Universidad Autnoma de Baja California Facultad de Ciencias Qumicas e Ingeniera

Manual de Prcticas de Laboratorio Biologa Molecular

Proyecto 1 Farmacogentica de la enzima NAcetiltransferasa 2 (NAT2) humanaLa farmacogentica tiene origen a finales de la dcada de 1950s, cuando se descubre que la imposibilidad de hidrolizar el relajante muscular succinilcolina por la enzima butirilcolinesterasa (una reaccin de fase I) tena un origen hereditario. Casi en la misma poca, se observ que una variacin gentica en una ruta metablica de degradacin de frmacos, N-acetilacin (reaccin de fase II), puede dar como resultado diferencias significativas en los tiempos de vida media y concentraciones de frmacos metabolizados por esa va. Recientemente, se ha introducido el trmino de farmacogenmica (ms amplio) para considerar adicionalmente otros aspectos, tales como la disposicin del frmaco, los blancos farmacolgicos y los efectos colaterales o adversos.

Antecedentes La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada, en la mayora de los casos, por Mycobacterium tuberculosis. A nivel mundial, esta enfermedad ha emergido como un problema de salud importante. En 2003, la OMS calcul una la incidencia de TB de 8.8 millones de casos (140 de cada 100 000); adems, estim que 1.7 millones de personas murieron a causa de la infeccin ese mismo ao. En Mxico, la TB se encuentra entre las primeras causas de mortalidad y morbilidad en la poblacin en general; mientras que, en Baja California este padecimiento se considera endmico, siendo de mayor incidencia en personas con una edad entre 35 y 64 aos. Los principales problemas relacionados a la TB son: (1) un diagnstico de laboratorio rpido y oportuno, (2) un tratamiento eficaz y lo ms seguro posible. Entre los frmacos anti-fmicos ms utilizados en el tratamiento de TB se encuentra la isoniazida (INH). Esta puede ser muy efectiva; sin embargo, con frecuencia ocasiona reacciones adversas al frmaco (RAF) durante el tratamiento, esto debido principalmente a su metabolismo, el cul tiene relacin directa con la dosis, duracin del tratamiento y el fenotipo acetilador del individuo.

N-acetiltransferasa 2 e isoniazida, Isoniazida puede ser teraputicamente inactivada mediante acetilacin in vivo. Casi todas las poblaciones o razas, sino es que todas, son polimrficas para acetilacin rpida o lenta. Se ha observado que individuos con fenotipo acetilador lento presentan un genotipo homocigoto para un alelo inactivador lento; mientras que individuos con fenotipo acetilador rpido pueden presentar genotipo homocigoto para alelos inactivadores rpidos o heterocigoto1. La enzima polimrfica responsable del fenotipo acetilador es la Nacetiltransferasa 2 (NAT2, EC 2.3.1.5). El fenotipo acetilador lento es el resultado de una disminucin o ausencia de la enzima NAT2 en el hgado2. En estudios clnicos se ha reportado hepatotoxicidad como RAF en individuos con fenotipo acetilador lento.1 2

Evans DAP, Manley KA, McKusick VA. Brit Med J 1960;2:485-91. Grant DM, Morike K, Eichelbaum M, Meyer UA. J Clin Invest 1990;85:968-72.

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LOCUS 2003 DEFINITION

AY331807

873 bp

DNA

linear

PRI 07-JUL-

Homo sapiens N-acetyltransferase 2 (arylamine N-acetyltransferase) (NAT2) gene, complete cds. Homo sapiens (human) Homo sapiens Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini; Catarrhini; Hominidae; Homo. FEATURES Location/Qualifiers source 1..873 /organism="Homo sapiens" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9606" gene 873 /gene="NAT2" mRNA 873 /gene="NAT2" /product="N-acetyltransferase 2 (arylamine N-acetyltransferase)" CDS 1..873 /gene="NAT2" /codon_start=1 /product="N-acetyltransferase 2 (arylamine N-acetyltransferase)" ORIGIN 1 atggacattg aagcatattt tgaaagaatt ggctataaga actctaggaa caaattggac 61 ttggaaacat taactgacat tcttgagcac cagatccggg ctgttccctt tgagaacctt 121 aacatgcatt gtgggcaagc catggagttg ggcttagagg ctatttttga tcacattgta 181 agaagaaacc ggggtgggtg gtgtctccag gtcaatcaac ttctgtactg ggctctgacc 241 acaatcggtt ttcagaccac aatgttagga gggtattttt acatccctcc agttaacaaa 301 tacagcactg gcatggttca ccttctcctg caggtgacca ttgacggcag gaattacatt 361 gtcgatgctg ggtctggaag ctcctcccag atgtggcagc ctctagaatt aatttctggg 421 aaggatcagc ctcaggtgcc ttgcattttc tgcttgacag aagagagagg aatctggtac 481 ctggaccaaa tcaggagaga gcagtatatt acaaacaaag aatttcttaa ttctcatctc 541 ctgccaaaga agaaacacca aaaaatatac ttatttacgc ttgaacctcg aacaattgaa 601 gattttgagt ctatgaatac atacctgcag acgtctccaa catcttcatt tataaccaca 661 tcattttgtt ccttgcagac cccagaaggg gtttactgtt tggtgggctt catcctcacc 721 tatagaaaat tcaattataa agacaataca gatctggtcg agtttaaaac tctcactgag 781 gaagaggttg aagaagtgct gaaaaatata tttaagattt ccttggggag aaatctcgtg 841 cccaaacctg gtgatggatc ccttactatt tag SOURCE ORGANISM

Figura 3. Secuencia nucleotdica codificante de la enzima NAT2 humana (NCBI GenBank AY331807). Adicionalmente, se muestran los nucletidos involucrados en 6 de los principales polimorfismos asociados al fenotipo acetilador lento.

