Los transportadores del maíz dentro de los mecanismos de

respuesta en la interacción planta-microorganismo.

Los transportadores de sacarosa.

Dra. Sobeida Sánchez Nieto

Las plantas son un mosaico de tejidos autotrófos y heterótrofos

FOTOSINTÉTICO

Hojas maduras

Sistema circulatorio y vascular para transporte de nutrimentos

HUMANOS PLANTAS

Arterias O2 del corazón a los órganosVenas CO2 de los órganos al corazón

Xilema mueve agua y minerales de la raíz hacia arribaFloema mueve azúcares, aminoácidos en todas direcciones

Experimento que demuestra que el carbono fijado se distribuye en la planta desde las hojas hacia los tejidos no fotosintéticos

CH3COOH + NaH[14-C]CO3 CH3COONa + [14-C]CO2 + H2O

CH3COOH

NaH[14-C]CO3

Se revelo colocando una placa fotográfica sobre la superficie del tejido

El carbono fijado se distribuye en la planta

La marca se distribuyo en las hojas en donde se administró la marca y en los tallos, flores y raíces.

PERO NO en las hojas fuente ya que estas sintetizan su propio carbono

Excess of sucrose goes from photosynthetic cells (source) to the non photosynthetic tissues and/or is exudate from some sinks

1M

Wang et al., 2013, Front. Plant Sci.,doi: 10.3389/fpls.2013.00201

Áfidos para medir la

composición del floema

Síntesis de

sacarosa

Hidrólisis de la sacarosa

y/o recambio

Las plantas transportan sacarosa debido a:

1. Alta solubilidad1 g sacarosa/ml0.5 g glucosa/ml

2. Químicamente inerteazúcar no reductor

3. Ningún requerimiento energético para su hidrólisis

Glucosa Fructosa

La sacarosa y la familia de la rafinosa, son moléculas transportadas en el floema

El transporte de azúcares en las plantas involucra:

Modified from Truernit, 2001

Current Biology 11 (5), R169 - R171

Difusión1. Plasmodesmata

2. SWEET

Transporte activo1. Sacarosa/H+ y2. Hexose/H+

Plasmodesmata

SUT: ES UN TRANSPORTADOR DE SACAROSA, FUNCIÓN: CONCENTRA SAC EN LA CÉLULA, TIPO DE TRANSPORTADOR: ACTIVO SECUNDARIOSOLUTOS QUE TRANSPORTA: PROTÓN Y SACAROSA

Sauer, 2007; FEBS letters 581 (2), 2309–2317

Proteína con 12 hélices altamente hidrofóbicas, denominadas cruces transmembranales

Transporte activo para la acumulación de azúcares en la célula

++

+ ++ + +

Sut1 mutants have reduced growth of vegetative and reproductive tissues, accelerates senescence and accumulates sucrose at the leaves

Slewinski T L et al. J. Exp. Bot. 2009;60:881-892

ESPIGATejido reproductor masculino

HOJAS CONTROL

HOJAS DE LA MUTANTE EN SUT1

CONTROL MUTANTECONTROL MUTANTE

CONTROL MUTANTE

Tejido fuente

Célula del mesófilo

Célula del

parénquima

Célula

acompañante

La hoja acumula azúcares en forma de almidón debido a que carece del simportador sacarosa/H+.

El almidón se hizo visible mediante una tinción con lugol

Las hojas envejecen prematuramente, se tornan amarillas o café

control

- lugol + lugol

Modelo de como se encuentra la planta mutante sin SUT

SWEET: TRANSPORTADOR DE HEXOSAS Y/O SACAROSA, TIPO DE TRANSPORTADOR: DIFUSIONALDIRECCIÓN DEL TRANSPORTE: BIDIRECCIONALSOLUTOS QUE TRANSPORTA: SACAROSA, GLUCOSA, FRUCTOSA CON DIFERENTES AFINIDADES.

Proteína de 7 cruces transmembranales

Transporte difusional

• Membrana plasmática y vacuola en plantas

• Retículo endoplásmico en humanos

SWEET a diffusional bidirectional sugar transporter

Chen et al., 2010; Braun, 2012; Yuan y Wang, 2013

Entrada de azúcar a la célula Salida de azúcares de las células

Papel fisiológico de los SWEETs

Llenado del floema Chen et al., Science (2012).

