Manual de protocolos

MANUAL PARA EL ANÁLISIS DE AGUAS RESIDUALES Y LODOS

I.C. DAYANA KATERINE GRISALES PENAGOS I.M. LINDA JOELA ORTEGA LÓPEZ

SERGIO ANDRÉS BLANCO LONDOÑO, ESP TATIANA RODRÍGUEZ CHAPARRO, PhD. CARLOS EDUARDO MUÑOZ ORTIZ, ESP

I.C. ANGÉLICA ANDREA MÉNDEZ REVOLLO I.C. DIANA MARGARITA HERNÁNDEZ

I.C. YULY VANESSA TORRES ARÉVALO

FACULTAD DE INGENIERÍA PROGRAMA INGENIERÍA CIVIL

UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA BOGOTÁ 2014

2

CONTENIDO

Pág.

PRESENTACIÓN..................................................................................................................... 11

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES ........................................................................................... 12

A. SOLUCIÓN H2SO4 1.0N ................................................................................................. 12

B. SOLUCIÓN H2SO4 0.5N – 0.05N .................................................................................... 12

C. FACTOR DE DILUCIÓN .................................................................................................. 13

ANÁLISIS FÍSICOS .................................................................................................................. 15

1. COLOR – MÉTODO Nº 2120 ...................................................................................... 15

A. CONCEPTO ........................................................................................................................ 15

B. PRINCIPIO DEL MÉTODO .................................................................................................... 15

C. EQUIPOS Y MATERIALES .................................................................................................... 15

D. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................... 16

E. CÁLCULOS .......................................................................................................................... 17

2. SÓLIDOS– MÉTODO Nº 2540 .................................................................................... 17

A. CONCEPTO ........................................................................................................................ 17

B. PRINCIPIO DEL METODO .................................................................................................... 17


D. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................... 18

ANÁLISIS QUÍMICOS ............................................................................................................. 21

3. ALCALINIDAD Y ÁCIDOS VOLÁTILES TOTALES – MÉTODO Nº 2320 .......................... 21

3

A. CONCEPTO ........................................................................................................................ 21



E. PREPARACIÓN DE REACTIVOS ............................................................................................ 21

F. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................... 23

G. Calibración medidor de pH ................................................................................................ 23

H. CÁLCULOS ........................................................................................................................ 25

4. DUREZA ........................................................................................................................ 26

A. CONCEPTO .................................................................................................................... 26

B. MATERIALES ................................................................................................................. 26

C. REACTIVOS ................................................................................................................... 27

D. PROCEDIMIENTO .......................................................................................................... 27

E. CALCULOS ..................................................................................................................... 28

5. REQUERIMIENTO EN DEMANDA OXIDANTE – MÉTODO Nº 2350 ............................ 28

A. CONCEPTO ....................................................................................................................... 28

B. PRINCIPIO DEL MÉTODO ................................................................................................... 28

C. EQUIPOS Y MATERIALES ................................................................................................... 29

D. REACTIVOS ....................................................................................................................... 29

E. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS .................................................................................... 29

F. PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 30

G. CÁLCULOS ........................................................................................................................ 30

6. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE OZONO FASE LÍQUIDA (AccuVac) No. 454-456 32

4

A. PRINCIPIO DEL MÉTODO .................................................................................................... 32

B. EQUIPOS Y MATERIALES .................................................................................................... 32

C. REACTIVOS ........................................................................................................................ 32

D. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................... 32

E. CÁLCULOS ......................................................................................................................... 34

7. CLORUROS – MÉTODO Nº 4500-Cl- ........................................................................... 34

A. CONCEPTO ....................................................................................................................... 34



D. REACTIVOS ........................................................................................................................ 35

F. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................... 35

G. CÁLCULOS ........................................................................................................................ 36

8. FÓSFORO – ORTOFOSFATOS (PO4-2) – MÉTODO Nº 4500-P ..................................... 37

A. CONCEPTO ........................................................................................................................ 37



D. REACTIVOS ........................................................................................................................ 37

E. PREPARACIÓN DE REACTIVOS ........................................................................................... 38

F. PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 38

G. CALCULOS ......................................................................................................................... 41

8 A. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE FOSFORO- UTILIZANDO EL ESPECTOFOTOMETRO DR 5000 ....................................................................................... 42

A. PRINCIPIO DEL MÉTODO ................................................................................................... 42

5

B. EQUIPOS Y MATERIALES ................................................................................................... 42

C. REACTIVOS ....................................................................................................................... 42

D. PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 42

E. CÁLCULOS ......................................................................................................................... 44

9. SULFATOS – MÉTODO Nº 4500-SO42- ........................................................................ 44

A. CONCEPTO ....................................................................................................................... 44



D. REACTIVOS ....................................................................................................................... 45

E. PREPARACION DE REACTIVOS ........................................................................................... 45

F. PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 45

G. CALCULOS ........................................................................................................................ 47

10. NITRÓGENO – MÉTODO Nº 4500-Norg................................................................... 49

A. CONCEPTO ....................................................................................................................... 49



D. PREPARACIÓN DE REACTIVOS ........................................................................................... 50

E. PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 50

F. CÁLCULOS ......................................................................................................................... 52

10 A. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE NITROGENO TOTAL (2 a 150 mg/L N), MÉTODO DIGESTIÓN DE PERSULFATO ............................................................................ 52

A.PRINCIPIO DEL MÉTODO ................................................................................................... 52


6

C. REACTIVOS ........................................................................................................................ 53

D. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................... 53

E. CÁLCULOS ..........................................................................................................................55

11. DEMANDA QUÍMICA DE OXIGENO (DQO) – MÉTODO Nº 5220 – RANGO MEDIO -800 mg/L .......................................................................................................................... 56

A. CONCEPTO ....................................................................................................................... 56

B. PRINCIPIO DEL METODO ................................................................................................... 56


D. REACTIVOS ....................................................................................................................... 56

E. PREPARACIÓN DE REACTIVOS ........................................................................................... 57

F. PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 57

12. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE OXÍGENO DISUELTO (Utilizando el equipo portátil Hanna HI 9146) .................................................................................................... 64



C. REACTIVOS ....................................................................................................................... 64

D. PROCEDIMIENTO PARA MEDIR OXÍGENO DISUELTO. ........................................................ 65

13. DEMANDA BIOQUIMICA DE OXIGENO DBO5– MÉTODO Nº 5210 ........................ 66

A. CONCEPTO ....................................................................................................................... 66

B.PRINCIPIO DEL METODO .................................................................................................... 66


C. REACTIVOS ....................................................................................................................... 67

D. PREPARACIÓN DE REACTIVOS ........................................................................................... 67

7

E. PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 70

F. CÁLCULOS ......................................................................................................................... 72

14. RESIDUAL DE PEROXIDO DE HIDROGENO ................................................................. 73

A. CONCEPTO ..................................................................................................................... 73

B. EQUIPOS Y MATERIALES ................................................................................................ 73

C. REACTIVOS ................................................................................................................... 74

D. PROCEDIMIENTO .......................................................................................................... 74

15. CONSTITUYENTES ORGÁNICOS ABSORCIÓN-UV – MÉTODO Nº 5910 .................. 76

A. CONCEPTO ....................................................................................................................... 76


C. PROCEDIMENTO ............................................................................................................... 76

D. CÁLCULOS ........................................................................................................................ 77

16. MEDIDA DE LA ABSORCIÓN EN LA REGION DEL ESPECTRO UV-VIS .......................... 78


B.EQUIPOS Y MATERIALES .................................................................................................... 78

C.PROCEDIMIENTO ............................................................................................................... 79

2. Preparación de la muestra ................................................................................................ 79

17. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE CARBONO ORGÁNICO TOTAL (COT), MÉTODO DIRECTO ........................................................................................................................... 83



C. REACTIVOS ....................................................................................................................... 83

D. PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 84

8

E. CÁLCULOS ......................................................................................................................... 86

18. MÉTODO PARA DETERMINAR METANO POR DESPLAZAMIENTO ............................. 86



C. REACTIVOS ....................................................................................................................... 86

E. ESQUEMA DEL MONTAJE .................................................................................................. 87

F. PROCEDIMENTO ............................................................................................................... 88

19. ENSAYO DE ACTIVIDAD METANOGÉNICA ESPECÍFICA ............................................... 89

A. CONCEPTO ....................................................................................................................... 89


D. REACTIVOS ........................................................................................................................ 91

E. PREPARACIÓN DE REACTIVOS ............................................................................................ 91

F. PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 93

G. CÁLCULOS ........................................................................................................................ 95

CALCULO DE LA AME ........................................................................................................ 96

20. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE AZÚCAR ........................................................ 101



C. REACTIVOS ...................................................................................................................... 102

D. PREPARACION DE REACTIVOS .......................................................................................... 102

E. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 102

F. CÁLCULOS ........................................................................................................................ 104

9

21. HIDROGENO Y METANO POR CROMATOGRAFIA GASEOSA ................................... 104

A.CONCEPTO ....................................................................................................................... 104

B. EQUIPOS Y MATERIALES .................................................................................................. 105

C. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 105

D. CALCULOS ....................................................................................................................... 144

ANÁLISIS DE SUELOS .......................................................................................................... 146

21. MÉTODO PARA DETERMINAR CALCIO Y MAGNESIO SOLUBLES EN SUELO ............. 146

A. MÉTODO CUANTIFICACIÓN COMPLEXOMÉTRICA. ........................................................... 146


C. REACTIVOS ...................................................................................................................... 146

D. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS ................................................................................... 146

E. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 147

F. CÁLCULOS ........................................................................................................................ 147

22. MÉTODO PARA LA MEDICIÓN DE pH EN SUELOS .................................................... 149

A. EQUIPOS Y MATERIALES .................................................................................................. 149

B. REACTIVOS ...................................................................................................................... 149

C. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS ................................................................................... 149

D. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 149

23. MÉTODO PARA LA MEDICIÓN DE LA MATERIA ORGÁNICA EN SUELOS .................. 150

A. EQUIPOS Y MATERIALES .................................................................................................. 150

B. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 150

C. CÁLCULOS ....................................................................................................................... 150

10

ANALISIS MICROBIOLÓGICO .............................................................................................. 151

A.CONCEPTO .................................................................................................................... 151

B.PRINCIPIO DEL MÉTODO .................................................................................................... 151

24. TÉCNICA DEL FILTRO MEMBRANA PARA MIEMBROS DEL GRUPO COLIFORME ...... 152

A. PRINCIPIO DEL METODO .................................................................................................. 152


C. REACTIVOS ...................................................................................................................... 152

D. PREPARACIÓN DE REACTIVOS .......................................................................................... 152

E. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 153

F. CÁLCULO ......................................................................................................................... 154

ANÁLISIS DE TOXICIDAD ................................................................................................... 156

25. ENSAYO DE TOXICIDAD TOTAL CON BULBOS DE CEBOLLA ALLIUM CEPA L ............ 156

A. CONCEPTO ...................................................................................................................... 156


D. REACTIVOS ...................................................................................................................... 156

E. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS ................................................................................... 156

F. PROCEDIMIENTO ............................................................................................................. 157

G. CÁLCULOS ....................................................................................................................... 159

11

PRESENTACIÓN

El Laboratorio de Saneamiento Ambiental de la Universidad Militar Nueva Granada presenta en este documento las técnicas de laboratorio para el análisis de la calidad del agua residual, lodos y suelos con el objetivo de unificar los procesos seguidos por los usuarios del laboratorio en el desarrollo de las diferentes prácticas.

Para la elaboración de este manual se consultaron las normas del Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater de AWWA, APHA y WEF año 2005, así como el Manual Práctico de Análise de Água de Funasa Brasil año 2006 y el manual de Métodos Analíticos del Laboratorio de Suelos del IGAC 2006.

El manual aborda análisis físicos, químicos y microbiológicos en aguas residuales y suelos. En la primera parte se abordan los análisis físicos, en la segunda parte se tratan parámetros de análisis químicos de compuesto inorgánicos y orgánicos presentes en las aguas residuales y gases por el método de cromatografía gaseosa. En la tercera parte se presentan análisis para suelos y extractos de suelo. En la cuarta y quinta parte se presenta una metodología para la determinación de microorganismos del grupo Coliforme tanto en aguas como en suelos y un ensayo biológico para la determinación de toxicidad en aguas.

De acuerdo con lo anterior deseamos que este documento se utilidad para aquellas personas que deseen realizar ensayos de calidad del agua residual y suelos.

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PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

A. SOLUCIÓN H2SO4 1.0N

Para preparar una solución de H2SO4 1N diluir cuidadosamente 30mL de H2SO4

concentrado en un balón de 1000mL con agua destilada.

B. SOLUCIÓN H2SO4 0.5N – 0.05N

A partir de la solución de H2SO4 normalizada se obtienen las respectivas soluciones

empleado la siguiente ecuación:

𝑉1 × 𝐶1 = 𝑉2 × 𝐶2

Donde:

V1 = Volumen a tomar

C1 = Concentración conocida

V2 = Volumen a preparar

C2 = Concentración esperada

Como ejemplo para concentraciones de 0.5N se requiere diluir 500mL de solución 1N en

un balón de 1.0L con agua destilada de acuerdo con lo siguiente:

𝑉1 =𝑉2 × 𝐶2

𝐶1=

1000 × 0.5

1.0= 500𝑚𝐿

Como ejemplo para concentraciones de 0.05N se requiere diluir 25mL de solución 1N en

500mL de agua destilada de acuerdo con lo siguiente:

𝑉1 =𝑉2 × 𝐶2

𝐶1=

500 × 0.05

1.0= 25𝑚𝐿

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C. FACTOR DE DILUCIÓN

Para obtener diferentes concentraciones de muestras se requiere realizar diluciones de la misma para esto se emplea el Factor de Dilución, el cual se presenta en la siguiente ecuación:

𝐹. 𝐷 =𝑉𝑇

𝑉𝑓

Donde:

F.D = Factor de Dilución

VF = Volumen final que se coloca de la muestra

VT = Volumen total (VF + Vrestante para completar)

C = Concentración

D. PREPARAR SOLUCIONES HCL (10 mol/L)

Peso molecular HCL

H= 1 gr/mol O=16 gr/mol Cl=35,5 gr/mol

Densidad HCL = 1,175 gr/cm3

Masa = densidad x volumen

= 1,175 gr/cm3 x 1000 cm3

= 1175 gr de HCL en 1L de solución

Como la solución es de 37% de HCL, las cantidades de soluto y solvente que ahí en un litro

son:

100 𝑔𝑟 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛

37 𝑔𝑟 𝐻𝐶𝐿=

1175

𝑋 𝑋 =

1175 𝑋 37𝑔𝑟

100𝑔𝑟

𝑋 = 434,75 𝑔𝑟 𝑑𝑒 𝐻𝐶𝐿 𝑒𝑛 1𝐿

𝐴ℎ𝑜𝑟𝑎: 1175 𝑔𝑟 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 − 434,75 𝑔𝑟 𝑑𝑒 𝐻𝐶𝐿

14

= 𝟕𝟒𝟎, 𝟐𝟓𝒈𝒓 𝒅𝒆 𝑯𝟐𝑶

𝐿𝑢𝑒𝑔𝑜 𝑠𝑒 𝑝𝑎𝑠𝑎 𝑎 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠: 435,75 𝑔𝑟

36.5 𝑔𝑟/𝑚𝑜𝑙= 11,9 𝑚𝑜𝑙 𝑒𝑛 1𝐿 𝑑𝑒 𝐻𝐶𝐿

¿ 𝑪𝒐𝒎𝒐 𝒑𝒓𝒆𝒑𝒂𝒓𝒂𝒓 𝒖𝒏𝒂 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏 𝟏𝟎 𝒎𝒐𝒍/𝑳?

11.9 𝑚𝑜𝑙

1000𝑐𝑚3=

10 𝑚𝑜𝑙

𝑋

𝑿 = 𝟖𝟒𝟎 𝒎𝒍 𝒅𝒆 𝑯𝑪𝑳 𝒆𝒏 𝟏𝑳 → 𝟖𝟒𝒎𝒍 𝒅𝒆 𝑯𝑪𝑳 𝒆𝒏 𝟏𝟎𝟎 𝒎𝒍

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ANÁLISIS FÍSICOS

1. COLOR – MÉTODO Nº 2120

A. CONCEPTO

Usualmente cuando se examina el agua, las primeras propiedades que se suelen considerar son las siguientes: color, sabor y olor, características inherentes a ella. El agua de uso doméstico e industrial tiene como parámetro de aceptación la de ser incolora, pero en la actualidad, gran cantidad del agua disponible se encuentra coloreada y se tiene el problema de que no puede ser utilizada hasta que no se le trata removiendo dicha coloración.

Las aguas superficiales pueden estar coloreadas debido a la presencia de iones metálicos naturales (hierro y manganeso), humus, materia orgánica y contaminantes domésticos e industriales como en el caso de las industrias de papel, curtido y textil; esta última causa coloración por medio de los desechos de teñido los cuales imparten colores en una amplia variedad y son fácilmente reconocidos y rastreados

B. PRINCIPIO DEL MÉTODO

Se pueden efectuar dos medidas de color en el agua: real y aparente. El color real del agua natural es el que presenta cuando se ha eliminado la turbidez (filtrando o centrifugando), siendo principalmente causado por materiales húmicos coloidales. Por el contrario, el color aparente es determinado directamente de la muestra original (sin filtración ni centrifugación), es debido a la existencia de sólidos en suspensión.

Para la determinación de color en el agua existe el método espectrofotométrico, el cual se usa principalmente en aguas industriales contaminadas que tienen colores poco usuales, y que no pueden ser igualados por el método colorimétrico. El color se determina mediante un espectrofotómetro, cuyo esquema de funcionamiento se recoge en la figura, a tres longitudes de onda distribuidas por el conjunto del espectro visible: λ1 = 436nm; λ2= 525nm y λ3 = 620 nm, de acuerdo con lo sugerido por ÇeÇen (1999).

C. EQUIPOS Y MATERIALES

Espectrofotómetro DR 2800 o DR 5000.

Bomba de vacío.

Membrana de filtración de 1.2 µm de fibra de vidrio o centrifugar por 5 min a 1500 rpm.

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Probeta 50mL.