Gentica Molecular, Los genes NAT1 y NAT2 humanos codifican para diferentes variantes enzimticas. NAT1, la cual es responsable de la N-acetilacin de ciertas arilaminas, no muestra variantes genticas; en tanto que la acetilacin rpida o lenta de agentes teraputicos y carcinognicos se debe a variantes en el locus NAT2. En un estudio con 7 individuos clasificados fenotpicamente como acetiladores homocigotos lentos o heterocigotos se observaron mutaciones puntuales en la regin codificante de dos variantes distintas de NAT2 3. Una de estas, mostr una transicin G>A en el nucletido 590 conduciendo a una sustitucin de Arg>Gln en el aminocido 197; donde la G mutada perteneca a un sitio de reconocimiento por la endonucleasa TaqI. La segunda variante, se caracteriz por presentar tres transiciones que daban origen a una mutacin silente y dos sustituciones de aminocidos: Ile>Thr en el aminocido 114 y Lys>Arg en el aminocido 268. En otro estudio se encontr que cuatro mutaciones (G191A, C481T, G590A y G857A) prevalecen casi por completo en todos los alelos acetiladores lentos de varias razas4. Variantes allicas Mediante secuenciacin de ADN, se ha demostrado la existencia de mutaciones puntuales (cambios de un solo nucletido) dentro de la regin codificante para NAT2, presentes en individuos con fenotipo acetilador lento. Algunas de stas son:3 4

Vatsis KP, Martell KJ, Weber WW. Proc Nat Acad Sci 1991;88:6333-7. Lin HJ, Han C-Y, Lin BK, Hardy S. Pharmacogenetics 1994;4:125-34.

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1

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Transicin G A en el nucletido 191 (G191A). Ocasiona un cambio de Arg Gln en la codificacin del aminocido 64 (R64Q)5. Esta puede ser detectada molecularmente ya que se pierde un sitio de reconocimiento por la endonucleasa HpaII. Transicin T C en el nucletido 341 (T341C). Ocasiona un cambio de Ile Thr en la codificacin del aminocido 114 (I114T)6. Esta no puede ser detectada molecularmente por tratamiento endonucleoltico. Transicin C T en el nucletido 481 (C481T). No ocasiona cambio en la codificacin del aminocido 161 [L161L]. Esta puede ser detectada molecularmente ya que se pierde un sitio de reconocimiento por la endonucleasa KpnI. Transicin G A en el nucletido 590 (G590A). Ocasiona un cambio de Arg Gln en la codificacin del aminocido 197 (R197Q)6. Esta puede ser detectada molecularmente ya que se pierde un sitio de reconocimiento por la endonucleasa TaqI. Transicin A G en el nucletido 803 (A803G). Ocasiona un cambio de Lys Arg en la codificacin del aminocido 268 (K268R)6. Esta puede ser detectada molecularmente ya que se gana un sitio de reconocimiento por la endonucleasa DdeI. Transicin G A en el nucletido 857 (G857A). Ocasiona un cambio de Gly Glu en la codificacin del aminocido 286 (G286E)4. Esta puede ser detectada molecularmente ya que se pierde un sitio de reconocimiento por la endonucleasa BamHI.

El estado de Baja California, Mxico, presenta un alto nivel de incidencia de tuberculosis. Adems, el hecho de ser un estado de frontera (con Estados Unidos de Norteamrica) contiene una poblacin en constante movimiento, lo que le confiere caractersticas genticas propias y nicas. Actualmente, poco se conoce a cerca de la prevalencia de los polimorfismos del gen nat2 en poblacin mexicana; aunado a la carencia de un mtodo simple para determinar el fenotipo acetilador de un individuo. De tal manera que, El fenotipo acetilador lento como factor de riesgo para la hepatitis inducida por frmacos sigue siendo un aspecto poco claro; debido tanto a la influencia de varios factores extrnsecos como a las discrepancias que puedan existir entre los mtodos utilizados para determinar dicho fenotipo. Actualmente, se ha centrado un especial inters en la genotipificacin de la nat2, la cual ha demostrado ser til en la valoracin del fenotipo acetilador. De tal manera que, la determinacin del genotipo de nat2 puede ser una herramienta til para monitorear y optimizar las dosis teraputicas de los frmacos metabolizados por esta enzima.

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Bell DA, Taylor JA, Butler MA, et al. Carcinogenesis 1993;14:1689-92.

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Estrategia metodolgica 1. Aislamiento y purificacin de ADN genmico El ADN genmico (ADNg) ser aislado y purificado a partir de sangre perifrica (leucocitos) utilizando el estuche comercial QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN) (Anexo 1).