Desarrollo del embriónChen et al., Plant Cell (2015).

Las mutantes acumulan

almidón en las hojas

La triple mutante sweet11,12 y 15 retrasa el desarrollo el embrión

Papel fisiológico de los SWEETs

Llenado de la semillaSosso et al., Nature Genet (2015).

Formación del néctarLin et al., Nature (2014).

Composición del néctar: Arabinose, glucose, galactose, fructose, sucrose,

pentose, rhamnose, raffinose, ribose, xylose

and mannitolLa mutante zmsweet4c reduce su acumulación de almidón en el endospermo

La mutante en atsweet9 no produce néctar

Papel fisiológico de los SWEETsExudación de

fotosintatos por la raízChen et al., Plant J (2010).

Root Exudates Regulate Soil Fungal Community Composition and

Diversity

SWEET2 es un transportador vacuolar. Las mutantes sweet2 línea 2 y sweet2 línea 3 aumentan la salida de azúcar a las raíces.

Lo que indica que SWEET2 normalmente introduce los azúcares a las vacuola y hace menos disponible a la célula estos por lo que la exportación de azúcares se reduce

Papel fisiológico de los SWEETsInteracción planta-

patógenoChong et al., J Exp Bot (2014).

Infección con B. cinerea Chen et al., 2010 y 2012

SWEET4 hace susceptible a la planta a la infección por B. cinerea, una planta mutante para este transportador le permite resistir la enfermedad

Varios microorganismos activan la expresión de los SWEETs en Arabidopsis

Para bien o para mal?

Control Infectados con Phytium

SWEET vacuolarDisminuye la cantidad de azúcares disponibles para el hongo.

Efectores TAL (Transcription activator-Like protein)

SWEETs de MPAumenta la salida de azúcares y la planta nutre al microorganismo

Hay SWEETs que aumentan su expresión cuando los patógenos se encuentran en contacto con la planta.

PARA BIEN DE LA PLANTAPARA MAL, HACKEANDO EL SISTEMA DE TRANSCRIPCIÓN DE LA PLANTA

Relación fuente-demanda

Los microorganismos actúan como tejido demanda

Respuestas múltiples DE LA PLANTA a la presencia de los patógenos:

A) De defensaB) Donador de azúcaresC) De muerte

Incrementar la productividad? y/o Reducir la enfermedad

Photo by Nicolle Rager Fuller, National Science Foundation

La relación entre los SWEETs y la susceptibilidad a patógenospodría ser aprovechada para desarrollar cultivos resistentes apatógenos.

CÓMO INFLUYEN LOS SWEETS EN LA FISIOLOGÍA DEL MAÍZ?

Diseño de oligonucleótidos a partir del análisis Bioinformático

Obtención del material biológico

Extracción de RNA por el método del Trizol

Producción de cDNA mediante la Reacción de transcriptasa reversa

(RT)

Amplificación de un fragmento de la secuencia del gen de interés por PCR

punto final

1. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE LOS SWEETs DE MAÍZ.1. Comprobar la expresión de los SWEETs en el maíz Chalqueño2. Determinar su expresión en condiciones diferentes a las reportadas

Análisis in silico

En maíz, 22 presuntos transportadores

tipo SWEET.

¿Cuáles se expresan preferencialmente

en los diferentes tejidos?

Árbol filogenético de SWEETs, se incluyeron a maíz y arroz

Familia de SWEETs se distribuyen en 4 clados

Aparentemente está distribución coincide con el azúcar que transportan

Clado I, homólogos a SWEET1 y 2, son transportadores de hexosas; SWEET2 está en el tonoplasto.

Clado II son SWEET3 al 8 varios son transportadores de hexosas.

Clado III se encuentran los SWEET 9-15 capaces de transportar sacarosa.

Clado IV contiene a los SWEETs 16 y 17 presentes en tonoplasto y transportan fructosa.

Análisis in silico

En maíz, 22 presuntos transportadores

tipo SWEET.