D. PROCEDIMIENTO

I. Para determinar el color real se debe filtrar la muestra en filtro de fibra de vidrio de 1,2 µm o en filtro de acetato de celulosa de 0,45 µm y para color aparente tomar la muestra de agua directamente de la original.

a. Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda en 436nm. b. Calibrar el equipo con la lectura inicial del blanco. c. Realizar la lectura de la absorbancia de la muestras de agua.

a) Paso 1

b) Paso 2 a 3

c) Paso 4

Figura 1. Pasos para el procedimiento de medición de color

II. Si se utiliza el espectrofotómetro DR 2800 O DR 5000, las unidades de medida son directamente UPC, así:

a. Seleccionar el programa correspondiente a color 455 nm o 465 nm.

b. Insertar la multiadaptador usando el portacelda respectivo frente al usuario.

c. Para preparar el blanco se llena un recipiente de 10 ml de agua destilada hasta el

borde indicado.

d. Llenar el segundo recipiente hasta el aforo de la muestra a analizar.

e. Limpiar los recipientes de tal manera que estén mojados ni que queden rastro de

huellas; luego, insertar el blanco pulsar <<ZERO>>, y retirar una vez salga <<0

unidades PtCo>>.

f. Realizar los mismos con el recipiente que contiene la muestra y pulsar <<MEDIR>>.

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E. CÁLCULOS

Para el numeral (a) el color se expresa en términos de absorbancia (cm-1) en la longitud de onda 436 nm.

2. SÓLIDOS– MÉTODO Nº 2540

A. CONCEPTO

Los sólidos se refiere a la materia en suspensión o disuelta en agua o agua residuales. Los sólidos pueden afectar el agua o adversamente la calidad del efluente. Aguas con alto contenido de sólidos disueltos en general son de menor potabilidad y pueden inducir a reacciones fisiológicas en el consumidor. Por estas razones, un límite de 500mg de sólidos disueltos/l es el deseado para el consumo en aguas.

B. PRINCIPIO DEL METODO

Son los materiales suspendidos y disueltos en un agua. Se obtienen después de someter al agua a un proceso de evaporación a temperaturas comprendidas entre 103 y 105ºC. La porción filtrable representa a los Sólidos Coloidales Totales Disueltos y la no-filtrable son los Sólidos Totales en Suspensión.

El contenido de sólidos volátiles se interpreta en términos de materia orgánica, teniendo en cuenta que a 550±50°C la materia orgánica se oxida formando el gas carbónico y agua que se volatilizan. Sin embargo, la interpretación no es exacta puesto que la pérdida de peso incluye también pérdidas debido a descomposición o volatilización de ciertas sales minerales como por ejemplo las sales de amonio o carbonato de magnesio.


Desecador

Bomba de vacío.

Balanza analítica.

Horno tipo mufla 550ºC.

Horno (103ºC y 105ºC).

Embudo tipo Buchner para membrana con diámetro de 47mm.

Membrana filtrante tipo micro-fibra de vidrio, con tamaño nominal de abertura de 0,45µm o 1,2µm.

Capsulas de porcelana.

Pinza metálica.

Probeta de 50mL.

Guantes para mufla.

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D. PROCEDIMIENTO

PREPARACIÓN DE CÁPSULA Y MEMBRANA PARA ST - SST

a. Lavar la capsula de porcelana previamente y calcinarla en mufla a 550ºC durante 15 minutos. Apagar la mufla, abrirla levemente y esperar hasta que llegue a una temperatura de 150°C (1 hora y 20 minutos aproximadamente) para después ser puesta en el horno a 105°C por 15 minutos. Luego transferirla al desecador para que se enfrié a temperatura ambiente.

b. Para preparación de solidos suspendidos colocar una membrana filtrante en el sistema de filtración.

c. Hacer 3 lavados a la membrana con el sistema de filtración utilizando 20mL de agua destilada para cada lavado (total de 60mL) que deben ser despreciados.

d. Colocar la membrana en la capsula de porcelana y calcinar en la mufla por 15 minutos, luego transferirla al desecador para que se enfrié a temperatura ambiente.

I. DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS TOTALES (ST)

Este procedimiento es limitado a una cantidad de sólidos secos de 200mg, debido a la posibilidad de la formación de una capa que impide el secado de los residuos.

a. Preparar una cápsula de porcelana como se nombró anteriormente en el paso a. b. Determinar la masa M1 en gramos en la balanza analítica. c. Transferir un volumen de la muestra V1 (en mililitros). d. Secar la muestra en el horno a 103ºC-105 ºC con tiempo suficiente para lograr una

masa constante (24 horas) y determinar la masa después de enfriar en el desecador M2.

𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 (𝑆𝑇) (𝑚𝑔

𝐿) =

(𝑀2−𝑀1)×1000000

𝑉1(𝑚𝐿) Ecuación 1

II. DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS TOTALES FIJOS Y VOLÁTILES (STF – STV)

a. Después de determinar la concentración de los sólidos totales, colocar la cápsula con la muestra en la mufla a 550ºC para alcanzar masa constante (en este caso, 15 minutos para una única muestra y, no más de 2 horas cuando son varias muestras).

b. Determinar la masa después del enfriamiento en el desecador (M3, en g) en la balanza analítica y calcular STF con la Ecuación 2 y STV con la Ecuación 3:

𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝐹𝑖𝑗𝑜𝑠 (𝑆𝑇𝐹) (𝑚𝑔

𝐿) =

(𝑀3−𝑀1)×1000000


19

𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑉𝑜𝑙á𝑡𝑖𝑙𝑒𝑠 (𝑆𝑇𝑉) (𝑚𝑔

𝐿) =

(𝑀2−𝑀3)×1000000


III. DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS SUSPENDIDOS TOTALES (SST)

Este procedimiento es limitado a una cantidad de sólidos secos de 200mg debido a la posibilidad de la formación de una capa que dificulta el secado.

a. Preparar una cápsula con membrana para el ensayo como se nombró anteriormente.

b. Determinar la masa del conjunto (membrana + cápsula) – M4 en (g). c. Colocar con una pinza metálica la membrana calcinada en el sistema de filtración. d. Filtrar un volumen conocido (V2) de muestra, utilizando el sistema de filtración. se

recomienda un volumen que casi colmate la membrana. Para muestras con poco material en suspensión se recomida mínimo 100 ml.

e. Transferir la membrana que contiene el residuo a la cápsula de porcelana. f. Secar el conjunto (membrana + cápsula) a 103ºC – 105ºC hasta conseguir una

masa constante (por 24 horas) y después enfriar en el desecador. g. Determinar la masa M5 en (g) y calcular con la Ecuación 4.

𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 𝑚𝑔/𝐿 =(𝑀5−𝑀4)×1000000


Figura 2. Paso d a f

IV. DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS SUSPENDIDOS FIJOS Y VOLÁTILES (SSF – SSV)

a. Después de la determinación de la concentración de sólidos suspendidos totales, colocar el conjunto en la mufla, a 550ºC por un tiempo suficiente hasta conseguir una masa constante (aproximadamente 15 minutos) y después de enfriar en desecador determinar la masa M6 en (mg).

b. Calcular SSF con la Ecuación 5 y SSV con la Ecuación 6

𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑓𝑖𝑗𝑜𝑠/𝐿 =(𝑀6−𝑀4)×1000000


20

𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑠ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑣𝑜𝑙á𝑡𝑖𝑙𝑒𝑠/𝐿 =(𝑀5−𝑀6)×1000000


V. DETERMINACIÓN DE SÓLIDOS DISUELTOS TOTALES, FIJOS Y VOLÁTILES (SDT, SDF Y SDV)

Los valores de las concentraciones de sólidos disueltos se pueden obtener por la diferencia entre las masas de los sólidos totales y de los sólidos suspendidos, considerando las respectivas fracciones (totales, fijos y volátiles) como se observa en la Figura 3.

ST = SST + SDT = SSV +SSF + SDV + SDF = SVT + SFT;

SVT = SSV + SDV y SFT = SSF + SDF;

SST = SSV + SSF y SDT = SDV + SDF;

Figura 3. Clasificación de los sólidos

Sólidos Totales (ST)

Sólidos Suspendidos Totales (SST) Sólidos Disueltos Totales (SDT)

Sólidos Suspendidos

Fijos (SSF)

Sólidos Disueltos

Volátiles (SDV)

Sólidos Disueltos

Fijos (SDF)

Sólidos Fijos Totales (SFT)

Sólidos Suspendidos

Volátiles (SSV)

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ANÁLISIS QUÍMICOS

3. ALCALINIDAD Y ÁCIDOS VOLÁTILES TOTALES – MÉTODO Nº 2320

A. CONCEPTO

La alcalinidad de un agua es su capacidad de neutralizar ácidos. Las sustancias más comúnmente encontradas en aguas superficiales causadoras de alcalinidad son los carbonatos (CO3

-2), bicarbonatos (HCO3-) e hidróxidos (OH-). No obstante, algunas sales de

ácidos débiles como boratos, silicatos, nitratos y fosfatos pueden también contribuir a la alcalinidad de estar también presentes. Estos iones negativos en solución están comúnmente asociados con iones positivos de calcio, magnesio, potasio, sodio y otros cationes. El bicarbonato constituye la forma química de mayor contribución a la alcalinidad. Dicha especie iónica y el hidróxido son particularmente importantes cuando hay gran actividad fotosintética de algas o cuando hay descargas industriales en un cuerpo de agua (APHA, 2005).

La alcalinidad se expresa como la concentración equivalentes de iones hidroxilo, mg/l o como la cantidad equivalente de CaCO3 en mg/l.


Los iones relacionados a la alcalinidad presentes en una muestra como resultado de la disociación o la hidrólisis de solutos, reacciona con la adición de un ácido patrón. La alcalinidad como la acidez depende del valor del punto final del pH fijado.


Medidor de pH, precisión ± 0.01

Buretas digitales o vidrio, 10, 25mL

Pipeta volumétrica

Beaker, 80mL

Centrífuga

Ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, p. a.

Hidróxido de Sodio (NaOH) en lentejas, p. a.

E. PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Solución normalizada de Ácido sulfúrico (H2SO4) 0.05N

Pipetear 1,375 mL (1375µl) de H2SO4 concentrado y transferir lentamente a un balón volumétrico de 1L con agua destilada y completar el volumen del balón hasta aforo.

22

La normalización de la solución de H2SO4 se realiza con patrón primario de Tetra Borato de Sodio decahidratado (Bórax), Na2B4O7.10H2O.

La normalización debe ser hecha por triplicado, con masas conocidas del patrón en torno de 0,1900 g, disueltas en cerca de 50mL de agua destilada. Se deben usar 2 gotas de solución de azul de bromotinol como indicador de punto final (color amarillo) o metil naranja hasta un punto final incoloro, el cálculo de la concentración normalizada es:

Teniendo en cuenta que 0.5N=1M se multiplica el valor por dos para obtener el valor en N.

Solución normalizada de Hidróxido de sodio (NaOH) 0.02N

En un beaker limpio disolver 0.8 g de NaOH con agua destilada. Dejar enfriar y transferir la solución cuantitativamente para el balón volumétrico de 1000 ml. Completar el volumen del balón hasta la marca con agua destilada, agitar para homogenizar y transferir para la bureta.

La solución de NaOH es inestable: la reacción con CO2 atmosférico exige normalización semanal.

La normalización de NaOH debe ser hecha utilizando como patrón primario Biftalato Ácido de Potasio (KPH).

El KPH se debe secar previamente en el horno a 120 ºC, por 24 horas y enfriar en desecador. La normalización deber ser realizada por triplicado. Se deben determinar masas de KPH próximas de 0,1022 g para normalidades menores o iguales de 0.05N pesar 0,01022g, y debe anotarse el valor exacto de cada una. Posteriormente, se disuelven en cerca de 25 ml de agua destilada, en frascos erlenmeyer.

En los frascos erlenmeyer que contienen la solución de KPH, adicionar 2 gotas de solución de fenolftaleína, trabajar en fondo blanco, luego entonces, adicionar la solución de NaOH hasta alcanzar una leve coloración rosada que persista, anotar cada volumen.

42,381)(

1000)(

4242 xmLSOvolumenH

boraxxgmasaM SOH

23

La molaridad o normalidad de la solución normalizada se calcula con la ecuación 7:

22,204

1000)(

xvolumeNaOH

xgmassaKPHM NaOH Ecuación 7

La solución del indicador de fenolftaleína se prepara, disolviéndose 80 mg de fenolftaleína en 60 ml de Etanol p.a., y completar con agua destilada hasta 100 ml en un balón volumétrico

NOTA: Cuando el indicador es la solución de fenolftaleína se tiene una solución trasparente para la región ácida y rosa en la región alcalina.

F. PROCEDIMIENTO

G. Calibración medidor de pH

Calibrar el medidor de pH marca Schott con las soluciones buffer de pH 7,0 y 4,0 a temperatura ambiente. De la siguiente manera.

a. Lavar la sonda (sensor) y secarlo. b. Presionar la tecla Cal en modo Ct 1 y sumergir en la solución buffer de pH 7,0. c. Presionar la tecla run/enter en modo Ct 1 AR parpadea y esperar a que se

estabilice el valor de milivoltaje (el valor es estable cuando aparece modo Ct 2). d. Lavar la sonda (sensor) y secarlo. e. Sumergir la sonda en la solución buffer de pH 4,0. f. Presionar la tecla run/enter AR parpadea y esperar a que se estabilice el valor de

milivoltaje. g. Presionar la tecla pH.

Calibrar el medidor de pH marca Ezoda PL-700AL con las soluciones buffer de pH 7,0 y 4,0 a temperatura ambiente. De la siguiente manera.

a. Asegurarse que el sensor es el electrodo de pH. Este equipo es multiparamétrico y hay sensores de oxígeno disuelto y conductividad.

b. Sumergir el electrodo dentro de la solución buffer pH 7.00. Agitar suavemente y esperar hasta que la lectura sea estable. Presionar y mantener la tecla ѻ/CAL por 3 segundos. Aparecerá en la pantalla CAL y parpadea el valor 7.00. cuando la pantalla deje de parpadear e indique “SA”, luego “END” mientras la calibración termina, y regresara al modo de medición.

c. Enjuagar el electrodo con agua limpia y secarlo con un paño seco o con papel scott. Sumergir el electrodo dentro de la solución buffer pH 4.00 como en los pasos anteriores

24

d. Después de la calibración realizada con el buffer pH 4.00, la pantalla indicara el porcentaje de pendiente (PTS) para mostrar el estado del electrodo. Si el PTS está por debajo de 70% o por encima de 130%, el electrodo debe ser sustituido. Una pendiente con un valor 100% es Lo ideal. NOTA:

a. Aparecerá el icono indicador de error de calibración, y “Err” en lugar de “SA”, si la calibración fallo.

b. Al hacer 2 o 3 puntos de calibración, calibrar primero con el buffer para pH 7 y en seguida con el buffer para el pH 4 0 10.

c. Calibración del pH tipo “USA” o “NIST” se puede cambiar en la configuración avanzada.

d. Los puntos de calibración de “USA” son 1.68, 4.01, 7.00, 10.01 y 12.45. e. Los puntos de calibración de “NIST” son 1.68, 4.01, 6.86, 9.18 y 12.45

NOTA PARA TODOS LOS USUARIOS

*El agitador del medidor de pH solo se puede usar con beaker o Erlenmeyer con capacidad hasta de 1000ml.

I. ALCALINIDAD PARCIAL

a. Filtrar aproximadamente 60 ml de la muestra en el sistema de filtración. La filtración se puede obviar si la muestra no presenta un contenido considerable de sólidos en suspensión.

b. Homogenizar el contenido del frasco de la muestra. c. Medir 50mL de la muestra y transferir para un beaker de 100mL. d. Colocar una barra magnética y acomodar el beaker en un agitador magnético. e. Introducir el electrodo del potenciómetro en el contenido del beaker y dejar en

agitación. f. Esperar hasta que se estabilice el pH original de la muestra. g. Iniciar la titulación con la solución normalizada de H2SO4 0,05N hasta que se

obtenga un pH de 5.75 y anotar el volumen gastado (V1).

II. ALCALINIDAD TOTAL

a. Continuar titulando hasta un pH de 4.3, el volumen gastado (V2) es el volumen total y con este se calcula la alcalinidad total.

III. ÁCIDOS VOLÁTILES TOTALES

a. Al terminar el ensayo de alcalinidad en pH 4,3 bajar el pH hasta 3,0 con H2SO4 sin contabilizar el volumen gastado.

25

b. Agregar pocas perlas de vidrio y calentar en una plancha de calentamiento hasta que salga vapor y dejar por 3min, hacer esto en un lugar aireado preferiblemente con campana extractora y no aspirar los vapores.

c. Dejar enfriar en un lugar y luego subir el pH hasta 4,0 con solución normalizada 0,02N de NaOH, colocar en cero la bureta y titular el volumen gastado de un ph 4,0 hasta pH 7,0.

H. CÁLCULOS

I. ALCALINIDAD PARCIAL

𝐴𝑃 (𝑚𝑔𝐶𝑎𝐶𝑂3/𝐿) =𝑁𝐻ℎ2𝑆𝑂4×𝑉1𝐻ℎ2𝑆𝑂4

×50000

𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 , Ecuación 8

Donde:

N=Normalidad de H2SO4.