2. Identificacin de los SNP C481T y G857A Amplificacin de un fragmento de 547 pb del gen NAT2 humano mediante PCR (NAT2-547). Se preparar una reaccin de volumen final de 30 L contendr: 30-60 ng de ADNg, 30 pmoles de cada iniciador (NAT2P1: 5- GCT GGG TCT GGA AGC TCC TC -3; y NAT2P2: 5- TTG GGT GAT ACA TAC ACA AGG G -3; los cules hibridan en las regiones especficas del gen NAT2 humano [GenBank AY331807]), 0.2 mM de desoxirribonucletidos trifosfatados, y 0.75-1.25 U de Taq ADN polimerasa.Mezcla de reaccin de PCR para amplificar un fragmento de 547 pb del gen NAT2 y detectar el polimorfismo SNP C481T, G590A, A803G y G857A. Componente 10 M NAT2P1 10 M NAT2P2 Taq 2X Master Mix (New England Biolabs) ADN genmico Vol (L) 5 5 12.5 2.5

Termociclado. Un ciclo de desnaturalizacin inicial de 2 minutos a 94C; seguido de 35 ciclos continuos de desnaturalizacin (94C durante 10 seg), hibridacin (55C durante 10 seg), y elongacin (72C durante 20 seg); y una elongacin final de 7 min a 72C.

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3. Verificacin del producto de amplificacin mediante electroforesis en gel de agarosa. El producto de PCR ser analizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, teido con bromuro de etidio. La talla molecular de cada fragmento ser calculada mediante la comparacin con marcadores de peso molecular de talla conocida, disponibles comercialmente.

Materiales Equipo Microondas Equipo de electroforesis (cubeta, soporte, peine, fuente de alimentacin). Transiluminador de luz UV. Equipo de tratamiento de imagen Reactivos Amortiguador de electroforesis TAE (Tris-acetato). Agarosa. Bromuro de etidio (Muy peligroso usar guantes!!!!). Amortiguador de carga (glicerol 30%, azul de bromo-fenol 0.25%, azul de xilen-cianol 0.25%). Marcadores de peso molecular.

Procedimiento Preparacin del gel de agarosa 1. Preparar el siguiente sistema: colocar las barreras y peine que servir para formar los pocillos del gel en la charola de vaciado de la cmara. 2. Colocar en el congelador por algunos minutos. 3. Se vierten en un matraz erlenmeyer con tapa de 2 g de agarosa (2%) y 100 mL del agua destilada 4. Se funde la solucin de agarosa en un microondas o placa calefactora. (sugerencia 3 minutos potencia 3 seguidos de 2 min potencia 3 agitando de manera continua hasta su disolucin completa) 5. Una vez que la solucin de agarosa ha alcanzado los 60C, se le aaden 2 mL de solucin amortiguadora que contiene 50X TAE y bromuro de Etidio (Final 1X TAE y 0.5 g/mL de bromuro de etidio) agitar vigorosamente para mezclar todos sus componentes.. TRABAJAR CON GUANTES!!! 6. Se vierte la solucin de agarosa con bromuro de etidio en el soporte, previamente sellado. Se deja polimerizar durante unos 10 a 15 minutos. Preparacin de las muestras de ADN En una charola de cargado colocar 1 l de amortiguador de carga y posteriormente aadir 5 l del producto de PCR NAT2 obtenido de la primera parte de la prctica.

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Electroforesis 1. Quitar las barreras del gel recin preparado 2. Se aade amortiguador de electroforesis TAE 1X, de forma que cubra bien el gel de agarosa. 3. Se aplican 5 l de marcadores de peso molecular (1 Kb Ladder) en el primer pocillo. 4. Se aplica la muestra preparada en el apartado anterior en los siguientes pocillos. 5. Se conectan los electrodos a la fuente de alimentacin. Se comprueba que est bien conectada. 6. Se programa la fuente a unos 100 V y se comienza a correr la electroforesis que durar unos 30-45 minutos. 7. Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de ADN mediante luz UV y se realiza una fotografa de la imagen.

Por ltimo, prepararemos una recta de calibrado con los pesos moleculares de los marcadores en funcin de la distancia recorrida en la electroforesis e interpolaremos las distancias recorridas para conocer su tamao molecular.

Identificacin del producto NAT2-547 Como resultado de la amplificacin por PCR se debe obtener un producto nico de 547 pares de bases. Debe visualizarse debajo del fragmento de 564 pb del marcador lambda/HindIII, como se puede observar en la simulacin de la derecha.GCTGGGTCTGGAAGCTCCTCccagatgtggcagcctctagaattaatttctgg gaaggatcagcctcaggtgccttgcattttctgcttgacagaagagagaggaa tctggtacctggaccaaatcaggagagagcagtatattacaaacaaagaattt cttaattctcatctcctgccaaagaagaaacaccaaaaaatatacttatttac gcttgaacctcgaacaattgaagattttgagtctatgaatacatacctgcaga cgtctccaacatcttcatttataaccacatcattttgttccttgcagacccca gaaggggtttactgtttggtgggcttcatcctcacctatagaaaattcaatta taaagacaatacagatctggtcgagtttaaaactctcactgaggaagaggttg aagaagtgctgaaaaatatatttaagatttccttggggagaaatctcgtgccc aaacctggtgatggatcccttactatttagaataaggaacaaaataaaCCCTT GTGTATGTATCACCCAA

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4. Anlisis del SNP C481T mediante RFLP. 8.5 L del producto NAT2-547 ser digerido con la endonucleasa KpnI (5-10 U) durante 2 horas a 37C. El nmero y la longitud de los fragmentos obtenidos sern analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2.5%, teidos con bromuro de etidio. La talla molecular de cada fragmento ser calculada mediante la comparacin con marcadores de peso molecular de talla conocida, disponibles comercialmente.Mezcla de reaccin para SNP C481T Componente Vol (L) PPCR NAT2 8.5 10X Buffer de reaccin 1 KpnI (5U) 0.5