¿Cuáles se expresan preferencialmente

en los diferentes tejidos?

ZmSWEET12b

ZmSWEET2

ZmSWEET3b

ZmSWEET12a

ZmSWEET14b

Los que se expresan preferencialmente en raíces

DATOS OBTENIDOS DEL TRANSCRIPTOMA DE MAÍZ

ZmSWEET12b

Se identificaron los sitios en donde más se expresan la

familia de genes que codifica para los supuestos SWEETs

de maíz. Accession number

EnsemblePlantsAccession number

NCBISWEETnumber

Tissue localization(MaizeGDB)

GRMZM2G368827 NM_001155492.1 SWEET1 Cariópside, espiga

GRMZM2G144581 NM_001150167.1 SWEET2 Embrión

GRMZM5G872392 NM_001153137.1 SWEET3 Embrión

GRMZM2G137954 NM_001148118.1 SWEET4 Endospermo

GRMZM2G094955 NM_001139364.1 SWEET5 Endospermo

GRMZM2G000812 NM_001175008.1 SWEET6 Hoja de planta madura

GRMZM2G153358 NM_001154214.1 SWEET7 Hoja planta madura

GRMZM2G179679 NM_001196704.1 SWEET8 Hoja de planta madura

GRMZM2G021706 NM_001148182.1 SWEET9 Hojas

GRMZM2G168365 NM_001155556.1 SWEET10 Base de hojas y espiga

GRMZM2G157675 NM_001155539.1 SWEET11 Espiga

GRMZM2G416965 NM_001157247.1 SWEET12 Espiga

GRMZM2G324903 NM_001152631.1 SWEET13 Raíz primaria

GRMZM2G015976 NM_001137817.1 SWEET14 Raíz primaria

GRMZM2G133322 NM_001143456.1 SWEET15 Raíz primaria

GRMZM2G060974 DAA52821.1 SWEET16 Raíz primaria

GRMZM2G099609 AFW88409.1 SWEET17 Raíz primaria

GRMZM2G106462 DAA54392.1 SWEET18 Coleoptilo

GRMZM2G107597 DAA45288.1 SWEET19 Semilla

GRMZM2G173669 NM_001155615.1 SWEET20 Hojas

The SWEET numbers does not correspond to the analoguous numbering in Arabidopsis

Para la obtención de material vegetal se crecieron

plantas en diferentes etapas del desarrollo del maíz

Vegetativas (V) Reproductivas (R)

http://odells.typepad.com/blog/corn-growth-stages.html

Expresión de SWEETs en embrión, espigas y semillas inmaduras.

SWEETPM1. RT-PCR usando

oligonucleótidos específicos para amplificar cada SWEETsy el cDNA de cada tejido

2. Separación de los productos amplificados en un gel de agarosa al 2 % en presencia de bromuro de etidio.

3. Realizar la réplica biológicas

Gel representativo de 3 gel con

muestras biológicas distintas

Tissue Major expressed

ZmSWEET

Mature embryo 4b

Germinated embryo 11a, 14a

Coleptile 1b, 4a, 13a, 13b, 17

Embryo radicle 14b

Mature

leaves

Apex 1b, 13a, 13b

Middle 1b, 13a

Basis 1b, 13a, 13b

Roots 3b

Husk 1b, 4a, 17

Immature silk 11a, 6b, 6a

Mature silk 11a, 6b, 6a

Immature embryo 6b, 6a

Relative ZmSWEETs expression in maize tissues along the plant life cycle. The expression was obtained by RT-PCR. To mature, immature and germinated embryo, as well as silks, Zm18s expression was used as control. To all others tissues, 25s RNA band was used as control.

SWEETS EN HOJASBUSCANDO AL SWEET QUE SE

ENCARGA DEL LLENADO DEL FLOEMA EN MAÍZ

Cargado del floema

Delgado-Rubio, Nestor, 2017En Arabidopsis SWEET11 y 12 son importantes para el llenado del floema

Expresión de SWEETs en el desarrollo de las hojas del maíz.