𝑉1𝐻2𝑆𝑂4=Volumen gastado en la titulación de H2SO4 (ml)

𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=Volumen de muestra, (ml)

II. ALCALINIDAD TOTAL

𝐴𝑇(𝑚𝑔𝐶𝑎𝐶𝑂3/𝐿) =𝑁𝐻2𝑆𝑂4×𝑉2𝐻2𝑆𝑂4

×50000

𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎, Ecuación 9

Donde:

N=Normalidad de H2SO4

𝑉2𝐻2𝑆𝑂4 =Volumen gastado en la titulación de H2SO4,(ml)

𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎=Volumen de muestra, (ml)

III. ALCALINIDAD INTEMEDIA

𝐴𝐼 (𝑚𝑔𝐶𝑎𝐶𝑂3/𝐿) = 𝐴𝑙𝑐𝑎𝑙𝑖𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 𝐴𝑙𝑐𝑎𝑙𝑖𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑝𝑎𝑟𝑐𝑖𝑎𝑙, Ecuación 10

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IV. ÁCIDOS VOLÁTILES TOTALES

𝐴𝑉𝑇(𝑚𝑔𝐻𝐴𝑐/𝐿) =𝑉𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜𝑁𝑁𝑎𝑂𝐻×60000

𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎, Ecuación 11

Donde:

Vtitulado= Volumen de la muestra titulada, (ml)

NNaOH = Normalidad del Hidróxido de Sodio

Vmuestra = Volumen de la muestra, (ml)

4. DUREZA

A. CONCEPTO

La dureza es una propiedad química del agua caracterizada por la presencia de carbonatos, bicarbonatos, cloruros, sulfatos y ocasionalmente nitratos de calcio y magnesio. Desde el punto de vista doméstico e industrial, la dureza es indeseable, en procesos como el lavado de ropa, pisos y losa, además de algunos procesos industriales de limpieza, puesto que genera un mayor consumo de jabón, al producirse sales insolubles. En calderas y sistemas enfriados por agua, se producen incrustaciones en las tuberías y una pérdida en la eficiencia de la transferencia de calor. Importantes concentraciones de dureza son indeseables y deben ser removidas antes de que el agua tenga uso apropiado para las industrias de bebidas, lavanderías, acabados metálicos, teñidos y textiles. Igualmente adiciona un sabor indeseable al agua potable, por lo tanto en este sentido, más que un parámetro de riesgo potencial, representa un parámetro de calidad del recurso. La mayoría de los suministros de agua potable tienen un promedio de 250 mg/l de dureza. Niveles superiores a 500 mg/l son indeseables para uso doméstico. La dureza es caracterizada comúnmente por el contenido de calcio y magnesio y expresada como carbonato de calcio equivalente. Es importante aclarar que existen dos tipos de dureza:

Dureza Temporal o Cálcica: La cual está determinada por el contenido de carbonatos y bicarbonatos de calcio y magnesio. Esta puede ser eliminada mediante ebullición del agua y posterior eliminación de precipitados formados por filtración.

Dureza Permanente o Total: Está determinada por todas las sales de calcio y magnesio excepto carbonatos y bicarbonatos. No puede ser eliminada por ebullición del agua.

B. MATERIALES

2 Erlenmeyer de 250ml

1 Beaker de 250ml

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Probeta aforada de 50ml

Goteros

Bureta dosificadora

Agua destilada

Plancha agitadora

Barra magnética

C. REACTIVOS

Solución Buffer pH=10 (Disolver 6.56 gr. de NH4Cl y 57 ml de NH4OH en agua destilada y aforar a 100 ml.)

Solución Buffer pH=12

Solución indicadora Negro de Ericromo (Disolver 0.5 g de Eriocromo negro T y 4.5 gr de clorhidrato de hidroxilamina en 100 ml de etanol).

Solución indicadora Murexide

Solución Titulante EDTA (Disolver 2 gr de EDTA (sal disódica) más 0.05 gr de MgCl2.6H2O en agua destilada y aforar a 1000 ml).

D. PROCEDIMIENTO

I. Dureza Total

a. Preparar 50ml la muestra a evaluar, depositándola en el respectivo erlenmeyer, además introduciendo la barra magnética y poniendo este conjunto sobre la plancha, para comenzar con la agitación.

b. A continuación, colocar 10 gotas de solución Buffer pH=10, en el erlenmeyer. c. Adicionar 3 gotas de solución indicadora Negro de Ericromo. d. Finalmente, realizar la titulación con solución titulante EDTA, desde el color

morado hasta un tono azul, donde se realiza la respectiva lectura de EDTA, empleado.

II. Dureza Cálcica

I. Se prepara la muestra de 50ml, tal y como se presentó en el ítem 1, de la dureza

total. II. Luego, se agregan 12 gotas de solución Buffer pH=12, en el erlenmeyer. III. Introducir 5 gotas de solución indicadora Murexide. IV. Titular con solución titulante EDTA, desde el color rosado hasta violeta,

momento en el que se realiza la medición de EDTA, gastado.

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Nota: Antes de empezar el ensayo, se debe preparar el montaje, el cual consiste en la plancha y la barra agitadora, además de la bureta para adicionar EDTA.

E. CALCULOS

𝑚𝑔

𝑙𝑑𝑒 𝐶𝑎𝐶𝑂3 =

𝑉𝑥𝑁𝑥50000

𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎, Ecuacion 12

Donde:

V=ml Gastados de EDTA, N=Normalidad del EDTA

5. REQUERIMIENTO EN DEMANDA OXIDANTE – MÉTODO Nº 2350

A. CONCEPTO

Los oxidantes se adicionan al agua potable y al agua residual para desinfectar. Otro beneficio incluye remoción de limos, la oxidación de especies inorgánicas no deseables (e.g. iones de hierro, reducción de manganeso, sulfuros, y amonio) y la oxidación de constituyentes orgánicos (e.g. compuestos productores de olor y sabor). La demanda oxidante se refiere a la diferencia entre la dosis oxidante agregada y la concentración oxidante residual medida después de un tiempo de contacto prescrito a un pH y temperatura dado.

La demanda oxidante y los requerimientos de oxidación están significativamente afectados por las características físicas y químicas de la muestra y la manera en la cual se mide el consumo del oxidante. Particularmente, la reactividad oxidante está influenciada por la temperatura, el pH, el tiempo de contacto, y la dosis oxidante. La temperatura de la muestra afecta fuertemente las reacciones cinéticas y por ende la demanda a un tiempo de contacto dado. El pH de la muestra afecta la forma y naturaleza del oxidante y el grado de demanda. El ozono es inestable a valores de pH muy altos y la demanda de ozono es especialmente sensible al pH de la muestra. La demanda oxidante incrementa con el tiempo y por lo tanto la demanda debe ser definida para un tiempo de contacto dado. La demanda oxidante también es independiente de la dosis oxidante pues al incrementar la dosis oxidante usualmente se incrementa la demanda, pero es incorrecto que al duplicar la dosis oxidante se duplicará la demanda oxidante.


Este método semi-batch involucra la determinación de la demanda de ozono con una adición continúa de ozono gaseoso al reactor batch. Los resultados obtenidos de este método dependen de la transferencia de masa y las características del reactor. En adición, algunos componentes que consumen el ozono se pueden volatilizar durante el ensayo.

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Generador de ozono capaz de proveer por encima del 5% de ozono gaseoso.

Botellas limpiadoras de gas, vidrio de borosilicato, con un volumen mínimo 250ml.

Tubos, únicamente se deben usar tubos sin metal o un tubo TFE.

Vidriería: bureta de 50ml; beaker de 400ml; cilindro graduado de 250ml.

Botella de lavado 500ml.

Agitador magnético (opcional).

Balanza analítica.

D. REACTIVOS

Agua libre de demanda de ozono.

Ácido sulfúrico H2SO4.

Yoduro de potasio.

Tiosulfato de sodio titulante normalizado Na2S2O3 0.1N

Tiosulfato de sodio titulante normalizado Na2S2O3 0.05N

Solución indicadora de almidón

E. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Ácido sulfúrico H2SO4 2N:

Con precaución adicionar 56mL concentrado de H2SO4 a 800mL de agua libre de demanda de ozono en un frasco volumétrico de 1L. Mezclar a fondo y adicionar hasta la marca con agua libre de demanda de ozono.

Yoduro de potasio (2%) KI:

Disolver 20 g de KI en 800mL de agua libre de demanda de ozono en un beaker y agitar por 1minuto, transferir la mezcla a un balón volumétrico de 1000mL y llenar hasta el aforo con agua libre de demanda de ozono.

Tiosulfato de sodio titulante estándar Na2S2O3 0.1N:

Disolver 25 g de Na2S2O3 * 5H2O en 1L de agua destilada hervida fresca, almacenar por 24h y normalizar contra el bi-yodato de potasio o con dicromato de potasio después de dos semanas de almacenamiento. Este almacenamiento inicial es necesario para permitir la oxidación de cualquier ion de bisulfito presente. Para minimizar la descomposición bacteriana adiciona agua destilada hervida y adiciona unos mililitros de cloroformo (CHCL3).

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Tiosulfato de sodio titulante estándar Na2S2O3 0.005N:

Diluir 50mL de la solución de Tiosulfato de sodio 0.1N Na2S2O3 en un 1L de agua destilada.

Normalización del Tiosulfato de Sodio

Método del Yodato: Disolver 3.249g de Bioyodato de Potasio anhidro KH (IO3)2 o Yodato de Potasio KIO3 seco a 103ºC por 1h en 1L de agua destilada para mantener 0.1N.

En 80mL de agua destilada adicione en constante agitación 1mL de H2SO4concentrado, 10,0mL de 0.1N de KH (IO3)2 y 1g de KI. Titular inmediatamente con tiosulfato de sodio 0.1N, antes de que el color amarillo desaparezca adicione 1mL de la solución del almidón y continúe titulando hasta que el color azul desaparezca. Calcule la normalidad con la ecuación 13:

𝑁𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 =1

𝑚𝐿𝑁𝑎2 𝑆2 𝑂3 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜 , Ecuación 13

Solución indicadora de almidón:

1. Disolver 2g de almidón en 100ml de agua destilada caliente, adicionar 0.2g de ácido salicílico y dejar enfriar.

F. PROCEDIMIENTO

1. Determina la salida del generador de ozono pasando el ozono en fase gaseosa a través de KI (2%) por unos 10 minutos. La solución de KI se mantiene en un recipiente aforado con volumen conocido (mínimo 200mL).

2. Transferir cuantitativamente muestras del recipiente ozonizado en un beaker, y titular con 0.1N Na2S2O3 normalizado hasta que el color amarillo del yodo haya casi desaparecido.

3. Adiciona de 1 a 2ml de solución indicadora de almidón y continuar titulando hasta que desaparezca el color azul.

G. CÁLCULOS

Cálculo de ozono residual:

Ozono residual,(mg O3)

min=

𝑉×𝑁×𝑒𝑞

t Ecuacion 14

Donde:

V =Volumen gastado en la titulación de sodio (ml).

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N= normalidad del Na2S2O3. =0.1N

eq = Numero del equivalente en gramos del Ozono = 24mg/m eq

t = Tiempo de ozonización (min)

I. Cálculo de la producción y dosis de ozono

P (g

h⁄ ) =𝑁∗ ∆∀∗VKI∗14.4

Vam∗t , Ecuación 15

∆∀ = Volumen de tiosulfato gastado en la titulación de la muestra menos volumen

gastado en la titulación del blanco (ml).

VKI = Volumen de yoduro de potasio ozonizado (ml).

Vam = Volumen de la muestra de yoduro de potasio titulado (ml).

t = Tiempo de contacto (min)

N = Normalidad del tiosulfato de sodio, preferible 0.025N normalizada.

Dosis aplicada (𝑫𝒂𝒑)

(𝐷𝑎𝑝) =𝑃 ∗ 𝑡 ∗ 100

6 ∗ 𝑉 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 16

P = Producción de ozono en la columna de ozonización (g

h⁄ ).

t = Tiempo de contacto (min)

V = Volumen de agua ozonizada (ml)

𝐷𝑎𝑝 = Dosis aplicada de ozono 𝑚𝑔𝑂3

𝑙⁄

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Dosis efectiva

𝑫( 𝒎𝒈

𝒍⁄ ) = 𝐷𝑎𝑝(2) − 𝑂𝑧𝑜𝑛𝑜 𝑅𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑎𝑙 (𝑚𝑔

𝑙) , 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 |7

6. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE OZONO FASE LÍQUIDA (AccuVac) No. 454-456

El ozono es un oxidante y agente germicida de virus muy fuerte, el ozono se produce

cuando las moléculas de oxígeno (O2) son disociadas por medio de una fuente de energía

produciendo átomos de oxígeno que posteriormente chocan con una molécula de oxígeno

para formar un gas inestable, el ozono (O3), que se utiliza para desinfección de las aguas

residuales. La mayoría de las plantas de tratamiento de aguas residuales generan ozono

mediante la aplicación de una corriente alterna de alto voltaje (6 a 20 kilovoltios) a través

de una brecha entre placas dieléctricas de descarga en donde se encuentra un gas de

alimentación que contiene el oxígeno. El ozono es generado en la planta debido a que el

gas es inestable y se descompone en oxígeno elemental en un período corto de tiempo

luego de su generación.

A. PRINCIPIO DEL MÉTODO

B. EQUIPOS Y MATERIALES

Espectrofotómetro DR 5000

Beaker de plástico 50 ml (2)

C. REACTIVOS

Set de reactivos para determinar ozono marca HACH de acuerdo al rango: Bajo: 0–0.25 mg/L Medio: 0–0.75 mg/L 2 Alto: 0–1.50 mg/L

Agua destilada

D. PROCEDIMIENTO

a. Prender el equipo, 30. Min aproximadamente antes de la medición permitiendo que este se caliente

b. Seleccione “PROGRAMAS ALMACENADOS” y Seleccionar el programa de acuerdo al rango de medición seleccionado de la siguiente forma:

454 Rango Bajo

455 Rango Medio

33

456 Rango Alto

c. Presione “INICIO”. d. Inserte el Adaptador con el soporte circular Multi-cell de una pulgada en frente al

usuario, tal como se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Ubicación del adaptador de celdas.

e. Preparación de la muestra: En un beaker de 50 ml tomar 40 ml de muestra, tomada de la fase líquida de la aplicación del ozono

f. Inmediatamente tomada la muestra, sumerja el AccuVac y quiebre la parte aguda

en contra del fondo, espere mientras se llena la ampolla y selle con el tapón (Ver Figura 2).

Figura 2. Procedimiento ampolla AccuVac

g. Invierta rápidamente las ampollas para mezclar de forma homogénea.

h. Preparación en blanco: En un beaker de 50 ml tomar 40 ml de agua destilada, y repita los procedimientos anteriores.

i. Una vez colocada la celda que contiene el blanco en el espectrofotómetro y

seleccionados el programa, presione “ZERO”, el display debe indicar 0.00 mg/L O3.

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j. Insertar la celda que contiene la muestra y presionar “MEDICIÓN”, los resultados aparecen en mg/L O3.

E. CÁLCULOS

Los resultados se toman directamente del espectrofotómetro, si el resultado aparece fuera del rango asegurarse de realizar dilución. Si ha realizado diluciones de la muestra, tener en cuenta el factor de dilución para el cálculo final de la concentración de ozono.

7. CLORUROS – MÉTODO Nº 4500-Cl-

A. CONCEPTO

Los cloruros, en forma del ión cloruro (Cl-), son unos de los mayores aniones inorgánicos presentes en las aguas. En el agua potable, el sabor salado producido por la concentración de cloruros es variable e independiente de la composición química del agua. En algunas aguas que contienen 250 mg Cl-/l se puede detectar sabor salado si el catión es sodio. Por otro lado, el sabor salado típico puede estar ausente en aguas que contienen hasta 1000 mg/l cuando los cationes predominantes son calcio y magnesio.

La concentración de cloruros es mayor en aguas residuales que en agua cruda por causa del cloruro de sodio (NaCl) el cual es un elemento común de la dieta alimenticia y pasa a través del sistema digestivo sin cambios. A lo largo de las costas, los cloruros pueden estar en altas concentraciones por causa de la fuga del agua salada dentro de los sistemas de alcantarillado. Este también puede aumentar por procesos industriales.

Un alto contenido de cloruros puede dañar las tuberías metálicas y las estructuras, así como afectar el crecimiento de las plantas.


En una solución neutra o ligeramente alcalina, el cromato de potasio puede indicar el punto final de titulación del nitrato de plata de los cloruros. El cloruro de plata se precipita cuantitativamente antes de que se vuelva rojo el cromato de plata.


Frasco erlenmeyer, (250ml).

Bureta, (50ml).

Probeta, (100 ml).

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D. REACTIVOS

Solución indicadora de cromato de potasio.

Solución titulante de nitrato de plata estándar 0.0141N.

Cloruro de sodio estándar 0.0141N.


Solución indicadora de cromato de potasio

Disolver 50g de K2CrO4 en un litro de agua destilada. Adicionar solución de AgNO3 hasta que se forme un precipitado rojo. Esperar por 12h, filtrar y diluir a 1.0l con agua destilada.

Solución titulante estándar de nitrato de plata 0.0141N

Disolver 2395 g de AgNO3 en agua destilada y diluir hasta completar 1000 ml. Estandarizar con NaCl 0.0141 N; 1.00 ml = 500 µg Cl-. Almacenar en una botella café.

Cloruro de sodio estándar 0.0141 N

Disolver 824mg de NaCl (secados a 140ºC) en agua destilada y diluir a 1000ml; 1.00ml = 500µg Cl-.

F. PROCEDIMIENTO

a. Hacer un blanco por el método de titulación. No es usual un blanco de 0.2 a 0.3ml. b. Tomar 100 ml de muestra o una porción diluida a 100ml. c. Adicionar tres gotas de fenolftaleína. d. Ajustar el pH de la muestra entre 7 o 10 con H2SO4 o NaOH si no está en este

rango. e. Adicionar 1.0 ml de la solución indicadora de K2CrO4. f. Titular con la solución estándar de AgNO3 hasta obtener un color ladrillo.

36

Figura 3. Pasos 1 a 6

G. CÁLCULOS

𝑚𝑔 𝐶𝑙− 𝑙⁄ =(𝐴−𝐵)×𝑁×35450

𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎, Ecuación 18

Donde:

A = ml del titulante gastado para la muestra,

B = ml de titulante gastado para el blanco, y

N = Normalidad del AgNO3.

37

8. FÓSFORO – ORTOFOSFATOS (PO4-2) – MÉTODO Nº 4500-P

A. CONCEPTO

Los compuestos que contienen fósforo ocurren en aguas naturales y en efluentes (domésticos e industriales) en forma de fosfatos. Estas formas son clasificadas en: Orto fosfatos, fosfatos condensados (Poli fosfatos) y fosfatos orgánicos; pueden presentarse en forma de solución, de partículas o de desechos o en la constitución de organismo acuáticos. Los compuestos que contiene fosforo son esenciales para el crecimiento de organismos y pueden ser considerados como nutrientes que limitan la producción de nuevas células.


Es un método de reducción con cloruro estagnoso. El fosfato reacciona con el molibdato amónico y luego es reducido por el cloruro estagnoso para formar un complejo azul. Los resultados se expresan en (mg/L) de P.


Fotómetro: Espectrofotómetro.

Bomba de vacío.

Balanza Analítica.

Pipeta automática de 10ml.

Balones volumétricos de 100ml.

Pipetas automáticas de 200µL y 1000µl.

Campana de extracción.

Agitador magnético.

Beaker.

Barras agitadoras.

Perlas de vidrio.

Erlenmeyers.

D. REACTIVOS

Fenolftaleína.

Fosfato dihidrogeno de potasio (KH2PO4).

Ácido sulfúrico (H2SO4).

Persulfato de Potasio (K2S2O8).