5. Anlisis del SNP G857A mediante RFLP. 8.5 L del producto NAT2-547 ser digerido con la endonucleasa BamHI (5-10 U) durante 2 horas a 37C. El nmero y la longitud de los fragmentos obtenidos sern analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, teido con bromuro de etidio. La talla molecular de cada fragmento ser calculada mediante la comparacin con marcadores de peso molecular de talla conocida, disponibles comercialmente.Mezcla de reaccin para SNP G857A Componente Vol (L) PPCR NAT2 8.5 10X Buffer de reaccin 1 BamHI (5U) 0.5

6. Determinacin del genotipo molecular La discriminacin entre el genotipo molecular homocigoto o heterocigoto se realizar mediante la comparacin individual de los fragmentos de restriccin obtenidos con respecto a la presencia o ausencia del sitio de reconocimiento para la endonucleasa.

Anlisis e interpretacin de resultados, identificacin del genotipo molecular NAT2 SNPs C481T y G857A

Genotipo molecular NAT2 SNP C481T El alelo silvestre [C] est comprometido en un sitio de reconocimiento por la endonucleasa KpnI. El fragmento amplificado contiene slo ese sitio de corte para KpnI, por lo que se esperan dos fragmentos: 433 y 114 pb. En tanto que el alelo mutante [T] elimina el sitio de reconocimiento para KpnI, por lo que no hay corte y se mantiene el producto de 547 pb. Por lo tanto, para el anlisis del genotipo SNP 481 se esperan los polimorfismos de longitud mostrados en la simulacin de la derecha. 8

GCTGGGTCTGGAAGCTCCTCccagatgtggcagcctctagaattaattt ctgggaaggatcagcctcaggtgccttgcattttctgcttgacag KpnI aagagagaggaatctggtacctggaccaaatcaggagagagcagtatat tacaaacaaagaatttcttaattctcatctcctgccaaagaagaaacac caaaaaatatacttatttacgcttgaacctcgaacaattgaagattttg agtctatgaatacatacctgcagacgtctccaacatcttcatttataac cacatcattttgttccttgcagaccccagaaggggtttactgtttggtg ggcttcatcctcacctatagaaaattcaattataaagacaatacagatc tggtcgagtttaaaactctcactgaggaagaggttgaagaagtgctgaa aaatatatttaagatttccttggggagaaatctcgtgcccaaacctggt gatggatcccttactatttagaataaggaacaaaataaaCCCTTGTGTA TGTATCACCCAA

Genotipo molecular NAT2 SNP G857A Resultado: El alelo silvestre [G] est comprometido en un sitio de reconocimiento por la endonucleasa BamHI. El fragmento amplificado contiene slo ese sitio de corte para BamHI, por lo que se esperan dos fragmentos: 490 y 57 pb. En tanto que el alelo mutante [A] elimina el sitio de reconocimiento para BamHI, por lo que no hay corte y se mantiene el producto de 547 pb. Por lo tanto, para el anlisis del genotipo SNP 857 se esperan los polimorfismos de longitud mostrados en la simulacin de la derecha.GCTGGGTCTGGAAGCTCCTCccagatgtggcagcctctagaattaa tttctgggaaggatcagcctcaggtgccttgcattttctgcttgac agaagagagaggaatctggtacctggaccaaatcaggagagagcag tatattacaaacaaagaatttcttaattctcatctcctgccaaaga agaaacaccaaaaaatatacttatttacgcttgaacctcgaacaat tgaagattttgagtctatgaatacatacctgcagacgtctccaaca tcttcatttataaccacatcattttgttccttgcagaccccagaag gggtttactgtttggtgggcttcatcctcacctatagaaaattcaa ttataaagacaatacagatctggtcgagtttaaaactctcactgag gaagaggttgaagaagtgctgaaaaatatatttaagatttccttgg BamHI ggagaaatctcgtgcccaaacctggtgatggatcccttactattta gaataaggaacaaaataaaCCCTTGTGTATGTATCACCCAA

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Resultados y observaciones, anota los resultados obtenidos de las secciones 1 al 6. Anexarla grafica obtenida de la seccin 3.

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Conclusiones

Cuestionario1. De cuales tejidos podramos realizar la extraccin de ADN genmico?

2. Menciona y describe las metodologas utilizadas para la cuantificacin de ADN

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3. Mencione que ocurre en cada uno de los pasos/ciclos de una reaccin de PCR

4. Que propiedades fisicoqumicas posee la Taq ADN polimerasa?

5. Que aplicaciones posee la tcnica de PCR

6. Menciona que es un polimorfismo gentico

7. Define: homocigoto, heterocigoto, alelo, endonucleasa, palindrome

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8. Que aplicaciones posee la tcnica de RFLP

BibliografaEvans DAP, Manley KA, McKusick VA. Brit Med J 1960;2:485-91. Grant DM, Morike K, Eichelbaum M, Meyer UA. J Clin Invest 1990;85:968-72. Vatsis KP, Martell KJ, Weber WW. Proc Nat Acad Sci 1991;88:6333-7. Lin HJ, Han C-Y, Lin BK, Hardy S. Pharmacogenetics 1994;4:125-34. Bell DA, Taylor JA, Butler MA, et al. Carcinogenesis 1993;14:1689-92.