Néstor E. Delgado Rubio

Base

Media

Punta

Los SWEET13 se presentan en todas las partes aéreas del maíz excepto en la hoja envolvente

ZmSWEETs expression throughout the circadian cycle. Upper side represents the most abundant ZmSWEETs transcripts found at different hours. Below RT-PCR for each SWEET was showed.

Pocos cambios en la expresión de los SWEETs a lo largo del día, excepto a las 14 h

Y LOS MICROORGANISMOS TIENEN EFECTO SOBRE LA EXPRESIÓN DE LOS SWEETS DE MAÍZ?

Los microorganismos pueden manipular la expresión de genes en la planta para su

beneficio

SWEET

Resistencia sistémica inducida

Antimicrobianos de la planta

F. verticillioidesT. asperellum

Se establece en raíces

De la Torre-Hernández et al., 2010

Micoparásito

Harman et al., 2004; Druzhinina et al., 2011

Productor de micotoxinas

Necrótrofo

Patógeno del maíz

Biótrofo y saprótrofo

Determinar el efecto que dos hongos con estilos de vida distintos provocan sobre la expresión de los

SWEETs

Exposición de las plantas a los hongos Cuantificación de ZmSWEET en hojas de plántulas infectadas

con F. verticillioides y/o T. asperellum

Relative ZmSWEETs expression levels on Zea mays aerial parts from 14 days old plants growth in greenhouse, the plants comes from seeds treated with A) F. verticilloides, B) Trichoderma at. Columns represents relative expression. The ZmSWEETs expression levels were normalizated based on the expression levels of ZM18s. Error bars indicated the SD of the mean derived from three replicates form two independent biological samples.

Fusarium MY3 low FB1 mycotoxinproducer reduces SWEET1b, 4a, 13a, 13b y 17 expression

Trichoderma induces low changes in expression, but significantly different

Expresión de SWEET13a en hojas de plántulas infectadas con F. verticillioides y/o T. asperellum

0

2

4

6

8

10

12

14

1 2 4 5

Re

lati

ve e

xpre

ssio

n

Dpi

Control

Control H2O

Control F. verticillioides

A

0

2

4

6

8

10

12

14

1 2 4 5

Re

lati

ve e

xpre

ssio

n

Dpi

ControlTrichodermaTrichoderma H2OTrichoderma F. verticillioides

B

Trichoderma asperellum y Fusarium verticillioidesinducen la expresión de ZmSWEET13a en las

hojas.

Carvente-García Roberto, 2014

Modelo propuesto (análisis bioinformáticode la secuencia de proteínas predicha)