Ácido Nítrico (HNO3).

Molibdato de amonio (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O.

Cloruro estagnosodihidratado (SnCl2.2H2O).

http://es.wikipedia.org/wiki/Potasio


http://es.wikipedia.org/wiki/Ox%C3%ADgeno

http://es.wikipedia.org/wiki/Hidronio


38

Glicerol (C3H8O3).

Hidróxido de sodio (NaOH).


Solución estándar de fosfato (KH2PO4):

Disolver 0.2195 g de Fosfato dihidrogeno de potasio (KH2PO4) en 1L de agua destilada.

Solución Ácido Sulfúrico (H2SO4) 1.59N:

Diluir 15mL de Ácido Sulfúrico (H2SO4) en 35mL de Agua destilada.

Acida Fuerte

En un balón volumétrico adicionar a 60mL de agua destilada 30ml de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4), 0.4mL de ácido Nítrico (HNO3) y llenar hasta 100ml con agua destilada.

Solución de Molibdato de amonio

Disuelva 25g de molibdato de amonio (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O.en 175ml de agua destilada.

En 400mL de agua destilada agregar 280mL de Ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, dejar enfriar y luego agregar la solución del paso 1.

Cloruro estagnoso

Disuelva 2.5g de Cloruro estagnosodihidratado (SnCl2.2H2O) en 100ml de glicerol (C3H8O3). Calentar la solución al baño maría y revolver con varilla de vidrio. Este reactivo es estable y no requiere preservativos ni almacenamiento especial.

Hidróxido de sodio (NaOH) 1N.

Disuelva 40g de Hidróxido de sodio (NaOH) en 1l de agua destilada.

F. PROCEDIMIENTO

DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACION

a. En un erlenmeyer adicionar el volumen de la solución estándar de fosfato determinada (Tabla1) y llenar hasta 50mL con agua destilada.

1ml de solución estándar P = 0.05mg P



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Tabla 1.Volúmenes de la solución estándar de fosforo para la curva de calibración

mg P ml (Sol. Estándar) mg P ml (Sol. Estándar)

0.00 0.0 0.20 4.0

0.01 0.2 0.25 5.0

0.05 1.0 0.30 6.0

0.08 1.6 0.40 8.0

0.10 2.0 0.50 10.0

0.15 3.0

b. Colocar en agitación y adicionar 2 gotas de fenolftaleína, 1mL de Solución Acido Sulfúrico (H2SO4), 0.5g de Persulfato de Potasio (K2S2O8) y 4 perlas de vidrio.

c. Llevar a digestión hasta que el volumen reduzca a 10mL y se deja enfriar. d. Agregar a cada erlenmeyer30mL de agua destilada y 2 gotas de fenolftaleína. e. Adicionar gotas de Hidróxido de sodio (NaOH) hasta que cambie a color rosado. f. Luego agregar acida fuerte hasta que el color rosado desaparezca. g. Transferir las soluciones a balones volumétricos de 100mL y llenar hasta el aforo

con agua destilada. h. Adicionar 4mL de Solución de Molibdato de amonio y 10 gotas de Cloruro

estagnoso. i. Después de 5 minutos medir la absorbancia con longitud de onda de 690nm.

Figura 1. Pasos 1 a 7




40

Tabla 2. Medida de absorbancia

CURVA DE CALIBRACION FOSFORO

mg P ml

(Sol.Estándar)

Abs.cm-1

(690nm)

mg P ml

(Sol.Estándar)

Abs.cm-1

(690nm)

0.00 0.0 0.000 0.20 4.0 0.160

0.01 0.2 0.039 0.25 5.0 0.250

0.05 1.0 0.045 0.30 6.0 0.300

0.08 1.6 0.055 0.40 8.0 0.400

0.10 2.0 0.085 0.50 10.0 0.600

0.15 3.0 0.140

Para la curva de calibración, dibujar la absorbancia medida en el eje de las abscisas, versus la cantidad de mg P/len el eje de las ordenadas y determinar la ecuación de la recta obtenida (Figura2).

Figura 2. Curva de calibración P, Absorbancia vs mgP

y = 0,8706x + 0,0213R² = 0,9713

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800

ABSORBANCIA (cm-1)

mgP

41

Determinación de concentración de fósforo

a. Se toma 50ml de la muestra y 50ml de agua destilada (Blanco) en dos erlenmeyers.

b. Colocar en agitación y adicionar 2 gotas de fenolftaleína, 1ml de Solución Ácido Sulfúrico (H2SO4), 0.5g de Persulfato de Potasio (K2S2O8) y 4 perlas de vidrio.

c. Llevar a digestión hasta que el volumen reduzca a 10ml y se deja enfriar. d. Agregar a cada erlenmeyer30ml de agua destilada y 2 gotas de fenolftaleína. e. Adicionar gotas de Hidróxido de sodio (NaOH) hasta que cambie a color rosado. f. Luego agregar acida fuerte hasta que el color rosado desaparezca. g. Transferir las soluciones a balones volumétricos de 100ml y llenar hasta el

aforo con agua destilada. h. A cada muestra se le adicionar 4ml de Solución de Molibdato de amonio y 10

gotas de Cloruro estagnoso (al blanco no se le agrega Cloruro estagnoso) i. Después de 5 minutos medir la absorbancia con longitud de onda de 690nm. j. Llevar el valor de la diferencia a la curva para encontrar la concentración de

sulfatos.

*Tener en cuenta que la curva cambia constantemente por lo tanto preguntar la curva actualizada a la hora de realizar el ensayo.

G. CALCULOS

CONCENTRACIÓN DE FÓSFORO

Con el valor obtenido de concentración de fósforo (P) en la curva calcular:

𝑚𝑔𝑃𝑂4

𝑙=

((𝑚𝑔𝑃) × 1000)

𝑉𝑚, 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 19

mgP=Valor encontrado de la concentración de fósforo P en la curva de calibración.

Vm= Volumen de la muestra, (ml).




42

8 A. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE FOSFORO- UTILIZANDO EL ESPECTOFOTOMETRO DR 5000


Los fosfatos y compuestos de fósforo se encuentran en las aguas naturales en pequeñas concentraciones. Los compuestos de fosforo que se encuentran en las aguas residuales o se vierten directamente a las aguas superficiales provienen de fertilizantes eliminados del suelo por el agua o el viento; excreciones humanas y animales; y detergentes y productos de limpieza.

Los compuestos del fósforo (particularmente el orto-fosfato) se consideran importantes nutrientes de las plantas, y conducen al crecimiento de algas en las aguas superficiales, pudiendo llegar a promover la eutrofización de las aguas.

La concentración de fosfatos en un agua natural es fundamental para evaluar el riesgo de eutrofización. Este elemento suele ser el factor limitante en los ecosistemas para el crecimiento de los vegetales, y un gran aumento de su concentración puede provocar la eutrofización de las aguas. Así, Los fosfatos están directamente relacionados con la eutrofización de ríos, pero especialmente de lagos y embalses. En lo referente a las aguas de consumo humano, un contenido elevado modifica las características organolépticas y dificulta la floculación - coagulación en las plantas de tratamiento.


Pipeta 1.0 a 10.0 ml

Pipeta 100 a 1000 μl

2 Celdas de vidrio - capacidad 10 ml

Espectrofotómetro

C. REACTIVOS

Reactivo molibdovanadato

Agua destilada

D. PROCEDIMIENTO

a. Seleccionar la prueba 480 en el espectrofotómetro DR 5000.

b. Inserte el Adaptador Multi-cell con 1 pulgada frente el usuario.

43

c. Preparación en blanco: Llenar una de las celdas con 10 ml de agua destilada, preferiblemente con la pipeta (1 a 10 ml) para mayor precisión.

d. Ejemplo de preparación: Llenar la segunda celda con 10 ml de muestra,

preferiblemente con la pipeta (1 a 10 ml) para mayor precisión.

Figura 1. Procedimiento espectrofotómetro

e. Añadir 0,5 ml del reactivo molibdovanadato para cada muestra de las celdas

utilizando la pipeta (100 a 1000 μl). Agite para mezclar.

f. Pulse el icono TIEMPO> OK. Un período de reacción de 7 minutos comenzará. Si la concentración de la muestra es mayor que 30 mg / L PO4-3, leer exactamente siete minutos, o hacer una dilución de la muestra y repita la prueba.

g. Cuando el temporizador expira, limpiar la primera celda del agua destilada e

insertar de tal forma que la línea de llenado quede de frente al usuario. Pulse la tecla CERO. La pantalla mostrará: 0,0 mg / L PO4-3

h. Limpiar la segunda celda con la muestra e insertar de tal forma que la línea de

llenado quede de frente al usuario. Pulse la tecla MEDICIÓN. La pantalla mostrará el valor en mg /L PO4-3

44

Figura 2. Procedimiento espectrofotómetro

E. CÁLCULOS

Los resultados se toman directamente del espectrofotómetro, si el resultado aparece fuera del rango asegurarse de realizar dilución. Si ha realizado diluciones de la muestra, tener en cuenta el factor de dilución para el cálculo final de la concentración de fosforo.

9. SULFATOS – MÉTODO Nº 4500-SO42-

A. CONCEPTO

Los sulfatos (SO42-) están altamente distribuidos en la naturaleza y pueden estar presentes

en el agua en concentraciones que varían de pocos a cientos de miles de miligramos por litro. Los residuos del drenaje de la minería pueden contribuir con grandes cantidades de SO4

2- a través de la oxidación de la pirita.


El Ion sulfato (SO42-) es precipitado en un medio de ácido acético con cloruro de Bario

(BaCl2) para formar sulfato de bario (BaSO4) en cristales de tamaño uniforme. La luz de absorbancia del (BaSO4) es medida por un fotómetro y la concentración de sulfato (SO4

2-) es determinada por la comparación de la lectura en la curva de calibración.


Fotómetro: Espectrofotómetro.

Bomba de vacío.

Balanza Analítica.

Pipeta automática de 10ml.

Balones volumétricos de 100ml.

Pipetas automáticas de 200µl y 1000µl.


Agitador magnético.

45

D. REACTIVOS

Sulfato de Sodio (Na2SO4).

Cloruro de Magnesio (MgCl2).

Acetato de Sodio (CH3COONa).

Nitrato de potasio (KNO3).

Ácido acético (CH3-COOH) (C2H4O2).

Cloruro de Bario (BaCl2).

E. PREPARACION DE REACTIVOS

Solución estándar de sulfato:

Disolver 0.1479 g de Sulfato de Sodio (Na2SO4) en 1l de agua destilada.

Solución Buffer:

Disolver 30g de Cloruro de Magnesio (MgCl2), 5g Acetato de Sodio (CH3COONa), 1g de Nitrato de potasio (KNO3) y 20ml de Ácido acético (CH3-COOH (C2H4O2).en 500ml de agua y completar a 1l en un balón volumétrico.

F. PROCEDIMIENTO


a. En un erlenmeyer adicionar el volumen de la solución estándar determinada (Tabla 3) y completar a 100mL con agua destilada.

1ml de solución estándar de sulfato = 0.1mg SO2

Tabla 3. Volúmenes de la solución estándar de sulfatos para la curva de calibración

http://es.wikipedia.org/wiki/Carbono












46

mg SO4 ml

(Sol.Estándar)

mg SO4 ml

(Sol.Estándar)

0.0 0 2.0 20

0.1 1 2.5 25

0.5 5 3.0 30

1.0 10 3.5 35

1.5 15 4.0 40

b. Colocar en agitación y adicionar 20ml de solución buffer por 1 minuto, durante la agitación añadir 1g de Cloruro de Bario (BaCl2) y se deja agitar por 1 minuto.

c. Después de 5 minutos medir la absorbancia y la turbidez.

Tabla 4. Medida de la absorbancia y turbidez.

Absorbancia Turbidez mgSO4

0,025 0,3 0

0,03 4 1 0,035 42,5 5 0,045 55 10 0,07 78 15

0,165 110 20 0,19 120 25

0,235 140 30 0,29 145 35

0,32 160 40

Para la curva de calibración, dibujar la absorbancia media en el eje de las abscisas, versus la cantidad de mgSO4 en el eje de las ordenadas y determinar la ecuación de la recta obtenida (Figura 1).

47

Figura 1. Curva de calibración SO4, absorbancia vs mgSO4

DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN DE SULFATOS

a. Se toman 100mL de la muestra en dos erlenmeyer más el blanco. b. Se agrega 20mL de buffer a las muestras y agitar por 1 minuto. c. A una de las muestras agregar 1g Cloruro de Bario (BaCl2) agitar por 1 minuto y

dejar en reposo por 5 minutos. d. Calibrar el espectrofotómetro a 420nm con la muestra del blanco o calibrar el

turbidímetro con los patrones según sea el caso. e. Medir a la muestra que tiene solo buffer la absorbancia o turbidez (Lectura

inicial). f. A la muestra con Cloruro de Bario (BaCl2) medir la absorbancia o turbidez

(Lectura final). g. Hacer diferencia de absorbancias.

∆= (𝐿𝑓 − 𝐿𝑖)

h. Llevar el valor de la diferencia a la curva para encontrar la concentración de sulfatos.

*Tener en cuenta que la curva cambia constantemente por lo tanto preguntar la curva actualizada a la hora de realizar el ensayo.

G. CALCULOS

CONCENTRACIÓN DE SULFATOS

y = 122,1x + 0,945R² = 0,958

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35

mg

SO

4

Absorbancia cm-1

48

Con el valor obtenido de concentración de sulfatos (SO4) en la curva calcular:

𝑚𝑔𝑆𝑂4

𝑙=

((𝑚𝑔𝑆𝑂4) × 1000)

𝑉𝑚, 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 20

mgSO4=Valor encontrado de la Concentración de sulfatos SO4 en la curva de calibración.

Vm= Volumen de la muestra, (ml).

49

10. NITRÓGENO – MÉTODO Nº 4500-Norg

A. CONCEPTO

El Nitrógeno es uno de los nutrientes de mayor importancia en el vertido de las aguas residuales tratadas. Un agua que contenga gran cantidad de nitrógeno acelerará la eutrofización de embalses, ríos y lagos, y puede provocar el estímulo del crecimiento de algas y plantas en cursos de agua poco profundos. La reducción de la concentración de oxígeno disuelto en las aguas receptoras y la toxicidad para la vida acuática son algunos de los efectos negativos de la elevada concentración de nitrógeno amoniacal en efluentes tratados.

El análisis de este ensayo suele determinar el NTK (Nitrógeno Total Kjeldahl) que incluye el nitrógeno orgánico y el amoniacal.


La suma de amonio libre y compuestos orgánicos nitrogenados que son convertidos a una sal de amonio (NH4)2SO4 después de la digestión de la muestra en medio ácido y en presencia de un catalizador. El amonio es destilado en medio alcalino y recuperado nuevamente para su cuantificación.

La presencia de ácido sulfúrico (H2SO4), sulfato de potasio (K2SO4), y sulfato de cobre (CuSO4), como catalizador, convierten el nitrógeno amonio de cualquier material orgánico a amonio. El amoniaco liberado también es convertido a amonio, después se adiciona base y el amoniaco es destilado del medio alcalino y absorbido en ácido bórico o sulfúrico. El amonio liberado es determinado titulando con una solución estándar de ácido sulfúrico (H2SO4). Los resultados se expresan en mgNT /L.


Equipo de digestión con sistema de recolección de gases (Digestor y Scrubber).

Equipo de destilación con flujo de vapor.

Equipo titulador.

Potenciómetro.

Erlenmeyer de 250 ml.

Vasos de precipitado.

Tubos de ensayo para nitrógeno (para digestor y destilador).

50

D. PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Hidróxido de Sodio 6N (NaOH):

Diluir 320g en agua destilada y completar 1l.

Solución de Ácido Bórico:

Disolver 20g de reactivo analítico en agua y diluir a 1l.

Solución indicadora de ácido bórico:

Disolver 20g de H3BO3 en agua, agregar 10ml de la solución indicadora mixta y diluir a 1l. Preparar mensualmente.

Solución indicadora mixta:

Disolver 200mg de indicador rojo de metilo en 100ml de alcohol etílico del 95%. Disolver 100mg de azul de metileno en 50ml de alcohol etílico del 95%. Combinar las soluciones. Preparar mensualmente.

Solución de ácido sulfúrico (H2SO4) al 0.02N para titulación:

Diluir 3ml de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado en 1l con agua destilada libre de CO2.Luego diluir 200ml de esta solución a 1l con agua destilada. Normalizar el ácido 0.02N contra una solución de Na2CO3 0.02N (1.060g de Na2CO3 anhidro secado a 140ºC, diluido a 1000ml con agua destilada).

E. PROCEDIMIENTO

Volumen de la muestra

a. El volumen de la muestra es 25ml. Para casos particulares de muestras líquidas se puede seguir lo que indica la Tabla 5.

51

Tabla 5. Medida de la absorbancia y turbidez.

Nitrógeno Orgánico en la muestra, mg/l Volumen de muestra, ml

4-40 50

8-80 25

20-200 10

b. Para muestras de lodos y sedimentos, pesar una porción de muestra húmeda que contenga entre 0.2mg y 2mg de nitrógeno orgánico. Transferir la muestra al tubo de digestión limpiando el recipiente de pesaje varias veces con pequeñas cantidades de agua. Hacer esta operación con la cantidad más pequeña posible de agua, sin exceder un volumen de 50ml.

Digestión

a. Encender el digestor y scrubber 15min antes de iniciar el ensayo y limpiarlos. En el tubo agregar: 25ml de la muestra, 15ml de ácido sulfúrico (H2SO4), 3,0g de Sulfato de Potasio, 1,0g de Sulfato de cobre.

b. Colocar el digestor en 60ºC-80ºC (temperatura). Colocar la “Flauta” (tapa del digestor para desviar los gases) y conectar la manguera de la “flauta” al scrubber.

c. Dejar en digestión aproximadamente 2 horas o hasta que las muestras tengan un color azul claro.

d. Al alcanzar ese color se apaga el digestor y se deja enfriar 30min con el scrubber prendido.

Destilación

a. Encender la unidad de destilación hasta que caliente (aproximadamente 15min). b. Transferir las muestras frías de los tubos de digestión a los tubos de destilación con

mucho cuidado. c. Agregar a los tubos poco a poco 30ml de agua destilada y agregar Hidróxido de

Sodio 6N (NaOH) con la válvula dosificadora hasta obtener un colar café. d. En los frascos erlenmeyers que recibirán el destilado adicionar 100ml de ácido

bórico al 2% y de 3 a 4 gotas de indicador mixto. e. Destilar entre 150-250mL en los erlenmeyer.