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Proyecto 2 Deteccin molecular de enterobacterias utilizando un fragmento del gen codificante para el RNA ribosomal 16SAntecedentes La familia Enterobacteriacea est compuesta por un gran nmero de especies bacterianas estrechamente relacionadas entre s, las cuales se pueden localizar en suelo, agua, materia en descomposicin, e intestino grueso del hombre, animales o insectos. Dentro de esta familia, se encuentran los agentes causales ms importantes de enfermedades gastrointestinales: fiebre tifoidea y disentera bacilar. En bacterias, existen 3 molculas de ARN ribosomal que pueden ser tiles en la identificacin molecular: 5S, 16S, 23S. Sin embargo, la molcula 16S (la cual es la ms conservada a travs de la escala filogentica) representa la secuencia con mayor potencial para la identificacin y caracterizacin molecular, cuando los mtodos convencionales sean insuficientes. Actualmente, existen mtodos convencionales (citolgicos, bioqumicos, serolgicos, etc.) que permiten la identificacin de enterobacterias con caractersticas patgenas; sin embargo, los avances en materia de tecnologa del ADN estn abriendo nuevas posibilidades para desarrollar e implementar metodologas y tcnicas selectivas que facilitan la deteccin rpida. Uno de stas es la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (de las siglas en ingls Polymerase Chain Reaction), la cual es una amplificacin exponencial de ADN a partir de oligonucletidos iniciadores especficos para un gen o fragmento de ADN. En nuestra realidad social actual, los servicios de salud que estn a nuestro alcance no cuentan con el suficiente apoyo diagnstico en etapas tempranas de la enfermedad, lo cual puede repercutir en las etapas posteriores de la enfermedad. De tal manera que, el desarrollo e implementacin de metodologas que permitan la deteccin molecular de genes involucrados en los procesos patolgicos o de aquellos que permitan la identificacin del agente causal es de gran importancia para el diagnstico, pronstico y seguimiento de la enfermedad. El presente resumen pretende exponer la aplicacin de las herramientas de la bioinformtica en el desarrollo e implementacin de un mtodo rpido y eficaz que permita caracterizar molecularmente el gen que codifica para el ARN ribosomal 16S (ARNr 16S) de enterobacterias, el cual permit identificar, por mtodos modernos, los principales agentes causales de enfermedades gastrointestinales.

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Estrategia metodolgica

1. Anlisis bioinformtico Inicialmente, se realiz una bsqueda de secuencias en las bases de datos del Centro Nacional de Informacin en Biotecnologa de los E.U.A. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) para extraer las secuencias codificantes del gen ARNr 16S de las enterobacterias, E. coli, K. pneumoniae, M. morgani, K. oxytoca. Posteriormente, mediante una comparacin simple se localiz la regin altamente conservada donde hibridan los oligonucletidos. Para hacer una comparacin global de la regin de amplificacin, se realiz un alineamiento mltiple de los genes ARNr 16S de las enterobacterias, utilizando el programa ClustalX. Las predicciones de los cortes enzimticos con endonucleasas de restriccin fueron realizadas utilizando el programa Gene Construction Kit v2.5 para Mac (Textco BioSoftware, Inc.).

2. Oligonucletidos Para amplificar los genes ARNr 16S de enterobacterias, se utiliz un par de oligonucletidos reportados en la literatura (vase la Tabla I). Las propiedades fisicoqumicas de los oligonucletidos fueron analizadas utilizando el programa OLIGO v4.0 para Mac (Molecular Biology Insights, Inc.). La verificacin de la especificidad puede ser analizada mediante un anlisis tipo BLAST usando Tabla I. Oligonucletidos utilizados para la amplificacin del fragmento que codifica para el gen la base de datos GenBank del Centro 16S de ARN ribosomal. Nacional de Informacin en Nombre Secuencia (5 3) Biotecnologa de los E.U.A. Los 16S.FW AGAGTTTGATCATGGCTCAG oligonucletidos sintticos fueron 16S.RV GGACTACCAGGGTATCTAAT comprados a la compaa BIOSYNTHESIS, representada por la compaa SIGMA de Mxico.

3. Extraccin rpida de ADN genmico bacteriano El ADN bacteriano fue obtenido siguiendo un protocolo de extraccin rpida de lisis bacteriana por calor. Brevemente, una colonia fue resuspendida en 1 mL de agua destilada estril y lisada por calor durante 10 min. a 100C; posteriormente, los restos celulares fueron separados mediante centrifugacin y el sobrenadante fue conservado a -20C para su uso posterior. Las colonias de enterobacterias fueron obtenidas del cepario de la F.C.Q.I. de la U.A.B.C.

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4. Amplificacin mediante la reaccin de PCR El ADN bacteriano ser utilizado como molde para la amplificacin de un fragmento de aproximadamente 800 pb del gen ARNr 16S. Las concentraciones de los componentes de la reaccin de PCR se muestran en la Tabla II. La enzima Taq ADN polimerasa (QIAGEN) fue utilizada como la enzima polimerizante. Las condiciones de termociclado fueron Tabla II. Componentes de la reaccin de PCR estndar las siguientes: un ciclo de para la amplificacin del fragmento que codifica para el desnaturalizacin inicial de 2.0 min. a gen ARN 16S de enterobacterias. 94C; 35 ciclos de amplificacin Componente Vol. (L) exponencial de 0.5 min. a 94C, 0.5 Taq 2X Mix 12.5 Mezcla oligos 16S.FW y 16S.RV 10 M 10 min. a 55C, 1.0 min. a 72C; y un ciclo ADN bacteriano 2.5 de extensin final de 7 min. a 72C.