Protein properties

Length 302 aa

MW (calc.) 33.0 kDa

IEP (calc.) 9.57

Amplificación de SWEET13a

ZmSWEET13a fue clonado usando las regiones UTR del gene

1 ATGGCTGGCA TGTCTCTGCA ACACCCCTGG GCGTTTGCTT TCGGTCTACT AGGTAACGTC

61 ATCTCCTTCA TGACCTTCCT GGCCCCGATA CCGACGTTCT ACCGCATCTA CAAGAGCAAG

121 TCGACGGAAG GCTTCCAGTC GGTTCCCTAC GTGGTTGCCC TGTTCAGCGC CATGCTGTGG

181 ATCTTCTACG CACTGATCAA GTCCAACGAG ACCTTCCTCA TCACCATCAA CGCCGCCGGC

241 TGCGTCATCG AGACCATCTA CGTCGTCATG TACTTCGTCT ACGCGCCCAA GAAAGCCAAG

301 CTGTTCACGG CCAAGATCAT GGTCCTCCTC AATGGCGGCG TCTTTGGGGT CATCCTCCTG

361 CTCACCCTTC TCCTCTTCAA GGGCAGTAAG CGCGTTGTGC TGCTTGGCTG GATCTGCGTC

421 GGCTTCTCCG TCAGTGTCTT CGTCGCGCCA CTCAGCATCA TGAGACGAGT GATCCAGACG

481 AAGAGCGTGG AGTACATGCC CTTCTCCCTC TCCCTCTCGC TCACCCTCAG CGCCGTCGTC

541 TGGTTCCTCT ACGGCCTCCT CATCAAGGAC AAATACGTCG CGCTTCCAAA CATCCTGGGG

601 TTCACCTTCG GCGTGGTCCA GATGGTGCTC TACGTGTTGT ACATGAACAA GACGCCGGTG

661 GCGGCGACTG CCGAGGGCAA GGATGCCGGC AAGCTTTCCT CAGCTGCAGA CGAGCACGTC

721 CTCGTCAACA TCGCCAAGCT CAGCCCAGCC CTCCCGGAGA GGAGCTCCGG GGTGCACCCA

781 GTCACCCAGA TGGCGGGCGT TCCTGTCAGG AGCTGCGCTG CTGAAGCAAC CGCGCCGGCG

841 ATGCTGCCCA ACAGGGACGT GGTCGACGTC TTCGTCAGCC GACACAGCCC CGCCGTCCAC

901 GTGGCATAG

10001500

750

2000

Células HEK293

transfectadas

Inmunodetección de SWEET13a con un anticuerpocontra el epítope V5.

Std Total Microsomal Total Microsomal

(kDa) Fraction Fraction Fraction Fraction

ZmSWEET13a se expresa en membranas

pcDNA/V5ZmSWEET13a

Carvente-García Roberto, 2014

HERRAMIENTAS PARA CARACTERIZAR EL TRANSPORTE DE SACAROSA

Cómo caracterizar al transportador SWEET13?

Transportadores de azúcares membranalesen plantas

++

+ ++ + +

Aislamiento de las membranas

1. Aislar vesículas de membrana

2. Ponerlas en contacto con el soluto a transportar marcado radiactivamente

3. Leer la marca incorporada en las vesículas.

56

Centrifugación diferencial

Caracterización de la actividad del transportador de sacarosa

• Medición del transporte de sacarosa mediante el método radiactivo.

pH 7.8

[14-C]SacarosaH+

MP

pH medio de ensayo

57

Proteínas que perciben solutos específicos

• Proteínas que perciben solutos flanqueadas por ambos lados (amino y carboxilo) por proteínas fluorescentes

Células dobles transformantes

• Para el sensor de azúcares y para la proteína transportadora

• Se mide el cambio en la fluorescencia

Se obtienen diferentes datos de los experimentos en células

• Párametros bioquímicos

Km, Vmax Especificidad Dirección

Análisis de la función del transportador de sacarosa de tomate (LeSUT1 y LeSUT2) en el sistema de levadura.

•SUT1 puede complementar la mutante de levadura, SUT1 es untransportador de sacarosa•SUT2 no complementa a la mutante, SUT2 no es un transportador desacarosa.

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LOS TRANSPORTADORES DE AZÚCARES

ZmSWEET13a Y ZmSWEET13b DE MAÍZ.

Nancy Hernández Chávez

Determinación de la actividad de transporte de azúcares

Ensayo de complementación en la levadura EBY4000VW para determinar actividad de transporte de

glucosa. Control (-) Levadura transformada con el vector vacío. Control (+) Levadura transformada con

AtSWEET1 transportador de glucosa de la membrana plasmática.

EBY4000VW, mutante que carece de los transportadores de hexosas

La mutante de levadura crece en medio sintético de URA (-) suplementado con

Maltosa 2%. Posteriormente se crece en medios con diferentes carbohidratos,

se hacen diluciones del cultivo y se colocan en la cuadricula y se observa el

crecimiento

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LOS TRANSPORTADORES DE AZÚCARES

ZmSWEET13a Y ZmSWEET13b DE MAÍZ.

Nancy Hernández Chávez

Ensayo de complementación en la levadura SEY6210 para determinar la actividad de transporte de

sacarosa. La mutante de levadura crece en en un medio sintético de URA (-) suplementado con Glucosa al

2%. Control (-) Levadura transformada con el vector vacío.

SEY6210 mutante que carece de las invertasas

Porque no crecieron las levaduras? A. Los SWEETs No transportan los azúcares?B. O la proteína no es de la MP?

CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LOS TRANSPORTADORES DE

AZÚCARES ZmSWEET13a Y ZmSWEET13b DE MAÍZ.