52

Titulación

Tomar los erlenmeyers y titular entre 150-250mL de destilación con ácido sulfúrico H2SO40.02N hasta llegar al color rosado.

F. CÁLCULOS

𝑚𝑔𝑁

𝑙=

(V(H2SO4) − VBlanco) × 280

Vm

Donde:

V(H2SO4).= Volumen gastado de H2SO4en la muestra,(ml).

VBlanco= Volumen gastado de H2SO4en el blanco, (ml).

Vm= Volumen inicial de la muestra, (ml).

10 A. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE NITROGENO TOTAL (2 a 150 mg/L N), MÉTODO DIGESTIÓN DE PERSULFATO

A.PRINCIPIO DEL MÉTODO

El nitrógeno es uno de los constituyentes de la materia orgánica que forma parte de las proteínas de las células y es indispensable en el crecimiento de los organismos fotosintéticos. En la química del agua, los compuestos de nitrógeno, NH4+, NO2-, NO3-, así como el nitrógeno orgánico, juegan un papel importante, ya que son indispensables para el desarrollo de la vida animal y vegetal en agua.

Los compuestos nitrogenados del agua provienen fundamentalmente de los compuestos orgánicos o vegetales y en aguas naturales y sin contaminar suele ser un elemento poco abundante. La mayor parte del nitrógeno es de origen atmosférico, pero asimilado gracias a las bacterias y a ciertos vegetales, los cuales transforman el nitrógeno molecular y el nitrógeno nítrico en nitrógeno orgánico.


Digestor a 105°C


Gradilla para tubos

Embudo


53

C. REACTIVOS

Viales Total Nitrógeno (TN)- Hidróxido

Reactivo Persulfato TN

Viales ácidos TN (Reactivo C)

Reactivo A TN

Reactivo B TN

Agua ultrapura

D. PROCEDIMIENTO

a. Encienda el digestor a una temperatura de 105 ° C. b. Etiquetar dos tubos de digestión Hidróxido- Total Nitrógeno del set de tubos

número 40, uno para la muestra y otro para el blanco. Usando un embudo, añadir el contenido del Reactivo de Persulfato - Total Nitrógeno a cada uno de los tubos. Limpie el reactivo que puede quedar en la tapa o en la rosca del tubo.

c. Añadir 0,5 ml de muestra a un tubo (use la muestra preparada) y añadir 0,5 ml de agua desionizada al segundo tubo (use el agua desionizada proporcionada en el kit de reactivos o agua libre de orgánicos).

d. Tape ambos tubos de digestión y sacuda vigorosamente al menos 30 segundos

para mezclar, esta prueba es sensible a la técnica por lo tanto Invierta los frascos como se describe aquí para evitar resultados bajos: Mantener el vial en posición vertical con la tapa hacia arriba. Ponga el vial boca abajo. Esperar a que toda la solución fluya hacia abajo a la tapa. Pause. Devuelva el vial a una posición vertical. Esperar a que toda la solución fluya hacia el fondo del vial y así sucesivamente. Si el reactivo no se disuelve completamente esto no afectara la precisión del ensayo.

Figura 1. Procedimiento Espectrofotómetro

e. Inserte los tubos en el digestor por un tiempo de 30 minutos. Pasado el tiempo retire de inmediato los tubos y deje enfriar a temperatura ambiente.

54

f. Seleccione la prueba 394 Nitrógeno total en el espectrofotómetro.

g. Retire las tapas de los tubos y añada el contenido del Reactivo A (TN) encontrado en el set de tubos número 21. Se tapan los tubos y se agite durante 15 segundos.


h. Pulse el icono TIEMPO > OK. Una reacción con un periodo de tres minutos

comenzará.

i. Después de que expire el temporizador, retire las tapas de los tubos y añada el contenido del Reactivo B (TN) encontrado en el set de tubos número 21. Se tapan los tubos y se agite durante 15 segundos teniendo en cuenta las recomendaciones nombradas anteriormente. El reactivo no se disuelve completamente, lo cual no afectara la precisión. La solución comenzará a girar en torno a un color amarillo.


j. Pulse el icono TIEMPO > OK. Una reacción con un periodo de dos minutos comenzará.

k. Después de que expire el temporizador, tomar dos tubos de digestión acida TN

reactivo C del set número 21, a los cuales se le añaden 2ml de cada tubo preparado (muestra tratada y blanco).

55

l. Tapar los tubos e invertir diez veces para mezclar, hacerlo lentamente. Los tubos

se calientan por lo que hay que evitar el contacto directo tomándolos cuidadosamente por la parte superior del tubo.

m. Pulse el icono de TIEMPO > OK. Una reacción con un periodo de cinco minutos

comenzará. El color amarillo se intensifica.


n. Limpie el reactivo en blanco e insértelo en el titular de celdas redondas de 16mm.

Pulse la tecla CERO. La pantalla mostrará: 0,0 mg / L N

o. Limpie el frasco de reactivo de la muestra e insértelo en el titular de celdas redondas de 16mm. Pulse la tecla MEDICION. La pantalla mostrará el valor de nitrógeno total en mgN / L .


E. CÁLCULOS

Los resultados se toman directamente del espectrofotómetro, si el resultado aparece fuera del rango asegurarse de realizar dilución. Si ha realizado diluciones de la muestra, tener en cuenta el factor de dilución para el cálculo final de la concentración de nitrógeno.

56

11. DEMANDA QUÍMICA DE OXIGENO (DQO) – MÉTODO Nº 5220 – RANGO MEDIO -800 mg/L

A. CONCEPTO

La demanda química de oxigeno es la medida del oxígeno necesario para oxidar la materia orgánica e inorgánica susceptible de oxidación, contenida en una muestra bajo condiciones de un agente especifico, temperatura y tiempo. Los valores de este parámetro están asociados al grado de avance de la oxidación de los contaminantes.


Las sustancias orgánicas e inorgánicas oxidables presentes en la muestra, se oxidan mediante reflujo en solución fuertemente ácida (H2SO4) con un exceso conocido de dicromato de potasio (K2Cr2O7) en presencia de sulfato de plata (AgSO4) que actúa como agente catalizador, y de sulfato mercúrico (HgSO4) adicionado para remover la interferencia de los cloruros. Después de la digestión, el remanente de K2Cr2O7 sin reducir se titula con sulfato ferroso de amonio; se usa como indicador de punto final el complejo ferroso de ortofenantrolina (ferroina). La materia orgánica oxidable se calcula en términos de oxígeno equivalente.


Espectrofotómetro DR 2800 o DR 5000.

Bomba de vacío.

Balanza Analítica.

Digestor de DQO.

Dispensadores de 5.0ml.



Membrana filtrante tipo micro-fibra de vidrio de 1,2 µm.

Balones volumétricos de 10.0ml, 500ml, y 1000ml.

Beaker de 500ml y 1000ml.

Pipetas automáticas de 200µl y 1000µl.

Tubos DQO.


D. REACTIVOS

Sulfato de plata (Ag2SO4).

Ácido sulfúrico (H2SO4, 96-97% Pureza).

Sulfato de mercurio (HgSO4).

57

Dicromato de potasio (K2Cr2O7).

Hidrogenoftalato ácido de Potasio (KPH) HOOCC6H4COOK.


Solución de sulfato de plata en ácido sulfúrico

Solución de 5.5g/Kg de H2SO4 ,96-97% Pureza. ATENCION: Trabajar en la campana.

Triturar con bastón de vidrio 10.12g de sulfato de Plata (Ag2SO4) y transferir para un frasco con un contenido de 1l de Ácido sulfúrico (H2SO4, 96-97% Pureza), adicionar ene le mismo frasco de origen del ácido). Cerrar el frasco herméticamente. La mezcla deberá ser mantenida en oscuro durante dos días antes de ser utilizada.

Solución de Digestión (2l)

Solución de K2Cr2O7 + HgSO4. ATENCIÓN: Trabajar en campana y con guantes. Secar cerca de 25g de K2Cr2O7 a 103ºC en una estufa durante 24 horas. Enfriar en el desecador. Transferir 1.5L de agua destilada para un beaker de 2.0 L. Adicionar cuidadosamente 334mL de Ácido sulfúrico (H2SO4) sobre un baño de hielo. Retirar del baño, adicionar 66.6g de HgSO4 y agitar para disolver. Adicionar 20.432g de K2Cr2O7 previamente seco a 105ºC por 2 horas y mantener en agitación. Dejar Enfriar y transferir a un balón volumétrico de 2.0L y completar el volumen con agua destilada.

La utilización de una nueva solución de digestión exige una nueva preparación de una recta de calibración.

F. PROCEDIMIENTO


1000mg de Hidrogenoftalato de Potasio (KHP)= 1.176mg DQO

a. Secar aproximadamente 500mg de KHP en capsulas de porcelana a 120ºC en horno hasta que la masa sea constante (24h) y enfriar el KHP en desecador.

b. Disolver cerca de 0.425g aproximadamente de KHP en agua destilada, transferir cuantitativamente al balón volumétrico de 500ml y completar el volumen con agua destilada.

58

Entonces como ejemplo:

Tomamos 0.4639g KHP

436.9mg KHP

1000mg KHP→1176mgDQO

436.9mg KHP→ X

X=513.79mgDQO

Lo llevamos a Litros:

513.79mgDQO→500mL

X→1000mL

X=1027.58mgDQO/L

X=1.02758mgDQO/ml

Luego aplicar C1V1=C2V2 para determinar DQOTeorica.

(1.02758mgDQO/ml)V1= DQOTeorica2.5mL

DQOTeorica= (1.02758mgDQO/L)V1(ul)

2.5mL∗1000

Hacer la curva de calibración con concentraciones conforme a los volúmenes deseados para el procedimiento de la determinación de concentración de DQOTeorica.(Tabla 6) y completarlos con agua destilada para un volumen total de 2.5mL.

59

Tabla 6. Curva de calibración para hallar la DQOTeorica

CURVA DE CALIBRACION DQO

V1 Sol.KHP

[uL]

DQOTeorica

[mg/L]

ABS.1

[cm-1]

ABS.2

[cm-1]

ABS (Xmed)

100 41.10 0 0.006 0.003

200 82.21 0.016 0.016 0.016

400 164.41 0.04 0.040 0.040

600 246.62 0.063 0.080 0.072

1000 411.03 0.119 0.119 0.119

1600 657.65 0.177 0.172 0.175

1800 739.86 0.199 0.198 0.199

2000 822.06 0.228 0.216 0.222

2200 904.27 0.238 0.241 0.240

2400 986.48 0.268 0.283 0.276

2500 1027.58 0.273 0.276 0.275

Para la curva de calibración, dibujar la absorbancia media en el eje abscisas, versus la DQOTeorica en el eje de las ordenadas y determinar la ecuación de la recta (Figura 1).

60

Figura 1. Curva de calibración DQO, absorbancia vs DQOTeorica.

y = 3489,1x + 53,611R² = 0,9792

0

200

400

600

800

1000

1200

0,000 0,100 0,200 0,300

ABSORBANCIA (cm-1)

61

DEMANDA QUÍMICA DE OXIGENO (DQO) – MÉTODO Nº 5220 – RANGO ALTO -100 – 5000 mg/L

Para realizar la medición de la DQO de alto rango, es decir, valores de la curva hasta de 5000 mg/L, el procedimiento es igual al de la DQO de medio rango, excepto en la preparación del Dicromato de Potasio y la preparación de la curva.

Solución de sulfato de plata en ácido sulfúrico: Igual que para la DQO de medio rango.

Solución de Digestión (2L)

Solución de K2Cr2O7 + HgSO4. ATENCIÓN: Trabajar en campana y con guantes. Secar cerca de 65g de K2Cr2O7 a 103ºC en una estufa durante 24 horas. Enfriar en el desecador. Transferir 1.5L de agua destilada para un beaker de 2.0 L. Adicionar cuidadosamente 334mL de Ácido sulfúrico (H2SO4) sobre un baño de hielo. Retirar del baño, adicionar 66.6g de HgSO4 y agitar para disolver. Adicionar 64g de K2Cr2O7 previamente seco a 105ºC por 2 horas y mantener en agitación. Dejar Enfriar y transferir a un balón volumétrico de 2.0L y completar el volumen con agua destilada.

Preparación de la curva

4,532 g/L de Hidrogenoftalato de Potasio (KHP)= 5329 mg/L de DQO

c. Secar aproximadamente 5 g de KHP en capsulas de porcelana a 120ºC en horno hasta que la masa sea constante (24h) y enfriar el KHP en desecador.

d. Disolver cerca de 0,4532g de KHP en agua destilada, transferir cuantitativamente al balón volumétrico de 100 ml y completar el volumen con agua destilada.

Tomar de la solución stock diferentes volúmenes para construir la curva de calibración. En la Tabla 7 se presenta un ejemplo de cálculo y en la Figura 2 un ejemplo de curva de calibración. Para este caso se utilizaron alícuotas desde 200 uL hasta 9500 uL en volumen final de 10 mL y de ahí se tomó 1.5 mL para realizar el ensayo de la DQO.

62

Tabla 7. Datos para la curva de calibración teórica.

Solución KPH Absorbancia DQO

teórica

uL de la

solución

stock de

KPH

ml FD ml en 1.5ml uL* DQO Abs 1 Abs 2 Abs

promedio

mg/l

200 0,2 2 0,03 30 0,067 0,055 0,061 106,58

400 0,4 4 0,06 60 106,6 0,094 0,084 0,089 213,16

800 0,8 8 0,12 120 213,2 0,154 0,155 0,1545 426,32

1000 1 10 0,15 150 532,9 0,168 0,148 0,158 532,9

2000 2 20 0,3 300 1065,8 0,325 0,324 0,3245 1065,8

4000 4 40 0,6 600 2131,6 0,582 0,600 0,591 2131,6

6000 6 60 0,9 900 3197,4 0,816 0,834 0,825 3197,4

8000 8 80 1,2 1200 4263,2 1,066 1,062 1,064 4263,2

9500 9,5 95 1,425 1425 5062,6 1,299 1,272 1,2855 5062,55

Ejemplo de cálculo: DQOteórica: 5329∗𝑉(𝑢𝐿∗)

1.5∗1000

63

Figura 2. Curva de calibración para DQO de alto rango. (Todo lo demás como el método de DQO de medio rango, tenga en cuenta que en Excel la gráfica es tipo dispersion)

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE DQO.

a. En tubos de borosilicato con tapa de rosca, adicionar 1.5ml de la muestra concentrada o diluida (la dilución de la muestra se hace necesaria cuando la DQO esperada es mayor que 800mg/l) o 1.5ml de agua destilada (para el blanco) o de las soluciones patrón preparadas para la curva de calibración.

b. Adicionar enseguida con ayuda de dispensadores 1.5ml de solución de digestión y vigorosamente 3.5ml de la solución de sulfato de plata en ácido sulfúrico.

c. Cerrar herméticamente los tubos y agitar. d. Colocar los tubos en el digestor a temperatura de 150ºC y dejarlos calentando por

un periodo de 120minutos. e. Después enfriar y limpiar los tubos con papel absorbente humedecido con alcohol

y en seguida secar. f. Observar el espectrofotómetro ½ hora antes de la lectura y fijar la longitud de

onda en 620ηm. g. Reiniciar el equipo con la solución de la muestra para el blanco. Leer la absorbancia

de la solución patrón y de las muestras.

64

12. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE OXÍGENO DISUELTO (Utilizando el equipo portátil Hanna HI 9146)


El oxígeno disuelto (OD) es necesario para la respiración de los microorganismos aerobios así como para otras formas de vida aerobia. No obstante, el oxígeno es sólo ligeramente soluble en el agua; la cantidad real de oxígeno que puede estar presente en la solución está determinada por a) la solubilidad del gas, b) la presión parcial del gas en la atmósfera, c) la temperatura, y d) la pureza del agua (salinidad, sólidos suspendidos). Las concentraciones de OD en aguas naturales dependen de las características fisicoquímicas y la actividad bioquímica de los organismos en los cuerpos de agua. El análisis del OD es clave en el control de la contaminación en las aguas naturales y en los procesos de tratamiento de las aguas residuales industriales o domésticas. Existen electrodos de membrana polarográficos o galvánicos, y por ser sumergibles, portables y fáciles de operar, son apropiados para análisis en campo.


Botella winkler 300 ml (Según cantidad de diluciones)

Medidor de oxígeno Hanna HI 9146

C. REACTIVOS

Agua Ultrapura

Solución HI 7040 oxígeno disuelto = 0.0

CALIBRACIÓN DEL EQUIPO El equipo puede ser calibrado en máximo dos (2) puntos 0.0%(calibración del Cero) y 100.0% (calibración de la pendiente). Nota: Antes de realizar la calibración, revisar que el equipo está listo para mediciones. Calibración del Cero

Sumerja la sonda en un beaker con 40 ml. de la solución HI 7040 (solución cero oxígeno), y espere durante tres minutos.

65

Presione “CAL”, habrá un reloj de arena y el mensaje “NOT READY” parpadeando en el LCD, hasta que la lectura sea estable.

Cuando la lectura sea estable y dentro de los límites (±15% f.s.) “CFM”, empieza a parpadear. Presione CFM, para confirmar la calibración de “0.00%” de oxígeno disuelto.

Presione “CAL”, y el instrumento volverá al modo de medición habiendo almacenado el valor del cero.

Calibración de la pendiente Nota: Se recomienda realizar este procedimiento de la calibración al aire libre.

Enjuague la sonda con agua destilada para remover cualquier residual de la solución cero oxígeno disuelto.

Presione “CAL”, y luego use la FLECHA y seleccione “100% DO Calibration Point”.

Seque la sonda con una toalla de papel, habrá un reloj de arena y el mensaje “NOT READY” parpadeando en el LCD, hasta que la lectura sea estable.

Cuando la lectura sea estable y dentro de los límites (±15% f.s.) “CFM”, empieza a parpadear. Presione CFM, para confirmar la calibración de “100%” de oxígeno disuelto.

Presione “CAL”, y el instrumento volverá al modo de medición habiendo almacenado el valor del 100%.

D. PROCEDIMIENTO PARA MEDIR OXÍGENO DISUELTO.

a. Sumergir el medidor en la botella del cero.

b. Espere durante aproximadamente un (1) minuto para que la lectura se estabilice.

c. El valor de oxígeno disuelto es mostrado en la parte superior en ppm (mg/l), y la temperatura en la parte inferior °C. Presione RANGE para cambiar la lectura de ppm a % y viceversa.