5. Visualizacin y anlisis de los productos amplificados Los productos de la reaccin de PCR seran separados en base a su peso molecular mediante electroforesis en gel de agarosa, utilizando a bromuro de etidio como agente intercalante de ADN (el cual fluoresce cuando es excitado por luz ultravioleta). La talla molecular del fragmento amplificado puede ser calculada mediante la comparacin con marcadores de peso molecular de talla conocida, disponibles comercialmente.

Materiales Equipo Microondas Equipo de electroforesis (cubeta, soporte, peine, fuente de alimentacin). Transiluminador de luz UV. Equipo de tratamiento de imagen Reactivos Amortiguador de electroforesis TAE (Tris-acetato). Agarosa. Bromuro de etidio (Muy peligroso usar guantes!!!!). Amortiguador de carga (glicerol 30%, azul de bromo-fenol 0.25%, azul de xilen-cianol 0.25%). Marcadores de peso molecular.

Procedimiento Preparacin del gel de agarosa 1. Preparar el siguiente sistema: colocar las barreras y peine que servir para formar los pocillos del gel en la charola de vaciado de la cmara. 2. Colocar en el congelador por algunos minutos. 16

3. Se vierten en un matraz erlenmeyer con tapa de 2 g de agarosa (2%) y 100 mL del agua destilada 4. Se funde la solucin de agarosa en un microondas o placa calefactora. (sugerencia 3 minutos potencia 3 seguidos de 2 min potencia 3 agitando de manera continua hasta su disolucin completa) 5. Una vez que la solucin de agarosa ha alcanzado los 60C, se le aaden 2 mL de solucin amortiguadora que contiene 50X TAE y bromuro de Etidio (Final 1X TAE y 0.5 g/mL de bromuro de etidio) agitar vigorosamente para mezclar todos sus componentes.. TRABAJAR CON GUANTES!!! 6. Se vierte la solucin de agarosa con bromuro de etidio en el soporte, previamente sellado. Se deja polimerizar durante unos 10 a 15 minutos. Preparacin de las muestras de ADN En una charola de cargado colocar 1 l de amortiguador de carga y posteriormente aadir 5 l del producto de PCR NAT2 obtenido de la primera parte de la prctica. Electroforesis 8. Quitar las barreras del gel recin preparado 9. Se aade amortiguador de electroforesis TAE 1X, de forma que cubra bien el gel de agarosa. 10. Se aplican 5 l de marcadores de peso molecular (1 Kb Ladder) en el primer pocillo. 11. Se aplica la muestra preparada en el apartado anterior en los siguientes pocillos. 12. Se conectan los electrodos a la fuente de alimentacin. Se comprueba que est bien conectada. 13. Se programa la fuente a unos 100 V y se comienza a correr la electroforesis que durar unos 30-45 minutos. 14. Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de ADN mediante luz UV y se realiza una fotografa de la imagen.

6. RFLP, Digestin con endonucleasas y anlisis del patrn de restriccin Los fragmentos del gen ARNr 16S bacteriano pueden ser digeridos utilizando las endonucleasas de restriccin HindIII y AluI. Las endonucleasas fueron adquiridas de la compaa New England Biolabs y se utilizaron usando el amortiguador sugerido por el proveedor. La mezcla de reaccin es colocada a 37C durante 2 horas minimo.Mezcla de reaccin para SNP C481T Componente Vol (L) PPCR 16S Enterobacterias 8.5 10X Buffer de reaccin 1 AluI (5U) 0.5 HindIII (5U) 0.5

Para realizar el anlisis RFLP es necesario realizar una separacin de los productos de la digestin en gel de agarosa, visualizados con bromuro de etidio, y comparados con marcadores de peso molecular conocido. El patrn de los fragmentos de restriccin debe ser analizado con los controles.

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Prediccin de resultados obtenidos

Digestin del gen ARNr 16S de enterobacterias. Prediccin bioinformtica de los fragmentos de restriccin con las endonucleasas HindIIIMaeIII. Enterobacteria Fragmentos (pb) E. coli 415,165,158,61 K. pneumoniae 324,224,165,85 K. oxytoca 403,323,61,12 M. Morgani 224,191,165,158,61

Resultados y observaciones, anota los resultados obtenidos de las secciones 1 al 6.

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Conclusiones

Cuestionario1. Menciona las caractersticas de las diferentes Enterobacterias utilizadas en el presente proyecto?

2. Que enfermedades pueden causar cada una de ellas?

3. Cules son las ventajas de un diagnostico molecular por RFLP vs mtodos convencionales

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4. Que propiedades fisicoqumicas posee el ARN ribosomal 16S y porque es tan utilizado este gen en diversas pruebas moleculares?