Nancy Hernández Chávez

Protoplastos de Arabidopsis thaliana transformados con ZmSWEET13a y 13b fusionados a

proteínas fluorescentes y observados bajo el microscopio confocal. Los organelos rojos son

cloroplastos, la zona amarilla corresponde a la fluorescencia de AtSWEET1 (b), la zona azul corresponde

a la fluorescencia ZmSWEET13a (c) y ZmSWEET13b (d), se observa que ambos SWEETs se localizan

en el interior de la célula.

c

a

b

d

Cual será su localización subcelular?

Control (-)

AtSWEET1-GFP

ZmSWEET13a

ZmSWEET13b

Campo claro Canal YFP o CFP Canal clorofila Merged

SWEETS DE RAÍCES

C B C B C B C B

Peso molecular (pb): 188 166 171 128

Efecto del biopriming en la expresión de los SWEET de maíz.

Raíces embrionarias

Raíces post-embrionariasZmSWEET

2 14b 12a 3b 12b

C B C B C B C B C B

Peso molecular (pb): 188 128 166 179 128

ZmSWEET

2 12a 12b 14b

Establecimiento de las condiciones óptimas para la qPCR

Eficiencia de la

amplificación:90-110%

Un solo pico de

amplificación

(Pfaffl, 2001)

Curvas de disociación de ZmSWEET12b.

1°

2°

3°

4°

5°

6°

7°

Ningún par de oligonucleótidos produjo un solo pico, por lo tanto no se obtuvieron los valores de expresión de este gen

El biopriming aumenta la expresión de diferentes SWEETs dependiendo de la edad de las raíces

SWEET de maíz 2 3b 12a 14b

Localización del homólogo en

ArabidopsisVacuola No determinado

Membrana

plasmática

Membrana

plasmática

predicho

Azúcar que transporta el

homólogo en ArabidopsisGlucosa Hexosas predicho

Sacarosa,

Glucosa, Fructosa

Sacarosa y

Glucosa predicho

Palacios-Vargas Itzel, 2017

2 3b 12a 14b

Experimentos en progreso: Determinación de los niveles de azúcares en los exudados de las raíces T.

asperellum. Clonación y caracterización de SWEET3b y 14b

Conclusiones

1. La expresión de los SWEET es diferencial, tejido y tiempo de desarrollo específico

2. El hongo T. asperellum aumenta la expresión de los transportadores de azúcares difusionales, SWEET, en las hojas solo cuando se encuentra F. verticillioides en la planta lo cual regula probablemente la disponibilidad de azúcares en la planta y le permite continuar su desarrollo a pesar de la presencia de ambos hongos.

3. El aumento en la expresión de los SWEET durante el biopriming con T. asperellum indica que la planta ajusta su transporte de azúcares para mantener su crecimiento y al hongo en las raíces

4. Tenemos las herramientas para caracterizar a transportadores de MP, pero aún nos falta desarrollarlas o mejorarlas para los de la vacuola

5. La localización subcelular es importante de determinar para conocer el flujo de los azúcares en la célula.

Dr. Arturo GuevaraInstituto de Biotecnología, Cuernavaca MorelosDr. José Luis Hernández MendozaInstituto de Ciencias Genómicas IPN, Tamaulipas.Dr. Javier Plasencia de la Parra, Dra. Marina Gavilanes Ruíz,Dra. Karina Durán (USAI-Microscopía confocal)M. en C. Manuela Nájera MartínezQ. Laurel Fabila Ibarra Facultad de Química, UNAMDra Sara L. Morales-Lázaro Dra. Tamara RosenbaumInstituto de Fisiología Celular

Colaboradores

M. en C. Paulina Aguilera Alvarado

M. en C. Fernando Guzmán Chávez

M. en C. Roberto Carvente García

M. en C. Montserrat López Coria

pQA Itzel Palacios Vargas

pQFB Mireya Flores Barrera

pQFB Néstor E. Delgado Rubio

pQFB Nancy Hernández Chávez

pQA Méndez Ramírez Moisés

pQA Muñoz Chapul Daniela

M. en C. Beatriz King Díaz

Facultad de

Química

Nestor Dany Pau

Moy Nancy Bety Mire Itzel Montse