proyectos REN 2003-01587, CGL2006-13340/BOS y AccionesIntegradas (HI20030336) del Ministeriode Educación y Ciencia.

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Figura 1: Esquema general de los efectos inhibitorios y estimulatorios de los esteroides adrenales en la reproducción. Modificado de Braan yMahesh (1991).

Figura 2: Efecto de la dexametasona (DEX) en la maduración nuclear de oocitos de ratón: barra gris, presencia de corpúsculo polar; barrablanca, disolución de la vesícula germinal “germinal vesicle breakdown”; barra negra, vesícula germinal (GV). Los datos están representadosen porcentajes medios, n = 60. Los asteriscos marcan diferencias significativas entre grupos (**P < 0.01, ***P < 0.001). Modificado de Van Merriset al. (2007).

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Figura 3: Evaluación del efecto de la dexametasona (DEX) en la formación de blastocistos y eclosión el día 6 de cultivo in vitro. Barra blanca,blastocistos no eclosionados. Barra gris: blastocistos parcialmente eclosionados. Barra negra: blastocistos con eclosión completa. El diagramade barras representa el porcentaje medio de blastocistos, expresado como el número de blastocistos el día 6 de cultivo sobre el número deembriones de 2 células en el día 2 de cultivo; n = 60. La tasas medias de blastocistos señaladas con asteriscos representan diferencias estadísticassignificativas (*P < 0.05, ***P < 0.001). Modificado de Van Merris et al. (2007).

Figura 4: Niveles de cortisol plasmático en hembras de gacela Mohor (Gazella dama mhorr) durante la sincronización de celo y superovulacióna las que se administró un tranquilizante de acción prolongada (LAN) o permanecieron sin tratamiento (controles).La sincronización de celos se realizó mediante la aplicación de un dispositivo intravaginal de liberación controlada de hormonas (CIDR)(Controlled internal drug release; 9% progesterona; CHIH Plastic Moulding, Hamilton, Nueva Zelanda) durante 15 días. Día 0: inserción del CIDR; día 10: recambio del CIDR y administración de enantato de perfenacina en el grupo LAN; días 13 y 14:administración de FSH; día 15: “ovum pick-up”. Los resultados son medias ± E.S. Modificada de González et al. (2008).

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