BIBLIOGRAFIA Alberts B, Johson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD. Molecular Biology of the Cell. 4rd Ed. New York. WH Freeman & Co. 2000. Drancourt M, Bollet C, Carlioz A, Martelin R, Gayral JP, Raoult D. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol. 2000;38(10):3623-30. Griffiths AJF, Gelbart WM, Millar JH, Lewontin RC. Modern Genetic Analysis. New York. WH Freeman & Co. 1999. Sabat G, Rose P, Hickey WJ, Harkin JM. Selective and sensitive method for PCR amplification of Escherichia coli 16S rRNA genes in soil. Appl Environ Microbiol. 2000;66(2):844-9. Sambrook J, Russell DW, Manniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 3th Ed. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res 1997;25(24):4876-82.

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Proyecto 3. Regulacin Gentica: El Operon de LactosaEn las bacterias, a pesar de ser organismos unicelulares, es necesario regular la expresin de los genes adaptndola a las necesidades ambientales. Es un principio de economa celular el que la expresin de los genes esta regulada segn las circunstancias celulares. Un buen ejemplo de esta situacin en bacterias es la regulacin de las enzimas implicadas en el metabolismo de los azcares. Las bacterias pueden emplear para obtener energa distintas fuentes de carbono, como la glucosa, lactosa, galactosa, maltosa, ramanosa y xilosa. Existen enzimas capaces de introducir cada uno de estos azcares en la bacteria y enzimas capaces de romperlos para obtener energa. Lgicamente, sera un gran gasto energtico producir simultneamente todos los enzimas necesarios para metabolizar los diferentes azcares mencionados. Por consiguiente, sera mucho ms econmico para la clula producir solamente las enzimas necesarias en cada momento, es decir, si en el medio en el que vive la bacteria la principal fuente de carbono es la lactosa, solamente se expresaran los genes necesarios para metabolizar la lactosa, mientras que los otros genes no se expresaran. Por tanto, es esencial que exista un mecanismo de regulacin de la expresin gnica, de manera que los genes se expresen cuando sea necesario. La regulacin de la produccin de protenas (sntesis de protenas) considerando el proceso en su conjunto, puede llevarse a cabo en tres niveles: Replicacin, Transcripcin y Traduccin. De los tres niveles de regulacin, uno de los mejor conocidos actualmente es la regulacin durante la transcripcin

1. Clonacin de genes en plsmidos bacterianos: Transformacin de clulas competentes de Escherichia coli. Para el clonaje y amplificacin del plsmido recombinante es necesario introducirlo en una bacteria. Al proceso de incorporacin de un ADN aislado de forma estable por una bacteria se denomina transformacin. Salvo algunas excepciones, las bacterias son impermeables a la entrada de cidos nucleicos exgenos en condiciones normales de crecimiento. Sin embargo, disponemos de mtodos qumicos y fsicos que facilitan la entrada del ADN en la bacteria. Todos los mtodos qumicos de transformacin que se utilizan actualmente derivan de la observacin de Mandel y Higa (1970, J. Mol. Biol. 53, 159-162) segn la cual las bacterias tratadas en fro con una disolucin de CaCl2, y a continuacin sometidas a un choque trmico a 37C o 42C, se hacen competentes y permiten la entrada del ADN del fago . Este mtodo se extrapol posteriormente a ADN de plsmidos (Cohen et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 21102114). Los mtodos actualmente en uso son variaciones del original, encaminadas a optimizar la eficiencia de transformacin de cada cepa bacteriana, que suele oscilar entre 106 a 109 transformantes por g de ADN plasmdico. A pesar de las mejoras metodolgicas conseguidas, an desconocemos el mecanismo molecular por el que las clulas se hacen competentes a la entrada de ADN exgeno. Por otra parte, de entre los mtodos fsicos de transformacin de 21

bacterias podemos destacar la electroporacin. Consiste en exponer las clulas de E. coli a una descarga elctrica, que induce la formacin transitoria de poros en las membranas por donde penetran las molculas de ADN. Los plsmidos que estamos usando en esta prcticas de clonaje tienen el gen de resistencia a ampicilina (bla). Este gen codifica una -lactamasa que hidroliza el anillo -lactmico de la ampicilina, inactivndola. La ampicilina es una aminopenicilina con actividad antimicrobiana de amplio espectro. Inhibe la sntesis del pptidoglicano, constituyente de la pared bacteriana, en clulas en fase activa de crecimiento. Las bacterias que contienen este tipo de plsmidos se pueden seleccionar crecindolas en presencia de ampicilina. Obviamente, las bacterias que no han incorporado el plsmido no crecern en este medio de cultivo. Objetivo Obtencin de clones bacterianos conteniendo el plsmido recombinante pBSSK- y pTGF Materiales E. coli XL1Blue MRF Plsmido PBSSK- y pTGF Placas de Petri con medio LB slido y ampicilina (150 g/ml). Estufa a 37. Pipetas automticas y puntas. Incubadora a 37C. Hielo y recipientes para hielo; Tubos eppendorf.