66

Figura 1. Ilustración Medidor de Oxígeno

13. DEMANDA BIOQUIMICA DE OXIGENO DBO5– MÉTODO Nº 5210

A. CONCEPTO

La Demanda Bioquímica de Oxigeno (DBO) es un método empírico en el cual su procedimiento es usado para determinar la cantidad de oxigeno relativo en aguas naturales, efluentes domésticos e industriales.

El test de DBO es empleado para determinar los niveles de contaminación, evaluar cargas contaminantes y para evaluar la eficiencia de un determinado sistema de tratamiento.

B.PRINCIPIO DEL METODO

Gran parte de los organismos vivos dependen, directa o indirectamente del oxígeno para mantener su proceso metabólicos que producen la energía necesaria para su crecimiento y reproducción.

Se le llaman organismos aerobios a aquellos que dependen exclusivamente del oxígeno de forma libre para la mineralización de materia orgánica, resultando como producto final substancias inorgánicas más simples, tales como CO2, NH3, H2O, etc.

La materia orgánica presente en aguas naturales y en los efluentes domésticos e industriales, tiene la tendencia a ser mineralizadas naturalmente por los microorganismos aerobios existentes, consumiendo oxígeno disuelto en el medio acuoso. El test de DBO tiene por objetivo, determinar esas cantidades de oxigeno consumido, y así mismo, relacionar con las cantidades de materia orgánica biodegradable presente en una muestra.

Los métodos usualmente empleados para la determinación de la DBO es el de la dilución, incubación por un periodo de 5 días a 20ºC, con una determinación de los niveles iníciales y finales de oxígeno a través del método de Azida modificado.

67

Para garantizar una mejor eficiencia en el metabolismo de los microorganismos desarrollados en el test es adicionado a el frasco de incubación, soluciones nutritivas y una solución buffer, con el fin de garantizar un pH neutro de 6.5 a 7.5 (Llamada agua de dilución).

Es importante que durante los 5 días del test, la muestra se encuentre en un ambiente sin luz, a fin de evitar el aparecimiento de seres clorofilados fotosintéticos.


Incubadora (Termo regulable).

Frascos DBO.

Pipetas volumétricas.

Balones Volumétricos.

Beaker.

Erlenmeyer.

Equipo de titulación (Bureta de 50mL).

C. REACTIVOS

Solución Buffer de Fosfato.

Solución de Sulfato de Magnesio (MgSO4.7H2O).

Solución de Cloruro de calcio (CaCl2).

Solución de Cloruro Férrico (FeCl3).

Agua de dilución.

Inhibidor de Nitrificación Sulfito de Sodio.

Cloruro de Cobalto.

Solución Patrón de ácido glutámico/glucosa.

Solución de sulfato Manganoso (MnSO4.H2O)

Solución de álcali –Ioduro-Azida (AIA).

Ácido Sulfúrico Concentrado.

Solución Indicadora de Almidón.


Solución Buffer de Fosfato

Disolver en aproximadamente 600mLde agua destilada, 8.5g de fosfato monobásico de Potasio (KH2PO4), 21.75g de fosfato bibásico de Potasio (KHPO4), 33.4g de Fosfato bibásico de sodio heptahidratado (Na2HPO4.7H2O) y 1.7g de Cloruro de Amonio (NH4Cl).

68

Transferir para un balón volumétrico de 1L y completar el volumen con agua destilada, tal solución debe ser guardada en baja temperatura y en ausencia de luz.

Solución de Sulfato de Magnesio (MgSO4.7H2O)

Disolver 22.5g de sulfato de magnesio heptahidratado en aproximadamente 800ml de agua, transferir para un balón volumétrico de 1l y completar el volumen; tal solución debe ser guardada en baja temperatura y en ausencia de luz.

Solución de Cloruro de Calcio (CaCl2)

Disolver 27.5g de Cloruro de Calcio anhidro en aproximadamente 800ml de agua, transferir para un balón volumétrico de 1L y completar el volumen; tal solución debe ser guardada en baja temperatura y en ausencia de luz.

Solución de Cloruro Férrico (FeCl3)

Disolver 0.25g de Cloruro Férrico hexahidratado en aproximadamente 800ml de agua, transferir para un balón volumétrico de 1l y completar el volumen; tal solución debe ser guardad en bajas temperaturas y en ausencia de luz.

Agua de dilución

Adicionar en una botella ojala de vidrio previamente limpio un volumen adecuado para la prueba que se va a realizar. Mantener el contenido de esta botella en aireación por un mínimo de 24 horas y dejar en reposo por aproximadamente 30 minutos antes de hacer el ensayo. Posteriormente añadir al agua 1ml de cada una de las soluciones mencionadas anteriormente para cada litro de agua destilada usado.

69

Solución Patrón de ácido glutámico/glucosa

Disolver, previamente seco en estufa a 103ºC por 1hora, 150mg de glucosa y 150mg de ácido glutámico, en aproximadamente 800mL de agua destilada. Transferir para un balón volumétrico de 1L. Preparar semanalmente. Tal solución debe presentar una DBO teórica de 194mg/L (Siendo tolerado un desvió patrón de hasta +/-15%).

Solución de sulfato Manganoso (MnSO4.H2O)

Disolver 364g de sulfato Manganoso monohidratado (MnSO4.H2O) en aproximadamente 800mL de agua destilada, filtrar en papel de filtro Wattman Nº4 y diluir en balón volumétrico de 1l.

Solución de álcali –Ioduro-Azida (AIA).

Disolver en aproximadamente 800mL de agua, 500g de Hidróxido de Sodio (NaOH), 135g de Iodeto de sodio (NaI) y diluir en 1L de agua destilada; adicionar 10g de Azida Sódica (NaN3), previamente disuelta en 40mL de agua destilada. Guardar en un frasco de PVC.

Solución Patrón de Tiosulfato de Sodio (Na2S2O3.5H2O) 0.025N

Disolver 6.205g de Tiosulfato de sodio pentahidratado con 1.5ml de Hidróxido de sodio 6N (o 0.4g de NaOH), en aproximadamente 800ml de agua destilada, transferir para un balón volumétrico de 1l y completar el volumen.

Normalización: Normalizar con 10ml de solución de Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) 0.1N, 1ml de ácido sulfúrico concentrado y cerca de 80ml de agua destilada. Se debe dejar por 6 minutos y en la oscuridad, en seguida adicionar con una espátula (+/-1g) de KI y titular la solución de Tiosulfato hasta que aparezca una coloración amarillo paja, en ese punto adicionar almidón y proseguir la titulación hasta que cambie de azul a incoloro. Calcular la normalidad real del tiosulfato con la ecuación 22:

Na2S2O3=𝑁𝐾2𝐶𝑟2𝑂7×𝑉𝐾2𝐶𝑟2𝑂7

𝑉𝑁𝑎2𝑆2𝑂3 𝑔𝑎𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜, 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 22

Solución Indicadora de Almidón

Disolver 2g de almidón en 100 ml de agua destilada hervida, mezclar y dejarla sedimentar por una noche.

70

E. PROCEDIMIENTO

Preparación de los frascos DBO

a. Dejar con jabón extran alcalino o cualquier otro jabón neutro para lavar vidrieria por 1 día.

b. Enjuagar varias veces con agua del grifo y en seguida con agua destilada. c. Autoclavar los frascos a una temperatura de 120ºC y 1kg/cm2 de presión, por 30

minutos. d. Dejar enfriar en lugar limpio y seco. e. Almacenar en lugar limpio y seco.

Procedimiento DBO sin inóculo

a. Adicionar una muestra a los frascos preparados de DBO y completar hasta la tasa de dilución de acuerdo con la Tabla 7, hacer por lo menos 4 diluciones diferentes.

b. Anotar el número Nº y el volumen del frasco. c. Adicionar si es necesario inhibidor de nitrificación. d. Completar el volumen del frasco con agua de dilución evitando la formación de

bolas y turbulencia. e. Agregar a cada botella 1 ml de sulfato manganoso y posteriormente 1 ml de

reactivo alcalina. f. Tapar la botella y agitar 20 veces, luego agregar 1mL de ácido sulfúrico

concentrado (H2SO4) alrededor del cuello de la botella con mucho cuidado y volver a agitar por 20 veces.

g. Transferir 200mL de la muestra que se encuentra en la botella Winkler a un beaker y poner en agitación.

71

Tabla 7. Tabla de Diluciones.

Tasa de dilución

(ml)

Rango de DQO Tasa de dilución

(ml)

Rango de DQO

0.001 128000-130000 2 300-1050

0.002 118000-125000 5 120-420

0.005 60000-115000 10 60-210

0.02 12000-42000 20 30-105

0.1 6000-21000 50 12-42

0.2 300-10000 100 6-21

1 600-2100 300 0-7

ODi - ODf≥ 2mg/L;

1 ≤ ODf≤ 6 mg/L.

h. Titular la muestra con Tiosulfato de Sodio 0.025N hasta que la muestra tenga un color amarillo paja y agregar 1mL de almidón.

i. Seguir titulando con Tiosulfato de Sodio 0.025N hasta que el color cambie de azul oscuro a transparente.

j. Medir el OD inicial. k. Llevar a la incubadora la réplica de las botellas y después de 5 días de encubar

medir OD final. Envolver las botellas que se dejan en la incubadora en papel aluminio.

Procedimiento DBO con inóculo

a. Oxigenar hasta saturación (por lo menos 24 horas) un volumen de agua suficiente para realizar las diluciones y el blanco, agregando previamente 1ml/L de agua residual como inóculo.

b. Adicionar una muestra a los frascos preparados de DBO y completar hasta la tasa de dilución de acuerdo con la Tabla 7, hacer por lo menos 4 diluciones diferentes de cada botella.

c. Anotar el número Nº y el volumen del frasco. d. Adicionar si es necesario inhibidor de nitrificación.

72

e. Completar el volumen del frasco con agua de dilución evitando la formación de bolas y turbulencia.

f. Agregar a cada botella 1 ml de sulfato manganoso y posteriormente 1 ml de reactivo alcalina.

g. Tapar la botella y agitar 20 veces, luego agregar 1mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) alrededor del cuello de la botella con mucho cuidado y volver a agitar por 20 veces.

h. Transferir 200mL de la muestra que se encuentra en la botella Winkler a un beaker y poner en agitación.

F. CÁLCULOS

Oxígeno disuelto

Si la normalidad del Tiosulfato de Sodio es 0.025N el volumen gastado es la misma concentración de OD. Caso contrario, utilizar la ecuación 23.

𝑚𝑔𝑂2

𝑙=

(𝑉𝑜𝑙. 𝑇𝑖𝑜𝑠𝑢𝑙𝑓𝑎𝑡𝑜)(𝑁 𝑇𝑖𝑜𝑠𝑢𝑙𝑓𝑎𝑡𝑜)(8000)

100, 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 23

Porcentaje de reducción oxígeno disuelto

%𝑅𝑒𝑑. 𝑂𝐷 =(𝑂𝐷𝑖) − (𝑂𝐷𝑓)

𝑂𝐷𝑖× 100, 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 24

En la Tabla 8 se observa un ejemplo de cálculo:

Tabla 8. Ejemplo de cálculo de la DBO

El porcentaje de reducción de oxígeno disuelto debe estar entre 40 y 70% para que el ensayo de la DBO se considere válido. Del ejemplo de la Tabla 8 se obtiene el promedio de las botellas 4, 10 y 13 y este es el valor final de la DBO.

0,025

1 2 3 300 6,99 6,48 6,45 6,47 7,51% 0,53

4 5 6 30 6,55 2,73 3,20 2,45 62,67% 41,05

7 8 9 20 6,61 4,92 4,91 4,40 33,51% 33,23

10 11 12 10 6,72 5,52 5,87 5,18 22,99% 46,35

13 14 15 5 6,79 6,32 6,26 5,77 15,02% 61,20

BOTELLA No

VOLUMEN

DE

MUESTRA

ODi ODfPROMEDIO

ODF

% Red

OD

DBO

mgO2/L

Factor correcciónNormalidad tiosulfato N 0,53

73

Nota: Se debe calcular la diferencia entre el oxígeno disuelto inicial y el oxígeno disuelto final del blanco. En lo posible este valor debe ser mínimo. Esta diferencia debe ser restada a todos los valores de oxígeno disuelto final de las botellas analizadas y luego si se debe calcular el porcentaje de reducción citado anteriormente.

La DBO finalmente se calcula con la ecuación 25

𝐷𝐵𝑂𝑚𝑔𝑂2

𝑙=

(𝑂𝐷𝑖) − (𝑂𝐷𝑓)

𝑓, 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 25

Donde:

𝑓 =𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛𝑑𝑒𝑙𝑓𝑟𝑎𝑠𝑐𝑜𝑑𝑒𝐷𝐵𝑂

14. RESIDUAL DE PEROXIDO DE HIDROGENO

A. CONCEPTO

El peróxido de hidrógeno ha sido utilizado durante muchos años en el tratamiento de aguas residuales industriales y de abastecimiento de agua, principalmente para la remoción de materia orgánica. El H2O2 se considera un oxidante versátil más que el cloro. Cabe señalar que la aplicación en exceso de peróxido de hidrógeno puede conducir a reacciones competitivas con los radicales OH٠, causando un efecto inhibitorio sobre la degradación de contaminantes.

Es muy importante determinar la presencia de peróxido de hidrógeno residual que queda después del tratamiento de efluentes, ya que interfiere principalmente en análisis de DBO5 y DQO de aguas residuales tratadas.


Becker 1000ml

Micro pipeta (100-1000 µL)

Plancha agitadora.

Balanza analítica.

Indicadores Quantofix Peróxido 25 (0.5-25 mg/L H2O2)

74

C. REACTIVOS

Peróxido de hidrogeno 30% m/m.

Sulfito de sodio, P.A.

Figura 1. Reactivos determinación residual de peróxido de hidrogeno.

D. PROCEDIMIENTO

CALCULO DE LA DOSIS EFECTIVA DE PERÓXIDO DE H2O2

Debido a que el peróxido viene líquido se debe realizar la siguiente operación para saber el volumen que se debe tomar, para calcular la dosis efectiva en mg/L, se debe utilizar la ecuación 26, de la siguiente forma:

𝑉(𝑚𝑙) 𝐻202 =

𝐷𝑒

1000

𝛿, 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 26

Donde: De= dosis efectiva en mg/L δ= densidad del peróxido de hidrogeno (1.4 g/mL) Se mide con ayuda de la Micropipeta (100-1000 µL) la dosis efectiva de peróxido que se desea aplicar.

APLICACIÓN DE LA DOSIS EFECTIVA DE PERÓXIDO DE H2O2

Teniendo la dosis efectiva de H2O2 se adiciona al agua a tratar por el tiempo que dure la reacción. (Ejemplo: 1 hora).

75

MEDICIÓN DEL RESIDUAL DE PERÓXIDO DE H2O2

Posterior a esto con ayuda de los papeles indicadores se mide la cantidad de peróxido residual, de acuerdo a las indicaciones del producto.

DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD DE SULFITO PARA PARAR LA REACCIÓN DE

PERÓXIDO DE HIDROGENO

Teniendo el residual de peróxido (mg/L) se procede a calcular la cantidad de Na2SO3 realizando una regla de tres que se obtiene de la relación estequiometria de la ecuación 1:

126.0422 g Na2SO3 33.9988 g H202

Y Na2SO3 𝑋

1000 g H202

Donde: X = es la cantidad de peróxido residual obtenida del papel indicador en mg/L (Ver Figura 9) Y= cantidad de sulfito de sodio para neutralizar el peróxido.

Figura 2: Determinación residual H202 .

76

Se pesa esta cantidad de sulfito en la balanza analítica, se agrega al agua tratada con H202 y se deja agitando aproximadamente 30 minutos. Al finalizar estos 30 minutos se vuelve a medir con otro papel indicador el peróxido residual cuyo resultado debe dar cero. En caso contrario se vuelve a calcular la cantidad de sulfito de sodio con el valor que arroje el indicador. Se repite el proceso desde el paso 4 hasta que el peróxido residual sea cero.

15. CONSTITUYENTES ORGÁNICOS ABSORCIÓN-UV – MÉTODO Nº 5910

A. CONCEPTO

Algunos compuestos orgánicos comunmente encontrados en agua y aguas residuales,

tales como la lignina, tanino, sustancias húmicas, y varios compuestos aromáticos,

fuertemente absorbidos por la radiación ultravioleta (UV). Puede existir una fuerte

correlación entre la absorción UV y el contenido de carbón orgánico, color y precursores

de trihalometanos (THM) y otros productos de la desinfección.

Este método se pretende ser empleado como una indicación de la concentración de los

constituyentes orgánicos de abdorción-UV.

Los constituyentes orgánicos de absorción-UV de una muestra absorben la luz UV en

proporción a su concentración. Las muestras son filtradas para controlar las variaciones en

absorción UV causadas por partículas. El ajuste del pH es opcional.La absorción UV se

mide a 253.7 nm (a menudo redondeado hasta 254 nm).



Filtro de fibra de vidrio de 1,2 µm o 0, 45 µm

Bomba de vacio.

C. PROCEDIMENTO

1. Filtrar al menos 50mL de muestra a través de la membrana filtrante.

2. Preparar un blanco con agua destilada.

3. Encender el espectrofotómetro 15min antes de iniciar el ensayo.

77

4. Ajustar a una longitud de onda de 254nm y ajustar en cero de absorbancia con el

blanco de agua destilada.

5. Medir la absorbancia UV a 250nm al menos a dos porciones de la muestra filtrada

a temperatura ambiente.

D. CÁLCULOS

Reportar el valor medio de absorción UV en unidades de cm-1empleando la siguiente

notación. Para reportar unidades en m-1 multiplicar la expresión por cien.

𝑈𝑉𝜆𝑝𝐻

= [Ā

𝑏] 𝐷

Donde:

UVλpH =Valor medio de absorción UV, cm-1 (el subíndice denota la longitud de onda, nm, y

denota el pH empleado si es diferente de 7.0).

b = longitud de la celda, cm. (generalmente es 1.0 cm)

Ā = absorbacia media medida, y

D = factor de dilución resultante del ajuste con agua destilada, ver página xxxx

78

16. MEDIDA DE LA ABSORCIÓN EN LA REGION DEL ESPECTRO UV-VIS


La medida de la absorción UV es un indicador de la concentración de compuestos orgánicos comúnmente encontrados en aguas tales como lignina, tanino, sustancias húmicas y varios compuestos aromáticos los cuales son absorbidos por la radiación ultravioleta (UV), el contenido de carbón orgánico, color y precursores de trihalometanos (THM) y otros productos de la desinfección están relacionados con la absorción UV.