a. Transformacin mediante choque trmico. 1. Tomar 1 microtubo de clulas competentes para la transformacin y mantener en hielo. Adicionar 50 ng del plsmido recombinante pBSSK- o pTGF mezclando suavemente las clulas. 2. Incubar durante 30 minutos en hielo. 3. Colocar el microtubo en un termobloque a 42C durante 90 -120 segundos. 4. Remover el tubo inmediatamente hacia el hielo e incubarlo otros 5 minutos (Al finalizar este paso el DNA presente debi entrar en algunas clulas). 5. Adicionar 1 mL de medio 2XYT a cada tubo resuspendiendo suavemente las clulas. 6. Incubar 30-60 min a 37C y 300 rpm, esto permitir a las clulas se recuperen del trauma del tratamiento de competencia. 7. Despus de la incubacin, sembrar 100 L de la suspensin celular en caja con LB mas ampicilina 150 g/mL, esparcir uniformemente sobre el agar con una varilla de vidrio doblada como bastn de hockey esterilizada mediante flameo con alcohol. 8. Incubar la caja a 37C durante la noche. 1. Al da siguiente, recoger las placas de la estufa y analizar los resultados. Contar las unidades formadoras de colonias (UFC) obtenidas. Determine la eficiencia de transformacin (nmero de colonias/g de ADN) utilizando la placa de Petri procedente de la transformacin con pRSET no digerido. 22

2. Alfa complementacin; Operon de Lactosa

Jacob, Monod y colaboradores analizaron el sistema de la lactosa en E. coli, de manera que los resultados de sus estudios permitieron establecer el modelo gentico del Opern que permite comprender como tiene lugar la regulacin de la expresin gnica en bacterias. Un Opern es grupo de genes estructurales cuya expresin est regulada por los mismos elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores. Los principales elementos que constituyen un opern son los siguientes: Los genes estructurales: llevan informacin para polipptidos. Se trata de los genes cuya expresin est regulada. El promotor (P): se trata de un elemento de control que es una regin del ADN con una secuencia que es reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la transcripcin. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales El operador (O): se trata de otro elemento de control que es una regin del ADN con una secuencia que es reconocida por la protena reguladora. El operador se sita entre la regin promotora y los genes estructurales. El gen regulador (i): secuencia de ADN que codifica para la protena reguladora que reconoce la secuencia de la regin del operador. El gen regulador est cerca de los genes estructurales del opern pero no est inmediatamente al lado. Protena reguladora: protena codificada por el gen regulador. Est protena se une a la regin del operador. Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresin de los genes.

El Opern lactosa es un sistema inducible que est bajo control negativo, de manera que la protena reguladora, producto del gen regulador i, es un represor que impide la expresin de los genes estructurales en ausencia del inductor. El verdadero inductor del sistema es la Alolactosa y no la lactosa de manera que la -galactosidasa transforma la lactosa en Alolactosa. En los estudios del opern lactosa se utiliza como inductor un anlogo sinttico de la lactosa que es el Isopropil tiogalactsido (IPTG). El IPTG no necesita ser transportado por la galactsido permeasa para entrar en la bacteria. Las cepas normales de E. coli son inducibles, de manera que en ausencia del inductor (la lactosa), la protena represora producto del gen i se encuentra unida a la regin operadora e impide la unin de la ARN-polimerasa a la regin promotora y, como consecuencia, no se transcriben los genes estructurales. 23

Sin embargo, en presencia del inductor (la lactosa), este se une a la protena reguladora que cambia su conformacin y se suelta de la regin operadora dejando acceso libre a la ARN-polimerasa para que se una a la regin promotora y se transcriban los genes estructurales. Por consiguiente, la presencia del inductor hace que se expresen los genes estructurales del opern, necesarios para metabolizar la lactosa.

La actividad de la enzima Beta-galactosidasa puede detectarse in vivo usando el sustrato cromognico 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactosido (X-gal) que toma una coloracin azul intenso cuando es procesado por la enzima. Al insertarse un gen de inters, mediante biologa molecular, en los plsmidos que portan la subunidad alfa, esta secuencia se interrumpe y este fragmento no se expresa ms, por tanto las colonias que portan los plsmidos recombinantes (que portan el gen de inters) son de coloracin blanca cuando se crecen en medio slido que contiene Xgal e IPTG. Mientras que aquellos clones no recombinantes sern azules en este mismo medio. El isopropylthiogalactosido (IPTG) es una molcula sinttica anloga a la alolactosa que se une eficientemente al represor del opern lactosa, convirtindola en un inductor del sistema.

Estrategia metodolgica de la alfa complementacin1. De las UFC obtenidas del paso anterior, tomar una colonia y sembrar por estra en medio LB ampicilina que contenga 20 mM de IPTG y 10 mM de X-gal 2. Incubar las placas a 37C durante la noche 3. Analizar los resultados de la alfa-complementacin con respecto a los plsmidos transformados (A:pBSSK- y B pTGF)

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Resultados y observaciones, anota los resultados obtenidos de las secciones 1 y 2.

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Conclusiones

Cuestionario2. Investigue es transformacin bacteriana?

3. Qu funcin tiene el calcio en la transformacin?

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4. Qu otros mtodos de transformacin bacteriana existen?

5. Busque las caractersticas de la cepa bacteriana usada en esta prctica

6. Por qu se crecen las bacterias en medio LB lquido durante 30 minutos antes de pasarlas al medio slido que contiene ampicilina?

7. Por qu se crecen las bacterias durante toda la noche en un medio slido con ampicilina?

8. Define: homocigoto, heterocigoto, alelo, endonucleasa, palindrome

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BibliografaInohue H, Nojima H, Okayama H (1990): High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28. Old RW, Primrose SB (1989) Principles of gene manipulation. Blackwell Sci. Pub. Oxford. pp 11-13. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp. 1.74-1.84.

Proyecto

Comentarios

Calificacin

1

2

3

Promedio General

Realizado por Dra. Rosa Elena Mares Alejandre Dr. Marco Antonio Ramos Ibarra

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