El espectrofotómetro DR5000 (Figura 1) es un equipo utilizado para medir la absorbancia de la luz en una solución durante un espectro de longitud de onda definido. Los resultados de la medición pueden visualizarse como valores únicos de absorbancia o como el espectro total en longitudes de onda definidas, adicional a esto los datos pueden imprimirse en formato de tabla o de curva.

Figura 1. Fotografía del espectrofotómetro DR 5000.

B.EQUIPOS Y MATERIALES

Mortero de porcelana

Pastillas anticonceptivas con composición 0.15 mg de Levonorgestrel y 0.03mg de Etinilestradiol (o cualquier otra sustancia que se quiera determinar)

Cápsulas de porcelana

Membrana

Desecador

Bomba de vacío.

Balanza analítica.

Horno tipo mufla 550ºC.


79


Membrana filtrante tipo micro-fibra de vidrio, con tamaño nominal de abertura de 0,45µm-1,2µm.

Capsulas de porcelana.

Pinza metálica.

Probeta

Beaker de 1000 Ml

Agitador magnético

Barra magnética

Guantes para mufla


C.PROCEDIMIENTO

EJEMPLO:

Medición indirecta del contenido de las hormonas levonorgestrel y etinilestradiol en el agua.

1. Preparación para cápsula y membrana para determinación de sólidos suspendidos. a. Calcinar la cápsula de porcelana en mufla a 550ºC hasta que la masa sea constante

(aproximadamente 15 minutos) y dejar enfriar en el desecador. b. Colocar una membrana filtrante en el sistema de filtración. c. Hacer 3 lavados a la membrana con el sistema de filtración utilizando 20mL de agua

destilada para cada lavado (total de 60mL) que deben ser despreciados. d. Colocar la membrana en la cápsula de porcelana y calcinar en la mufla por 15minutos

y dejar enfriar.

2. Preparación de la muestra

a. Medir 500 mL de agua ultrapura y transferir a un beaker de 1000 mL. b. Colocar una barra magnética y acomodar el beaker en un agitador magnético. c. Tomar 5 pastillas anticonceptivas que contengan 0.15 mg de Levonorgestrel y

0.03mg de Etinilestradiol, medir la masa de cada una - M1 d. Colocar las 5 pastillas anticonceptivas en el mortero de porcelana y triturar. e. Agregar el polvo que quedo de las pastillas al agua ultrapura y dejar agitando por 15

minutos.

80

Determinación de sólidos

a. Preparar una cápsula y una membrana para el ensayo. b. Determinar la masa del conjunto (membrana + cápsula) - M2 en g. c. Colocar con una pinza metálica la membrana calcinada en el sistema de filtración. d. Filtrar un volumen conocido (V) de la muestra de agua ultrapura con las pastillas

anticonceptivas anteriormente mezclada, utilizando el sistema de filtración o vacío. e. Transferir la membrana que contiene el residuo a la cápsula de porcelana. f. Secar el conjunto (membrana + cápsula) a 103ºC – por 15 minutos y después enfriar

en el desecador. g. Determinar la masa M3 en (g) y calcular con la ecuación 27:

𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠(𝑚𝑔

𝐿) =

(𝑀3 − 𝑀2) ∗ 1000000

𝑉(𝑚𝐿), 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 27

h. Para encontrar la solución de hormonas en el agua utilice la ecuación 28:

𝑆𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (𝑔/𝐿) =𝑀1∗1000

500 𝑚𝐿− 𝑆ó𝑙𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠/𝐿, Ecuación, 28

Aplicación de ozono

Realizar el ensayo N° 4. Requerimiento en demanda oxidante – Método N° 2350 que se encuentra en la página N° 22 de este manual durante 30 minutos, tomando muestras antes y después de la ozonización y a los 10 y 20 minutos de la reacción.

Medición de la absorción ultravioleta (UV) a. Encender el espectrofotómetro DR 5000 en la parte posterior y esperar la

autocomprobación.

b. En el menú principal seleccione la opción “escanear longitud de onda”.

c. Pulse “Opciones” para acceder a las opciones de configuración.

d. Pulse la tecla “λ” para seleccionar el rango de longitud de onda y el intervalo de

longitud de onda.

e. Pulse la tecla superior izquierda para seleccionar la longitud de onda mínima.

f. Pulse la tecla superior derecha para seleccionar la longitud de onda máxima.

g. Pulse “OK” para confirmar

h. Seleccione el intervalo de longitud de onda que desee, se pueden elegir intervalos

entre 0.1 y 5 nm.

i. Pulse “OK” para volver al modo de escaneado. Los parámetros seleccionados se

visualizarán a lo largo del eje x de la figura.

81

j. En la celda de cuarzo agregue agua ultrapura para el blanco.

k. Limpie la celda cuidadosamente con un trapo seco.

l. Ingrese la celda con el agua ultrapura en el porta celdas de 10 mm con la cara

transparente paralela al haz de luz.

m. Cierre el compartimiento de cubetas.

n. Pulse “Cero” y espere mientras se ajusta el cero, abajo aparece el mensaje “Ajust.

Cero…”. La lámpara UV no se enciende hasta que se ha introducido una longitud de

onda del espectro UV y se ha iniciado la medida del blanco, por esto la primera vez

que establezca el blanco el equipo muestra el mensaje “Calent. Lámpara…”

o. Una vez finalizado el ajuste del cero, retire la celda y ponga en ella la muestra de

agua que se desea medir. Se mide la absorbancia para cada una de las 4 muestras

correspondientes a los 0, 10, 20 y 30 minutos de la ozonización

p. Pulse “Medición” y espere la lectura del equipo. Debajo del gráfico aparece el

mensaje “Midiendo…” y la pantalla mostrará un gráfico de forma continua de los

valores de absorbancia en las longitudes de onda escaneadas.

q. Una vez finalizado el escaneado de longitudes de onda se muestra el gráfico a

tamaño completo como el que se muestra a continuación:

Figura 2. Representación gráfica Escaneo longitud de onda

Pulse las teclas de flecha derecha e izquierda para mover el cursor de modo que pueda visualizar para cada longitud de onda el respectivo valor de absorbancia.

r. También puede visualizar una tabla que le mostrará para cada longitud de onda el

respectivo valor de absorbancia, pulse en el menú “Opciones” y luego “Ver Tabla”,

de inmediato aparecerá una tabla como la que está a continuación:

82

Figura 3. Representación en tabla escaneo longitud de onda.

s. Para volver al gráfico, pulse “Opciones” y a continuación, “Ver Gráfico”.

Como extraer datos a una USB. a. Una vez realizada la medición conecte una memoria USB en la parte posterior del

equipo.

b. Pulse “Opciones” a continuación, “más” y luego “Enviar Datos”.

c. Saque la memoria y conéctela a su PC.

d. El equipo automáticamente crea una carpeta en la USB llamada WLData.

e. Abra Microsoft Office Excel.

f. Haga click en la pestaña “Datos”, luego en el menú “Obtener datos externos” haga

click en la opción “Desde texto”, busque el archivo y de click en “importar”.

g. Seleccione la opción “Delimitados”, luego de click en “Siguiente”.

h. Selecciones en “Separadores” las casillas “Tabulación” y “Coma”, de click en

“Siguiente”

i. Luego de click en “Finalizar” y luego en “Aceptar”, inmediatamente aparecerán los

valores de absorbancia para cada longitud de onda.

83

17. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE CARBONO ORGÁNICO TOTAL (COT), MÉTODO DIRECTO


Es una medida auxiliar de los ensayos de la Demanda Bioquímica y Química de Oxígeno acerca de la cantidad de materia orgánica presente en el agua, este puede llegar a expresar menores cantidades de materia orgánica, pues hay algunos compuestos que no logran oxidarse. El Carbono Orgánico Total es el material que se deriva en aguas residuales a partir de diferentes factores como: la descomposición de plantas, el crecimiento bacteriano y actividades metabólicas de compuestos vivos o químicos. El método a realizar establece tres rangos de COT, bajo, medio y alto, dependiendo del compuesto a analizar y de su concentración. El carbono orgánico total es determinado por el burbujeo de la muestra bajo ligeras condiciones ácidas para remover el carbono inorgánico. Por otro lado, el Carbono Orgánico Total en la muestra es degradado por el Persulfato y el Ácido para formar Dióxido de Carbono. Durante la degradación, el Dióxido de Carbono se difunde en un agente indicador de pH dentro de la ampolleta. La adsorción de Dióxido de Carbono en el agente indicador forma ácido carbónico. El ácido carbónico cambia el pH de la solución indicadora, la cual experimenta un cambio de color. La magnitud del cambio de color está relacionada con la cantidad original de Carbono presente en la muestra.


Probeta graduada 10 ml

Digestor a 105°C

Medidor de pH

Erlenmeyer 50 ml

Agitadores magnéticos

Pipeta 0.1 a 1.0 ml


Plancha agitadora

Gradilla para tubos

Embudo


C. REACTIVOS

Solución de digestión ácida dependiendo del rango

Solución buffer de Sulfato

Ampolletas indicadoras dependiendo del rango (Bajo LR, Medio MR, Alto HR)

Almohadillas de Persulfato en polvo

84

Agua destilada

D. PROCEDIMIENTO

a. Agregar 10 ml de muestra en un Erlenmeyer de 50 ml que contenga una barra de

agitación.

b. Adicionar solución buffer de Sulfato hasta obtener un pH 2.0 (asegurarse que el pH

de la muestra sea de 2, agregue aproximadamente 0.4ml de la solución buffer; si

es necesario agregue mayor cantidad).

c. Agitar continuamente en la plancha agitadora durante 10 min.


d. Etiquetar dos frascos de solución de digestión ácida dependiendo del rango que se

vaya a medir (LR, MR, HR), uno para la muestra y otro para el blanco.

e. Usar un embudo para agregar el polvo de Persulfato. Adicionar una almohadilla en

cada uno de los dos tubos de la solución de digestión ácida previamente

etiquetados.

f. Usar la pipeta para adicionar 1.0 ml de agua destilada al tubo para el blanco y 1.0

ml de la muestra preparada en el tubo etiquetado.

g. Enjuagar dos ampolletas indicadoras (tener en cuenta el rango de medida LR, MR,

HR) con agua destilada y secarlas con un paño que no deje residuos. No tocar las

ampollas después de secarlas, tomarlos únicamente por la parte de arriba.

h. Colocar una ampolleta indicadora en cada uno de los tubos etiquetados. Cuando la

marca de la ampolla este a nivel con el borde del frasco romper la parte superior

de la ampolleta y dejarla caer en la mezcla. No revolver o invertir el frasco después

de poner la ampolleta.

a. b. c.

85


i. Colocar las muestras en el digestor por dos horas a 103-105° C aprox.

j. Remover las muestras del digestor y dejarlas enfriar durante una hora para luego

tomar resultados, el líquido en el tubo del blanco debe estar de color azul oscuro.

k. Seleccionar la prueba COT en el espectrofotómetro, dependiendo del rango a

utilizar (LR, MR, HR).


l. Poner el frasco del blanco en la ranura del espectrofotómetro.

m. Seleccionar cero, la pantalla debe mostrar: 0 mg/L C

n. Colocar la muestra preparada en el espectrofotómetro, los resultados se dan en

mg/L C. La pantalla mostrará fuera de rango cuando el valor esté fuera de los

límites del método.

d,e. f. g,h.

i. j. k.

86


E. CÁLCULOS

Los resultados se toman directamente del espectrofotómetro, si el resultado aparece fuera del rango asegurarse de que se está usando el rango adecuado. Si ha realizado diluciones de la muestra, tener en cuenta el factor de dilución para el cálculo fina de la concentración de COT.

18. MÉTODO PARA DETERMINAR METANO POR DESPLAZAMIENTO



Equipos para venoclisis

Botellas para digestión

Recipientes de plástico

Manguera

Agujas

Soportes

Mallas

C. REACTIVOS

Hidróxido de Sodio (NaOH o KOH) 1N (la solución debe tene un pH de 12)

Fenolftaleina

87

D. MONTAJE Y PREPARACION DE REACTIVOS

Solución de Hidróxido de sodio (NaOH) N

En un Becker limpio disolver 40 g de NaOH con agua destilada. Dejar enfriar y transferir la solución cuantitativamente para el balón volumétrico de 1000 ml. Completar el volumen del balón hasta la marca con agua destilada.

E. ESQUEMA DEL MONTAJE

Figura 1. Montaje método por desplazamiento (Fotografia tomada en la Universidad Industrial de Santander en el Laboratorio del profesor Humberto Escalante Hernandez)

88

F. PROCEDIMENTO

MÉTODO PARA DETERMINAR METANO POR DESPLAZAMIENTO

Agregar la solución de hidróxido de sodio 1 N en una botella para digestión.

Agregar 10 gotas de fenolftaleina.

Instalar el equipo para venoclisis en las botellas con la solución de NaOH y unirlas al biodigestor.

Unir con la ayuda de una manguera y aguja la botella para digestión con

el recipiente plástico.

Colocar las botellas en las mallas y colgarlas de forma invertida en el soporte.

El volumen atrapado en el recipiente de plástico será el volumen de metano.

Nota: Cuando la solución de NaOH cambie a incolora, se debe reemplazar por una

nueva.

Figura 2. Esquema procedimiento determinación de gas metano por desplazamiento.

89

19. ENSAYO DE ACTIVIDAD METANOGÉNICA ESPECÍFICA

A. CONCEPTO

La actividad metanogénica específica o AME por sus siglas, hace parte de los bioensayos anaerobios, realizados con el fin de cuantificar la máxima capacidad de producción de metano generada por un grupo de microorganismos que se encuentran en lodos anaerobios y condiciones controladas de laboratorio.

La actividad metanogénica es un aspecto importante en el monitoreo de la población de bacterias metanogénicas presentes en el reactor biológico, razón por la cual se considera una herramienta de control y operación de los reactores. El conocimiento de la AME de un lodo permite conocer la capacidad máxima de remoción de DQO y por consiguiente la carga orgánica máxima que puede ser aplicada sin correr el riesgo de desbalancear el equilibrio del proceso anaerobio.

El ensayo AME considera diferentes parámetros como son: el inoculo que corresponde al lodo, el tipo de sustrato, que puede ser un agua residual de un tipo en específico o soluciones de ácidos orgánicos como el ácido acético, el propiónico o el butírico, según lo que se pretenda identificar con el ensayo y la solución de nutrientes que es una mezcla de diferentes compuestos que ayudan a la alimentación de los microorganismo presentes en el inoculo.

Para la cuantificación del metano producido durante el ensayo se pueden utilizar métodos volumétricos o la cromatografía de gases, el primero se basa en la cuantificación del volumen de metano mediante el uso de una sustancia como hidróxido de sodio por su propiedad de reaccionar con el dióxido de carbono presente en el biogás. El segundo método, requiere el uso del cromatógrafo de gases y permite una medición más exacta de la composición y biogás producido, en ambas determinaciones se debe garantizar que el montaje realizado no presente fugas.


En este ensayo se determina la producción de metano por medio de la cromatografía de gases y se utilizan botellas serológicas selladas con tapones de caucho y agrafes metálicos, para evitar las fugas. Las mediciones se pueden realizar cada 24 horas, hasta que la producción de metano se mantenga constante. Es necesario realizar ensayos de solidos totales volátiles, ácidos volátiles totales, demanda química de oxígeno y medición de pH, tanto al inicio como al final del ensayo, con el objetivo de evaluar la estabilidad del proceso.

90


Botellas serológicas con boquilla de 20mm

Tapones de caucho y agrafes metálicos

Pinzas para sellar y abrir agrafes metálicos

Agitador magnético (opcional)

Cromatógrafo de gases AGILENT 7890ª

Cámara termocontrolada

jeringa de 0.5 ml con sistema luer-gas tight

Figura 1. Botellas serologicas, tapones de caucho, agrafes metalicos y pinzas para sellar y abrir los agrafes

Figura 2. Toma de la muestra de gas con jeringa

91

D. REACTIVOS

Solución de nutrientes (medio mineral)

Solución de etanol, ácido acético o acetato de sodio


Solución de nutrientes

La solución de nutrientes se prepara siguiendo las recomendaciones de Chernicharo (2007). Esta se compone a su vez de dos soluciones asi: solución 1: NaHCO3 (1000mg/L), KH2PO4 (650mg/L), K2HPO4 (150mg/L), NH4Cl (500mg/L), MgCl2 (100mg/L), CaCl2.2H2O (100mg/L), Na2S.7H2O (50mg/L), Extracto de levadura (50mg/L), solución 2:FeCl3.6H2O (2mg/L), ZnCl2 (0.05mg/L), CuCl2.2H2O (0.03mg/L), MnCl2.4H2O (0.5 mg/L), (NH4)6Mo7O24.4H2O (0.05 mg/L), AlCl3.6H2O (0.05 mg/L), CoCL2. 6H2O (2 mg/L), NiCl2.6H2O (0.05 mg/L) y H3BO3 (0.01 mg/L). De la solución 2 se debe tomar 1mL y adicionarlo a 1L de la solución 1.

Solución de etanol, ácido acético o acetato de sodio

Estas soluciones se utilizaran en el ensayo AME, como sustrato para el reactor denominado “control”. Para determinar la DQO que genera la solución del reactor “control” se sigue el siguiente procedimiento:

Etanol 𝑪𝟐𝑯𝟔𝑶

𝐶2𝐻6𝑂 + 𝑂2 → 𝐶𝑂2 + 𝐻2𝑂

Al balancear la ecuación se tiene:

𝐶2𝐻6𝑂 + 3𝑂2 → 2𝐶𝑂2 + 3𝐻2𝑂 El peso molecular es:

𝐶2 → 2 × 12.011 = 24.022 𝑔/𝑚𝑜𝑙

𝐻6 → 6 × 1.008 = 6.048𝑔/𝑚𝑜𝑙

0 → 1 × 15.999 = 15.999 𝑔/𝑚𝑜𝑙

𝐶2𝐻6𝑂 → 46.07 𝑔/𝑚𝑜𝑙

92

3𝑂2 → 3 × 2 × 15.999 = 96 𝑔/𝑚𝑜𝑙

Esto indica que:

46.07 𝑔/𝑚𝑜𝑙 𝐸𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 ↔ 96 𝑔 𝐷𝑄𝑂/𝑚𝑜𝑙 Para determinar cuántos gramos de Etanol se necesitan para hacer una solución con una DQO de 100 gDQO/L, se realiza una regla de tres, lo que indica que se necesitan 47.99 g/mol. Como el 𝐶2𝐻6𝑂 está en presentación liquida, se necesita la densidad para poder determinar el volumen que dan una DQO de 100 gDQO/L.

𝜌 𝐶2𝐻6𝑂 = 0.79 𝑔 𝑐𝑚3⁄

𝜌 = 𝑚

𝑉 , 𝑉 =

𝑚

𝜌

𝑉 =𝑚

𝜌=

47.99

0.79= 60.75 𝑐𝑚3 = 60.75 𝑚𝐿

Es necesario adicionar 60.75 ml de etanol en 1 litro de agua destilada, para obtener una solución con la DQO deseada.

Ácido acético 𝑪𝟐𝑯𝟒𝑶𝟐

Para la preparación de la solución de ácido acético de 100gDQO/L, se deben adicionar 89.37 ml de ácido acético en 1 litro de agua destilada, para obtener una solución con la DQO deseada.

Acetato de sodio 𝑵𝒂 𝑪𝟐 𝑯𝟑 𝑶𝟐

𝑁𝑎 𝐶2 𝐻3 𝑂2 + 𝑂2 → 𝐶𝑂2 + 𝐻2𝑂 + 𝑁𝑎

Al balancear la ecuación se tiene:

2𝑁𝑎 𝐶2 𝐻3 𝑂2 + 7

2𝑂2 → 4𝐶𝑂2 + 3𝐻2𝑂 + 2𝑁𝑎

El peso molecular es:

93

𝐶2 → 2 × 12.011 = 24.022 𝑔/𝑚𝑜𝑙

𝐻3 → 3 × 1.008 = 3.024 𝑔/𝑚𝑜𝑙

𝑂2 → 2 × 15.999 = 31.998 𝑔/𝑚𝑜𝑙

𝑁𝑎 → 1 × 22.989 = 22.989 𝑔/𝑚𝑜𝑙

2𝑁𝑎 𝐶2 𝐻3 𝑂2 → 82.033 𝑔/𝑚𝑜𝑙

7

2𝑂2 →

7

2× 2 × 15.999 = 111.99 𝑔/𝑚𝑜𝑙

Esto indica que:

82.033𝑔

𝑚𝑜𝑙𝐴𝑐𝑒𝑡𝑎𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑑𝑖𝑜 ↔ 111.99 𝑔 𝐷𝑄𝑂/𝑚𝑜𝑙

Sin embargo este valor corresponde a lo que producen dos moles de acetato de sodio, lo producido por un solo mol es:

111.99 𝑔/𝑚𝑜𝑙

2 ∗ 82.033 𝑔/𝑚𝑜𝑙 = 0.6826 𝑔 𝐷𝑄𝑂/𝑚𝑜𝑙

Se debe preparar una solución de 146,4 g de acetato de sodio en 1 L de agua destilada para garantizar una concentración de 100 g DQO/L.

F. PROCEDIMIENTO

En la Figura 3 se presenta el procedimiento detallado para realizar el ensayo AME.

94

Realizar ensayos para

caracterización del lodo y sustratos

Metodología para el ensayo de actividad metanogénica específica

Disponer de los recipientes de vidrio con

sus tapones de caucho y agrafes metálicos

Determinar volúmenes y

concentraciones

Medición de pHDQO

Volumen total de la mezcla

Concentración del lodo en la mezcla

Volumen del lodo c/reactor

Masa de microorganismos

Volumen del sustrato

Sólidos

Concentración del lodo

A

APreparar la solución de

nutrientes

Colocar en cada reactor el

volumen indicado de lodo,

sustrato y solución de nutrientes

Tapar cada reactor con el

caucho y sellar el agrafe

Purgar cada reactor con un gas

inerte ( Helio, argón o nitrógeno)

Colocar barra magnética

si el ensayo es con

agitación constante

Agitación magnética o manual

Coloque dos agujas en el

caucho, una conectada

al gas y otra libre para la

salida del oxigeno

Sacar máximo 10% de la

mezcla para ensayos

C

Aliviar la presión al interior del

frasco utilizando una aguja

Identifique cada unos de

los reactores

B

95

C

Colocar los reactores en la

cámara y garantizar las

condiciones de temperatura

Temperatura entre

30°C y 35°C

B

Monitorear la producción

de metano

Tomar muestras con

jeringas cada 5 horas y

hacer inyecciones en

cromatógrafo de gases

Mantener en la cámara

hasta que se estabilice

la producción de metano

Retirar reactores de la

cámara y hacer ensayos

finales

Tanto al inicio como al

final del ensayo

Realizar ensayos de

caracterización de cada

reactor

Medición de pH

DQO, Solidos y AVT

Figura 3. Procedimiento para ensayo AME

G. CÁLCULOS

Volumen total de la mezcla: este volumen se determina según la capacidad de las botellas serológicas, aunque se recomienda aumentar este volumen aproximadamente 115 mL, volumen que se utiliza en la realización de los ensayos de AVT, DQO, STV y pH, al realizar este aumento se garantiza tener muestra suficiente para ensayos y para agregar a cada reactor.

𝑉𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 = 𝑉𝐵𝑜𝑡𝑒𝑙𝑙𝑎 − 1

3𝑉𝐵𝑜𝑡𝑒𝑙𝑙𝑎 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 1

96

Volumen de lodo para cada botella: se debe conocer la concentración de sólidos totales volátiles del lodo (𝐶𝑙𝑜𝑑𝑜) y la concentración deseada y según las condiciones de agitación (𝐶𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎)

𝑉𝑙𝑜𝑑𝑜 = 𝑉𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 ∗ 𝐶𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎

𝐶𝑙𝑜𝑑𝑜 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 2

Volumen de lodo para cada botella:

𝑉𝑙𝑜𝑑𝑜 = 𝑉𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 ∗ 𝐶𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎

𝐶𝑙𝑜𝑑𝑜 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 3

Masa de microorganismos en cada botella:

𝑀𝑙𝑜𝑑𝑜 = 𝑉𝑙𝑜𝑑𝑜 ∗ 𝐶𝑙𝑜𝑑𝑜 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 4

Volumen de sustrato: este volumen corresponde a la cantidad de solución que se debe adicionar a cada reactor para obtener la DQO deseada (𝐷𝑄𝑂𝑑𝑒𝑠𝑒𝑎𝑑𝑎). Depende la de demanda química de oxigeno de la solución madre (𝐷𝑄𝑂𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒) y el volumen de mezcla (𝑉𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎)

𝑉𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 = 𝐷𝑄𝑂𝑑𝑒𝑠𝑒𝑎𝑑𝑎 ∗ 𝑉𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎

𝐷𝑄𝑂𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 5

Volumen de solución de nutrientes:

𝑉𝑛𝑢𝑡𝑟𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒𝑠 = 𝑉𝑚𝑒𝑧𝑐𝑙𝑎 − (𝑉𝑙𝑜𝑑𝑜 + 𝑉𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜) 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 6

H.CALCULO DE LA AME

La producción de metano debe ser calculada teniendo en cuenta las condiciones de temperatura y presión atmosférica bajo las cuales se desarrolla el ensayo y se expresa como gDQOCH4/gSTVdía.

97

Para su cálculo es necesario identificar las variables iniciales:

𝑉𝐿𝑜𝑑𝑜 = Volumen del lodo adicionado en el reactor (mL)

𝐶𝐿𝑜𝑑𝑜 = Concentración de solidos volátiles del lodo (gSVT/mL)

Temperatura del ensayo expresada en Kelvin

Atmosferas del ensayo

Producción de metano en el rango de tiempo estudiado

𝑀𝐿𝑜𝑑𝑜= Masa de microorganismo (gSTV)

Con la información de las variables iniciales se realizan los siguientes cálculos y se realizan las gráficas indicadas a continuación:

Gráfica producción acumulativa de metano, en la cual se indica el volumen de CH4 producido en los diferentes periodos de tiempo. Esta grafica por lo general es como la mostrada en la Figura 4 y de la que se obtiene la tasa de producción de

volumen de metano (𝑑𝑉𝐶𝐻4

𝑑𝑡).

Figura 4. Producción acumulada de metano

Cálculo de la velocidad de producción de masa

𝑑𝑀𝐶𝐻4

𝑑𝑡(

𝑔𝐶𝐻4

ℎ) =

𝑑𝑉𝐶𝐻4

𝑑𝑡∗

𝑃𝐾

𝑅𝑇 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 7

98

Donde: 𝑃=Presión atmosférica 𝐾= Carga orgánica digerida correspondiente a un mol de metano. 𝑅= Constante de los gases 𝑇= Temperatura

Cálculo de la DQO ejercida por el metano producido

Considerando la reacción del metano 𝐶𝐻4 + 2𝑂2 → 𝐶𝑂2 + 2𝐻2𝑂, en la que una mol de metano consume dos de oxígeno.

𝑑𝐷𝑄𝑂

𝑑𝑡(𝑔

𝑂2

ℎ) =

𝑑𝑀𝐶𝐻4

𝑑𝑡∗

64 𝑔 𝑂2

16 𝑔 𝐶𝐻4 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 8

Cálculo del valor de actividad metanogénica especifica

𝐴𝑀𝐸 (𝑔𝐷𝑄𝑂/𝑔𝑆𝑇𝑉. 𝑑í𝑎) = 𝑑𝐷𝑄𝑂

𝑑𝑡 ∗

24

𝐶𝐿𝑜𝑑𝑜 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 9

Ejemplo de cálculo:

Variables iniciales:

Volumen del lodo adicionado: 22 mL

Sólidos volátiles en el lodo: 0.01725 gSTV/mL

Concentración del lodo en la mezcla: 5 gSTV/L

Masa de microorganismos: 0.380 g

Temperatura del ensayo: 305 °K

99

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 100 200 300 400 500 600

Vo

lum

en (

mL

)

Tiempo (Horas)

Evolución temporal del CH4

Tabla 1. Producción de metano

Tiempo acumulado (Horas)

Volumen CH4 (mL)

0 0,001

24 0,170

96 0,814

120 0,857

144 0,835

264 0,685

288 0,482

312 0,494

360 0,522

432 0,502

480 0,470

Figura 5. Producción acumulativa de metano

Como se identifica en la Figura 5 el comportamiento no es estrictamente igual al mostrado en la Figura 4, si se considera necesario se puede hacer un tratamiento a las datos, considerando aspectos como, si hubo un tiempo muy prolongado entre alguna toma de muestra, variaciones con los cromatogramas entre otros aspectos.

El cálculo de la AME, corresponde a la pendiente del tramo más empinado de la curva, seleccionado estos datos se realiza la Figura 6:

100

y = 0,0076x + 0,0037R² = 0,9823

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 20 40 60 80 100 120 140

Volu

men (

mL)

Tiempo (Horas)

Evolución temporal del CH4

Figura 6 Evolución temporal del metano

El cálculo de la velocidad de producción de masa, se realiza con la Ecuación 7, y se obtiene

𝑑𝑉𝐶𝐻4 = 7.568𝑥10−9 𝑚3𝐶𝐻4/ℎ

𝑑𝑀𝐶𝐻4

𝑑𝑡(

𝑔𝐶𝐻4

ℎ) = 7.568𝑥10−9 ∗

98400 ∗ 16000

8.14472 ∗ 305≈ 0.00479

𝑔𝐶𝐻4

ℎ

El cálculo de la DQO ejercida por el metano producido, según la Ecuación 8 es:

𝑑𝐷𝑄𝑂

𝑑𝑡(𝑔

𝑂2

ℎ) = 0.00479 ∗

64 𝑔 𝑂2

16 𝑔 𝐶𝐻4 ≈ 0.019 𝑔

𝑂2

ℎ

El cálculo del valor de actividad metanogénica específica, según la Ecuación 9 es:

𝐴𝑀𝐸 (𝑔𝐷𝑄𝑂

𝑔𝑆𝑇𝑉 𝑑í𝑎) = 0.019 ∗

24

0.380= 1.213

𝑔𝐷𝑄𝑂

𝑔𝑆𝑇𝑉 𝑑í𝑎

101

20. MÉTODO PARA DETERMINACIÓN DE AZÚCAR


El contenido total de hidratos de carbono en medios líquidos como extractos y alimentos puede ser determinado en forma de azúcares simples, ya que todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados recordando que estos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. Es importante recordar que los carbohidratos son particularmente sensibles a ácidos fuertes y altas temperaturas.

Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una deshidratación simple, si se continúa con un calentamiento, con la catálisis ácida y se añade fenol se producen derivados del furano que se condensan consigo mismo y con otros subproductos para producir compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos fenólicos y heterocíclicos.

Los compuestos coloridos formados son aquellos que van a ser cuantificados (método colorimétrico). Por medio de este método, se determinan azúcares simples, oligosacáridos, polisacáridos y sus derivados; que presentarán un color amarillo-naranja muy estable luego de que reaccionan con el fenol en presencia de ácido sulfúrico concentrado.

La intensidad del color naranja es proporcional a la cantidad de carbohidratos presente. La forma en que procede la reacción no es estequiométrica y depende de la estructura del azúcar, por lo que es necesario realizar una curva patrón.


Balón aforado 100 mL

Pipeta 10 mL

Tubos de ensayo

Pipeta automática 10 -100 µL

Pipeta automática 100 – 1000 µL

Balanza analítica

Cámara de extracción de humos y vapores tóxicos

Espectrofotómetro DR5000

102

C. REACTIVOS

Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) 95%

Fenol al 5% (m/v)

Agua destilada

Solución Patrón: Glucosa: 400mg/L

D. PREPARACION DE REACTIVOS

Preparación de la solución de Fenol al 5%(m/v)

Pesar 5.0 g de fenol grado reactivo y colocar en un balón de aforo de 100 mL, aforar con agua destilada hasta la señal del balón, homogenizar, preparar el reactivo en la cámara de extracción de humos y vapores tóxicos. Almacenar en frasco ámbar, rotular correctamente, éste reactivo es muy estable y debe ser mantenido a la temperatura del laboratorio.

Preparación del Stock de azúcar (400 mg/L)

El azúcar utilizado para la preparación de la curva de calibración dependerá del azúcar presente en las muestras que van a ser analizadas. Pesar 0,04 g de Sacarosa con exactitud hasta la décima de mg, disolver, ajustar a aforo de 100 mL con agua destilada, rotular correctamente y almacenar en nevera (4.0°C) para su posterior uso.

E. PROCEDIMIENTO

DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

La curva de calibración se realiza preparando varias concentraciones, en la Tabla. 1 se muestra las diferentes diluciones para la obtención de estas.

Tabla 1. Preparación de la curva de Calibración siguiendo recomendaciones de Dubois (1956).

N° Dilución 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Stock glucosa o sacarosa (mL)

0 2.5 5 7.5 10 12.5 15.0 17.5 20 25

Agua destilada (mL) 100 97.5 95.0 92.5 90.0 87.5 85.0 82.5 80.0 75.0

Glucosa o sacarosa (mg/L)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 100

103

Para la curva de calibración de concentraciones de azucares altas mayores de 100 mg/L se cambia la concentración Stock de azúcar, y se halla de la siguiente manera:

𝐶1𝑉1 = 𝐶2𝑉2

(400 𝑚𝑔/𝐿) ∗ 25𝑚𝑙 = 𝐶2 ∗ 2.5𝑚𝑙

𝐶2 =400 ∗ 25

2.5= 4000𝑚𝑔/𝐿

Se necesita una concentración de 4000mg/L para obtener con 2.5 ml de volumen una concentración de 100 mg/L de Azúcar; a continuación se muestra las diferentes concentraciones para la realización de la curva de calibración:

Tabla 2. Preparación de la curva de Calibración de alta concentración

N° Dilución 1 2 3 4 5 6

Stock glucosa o sacarosa (mL)

0 2.5 5 7.5 10 12.5

Agua destilada (mL) 100 97.5 95.0 92.5 90.0 87.5

Glucosa o sacarosa (mg/L)

0 100 200 300 400 500

Las concentraciones mayores a 500mg/L presentan absorbancias mayores de 3.5 que no lee el espectrofotómetro.

Se realiza el siguiente procedimiento ya teniendo las muestras preparadas:

En tubos de borosilicato con tapa rosca, añadir 1 ml de cada concentración

preparada y 1 ml de agua destilada para el blanco.

Adicionar 0.5 mL del reactivo de fenol al 5%.

Rápidamente adicionar de una sola vez 2.5 mL de ácido sulfúrico concentrado

tratando de no deslizarlo por las paredes del tubo.

Agitar inmediatamente tubo por tubo después de cada adición para capturar

algunos restos de ácido por las paredes del tubo.

104

Dejar incubar de 10 a 15 minutos fuera de la luz directa del sol.

Poner en baño de agua a temperatura ambiente por 30 minutos.

Leer la Absorbancia a longitud de onda de 490 nm o 492nm y realizar las curvas de

Absorbancia Vs. Concentración

La curva se debe realizar cada vez la solución de fenol se haya terminado.

DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE AZÚCARES

Se realiza el mismo procedimiento nombrado para la curva de calibración, si es necesario se hace dilución de la muestra cuando las contracciones sobrepasan el valor máximo de la curva.

F. CÁLCULOS

Los resultados se toman directamente del espectrofotómetro una vez se haya subido la curva hallada a este, si el resultado aparece fuera del rango asegurarse de realizar dilución. Si ha realizado diluciones de la muestra, tener en cuenta el factor de dilución para el cálculo final de la concentración de fosforo.

21. HIDROGENO Y METANO POR CROMATOGRAFIA GASEOSA

A.CONCEPTO

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de la muestra entre dos fases. Una fase es el lecho estacionario de extensa superficie empacada apretadamente dentro de una columna. Esta es la fase estacionaria y puede ser un sólido o una delgada película que recubre al sólido. La otra fase consiste en un gas o líquido que percola sobre la fase estacionaria denominada fase móvil.

En la cromatografía de gases, la fase móvil se denomina gas portador, ya que es un gas inerte cuya finalidad es transportar las moléculas a través de la columna. Los adsorbentes, tales como carbón vegetal, gel de sílice y tamices moleculares (zeolitas sintéticas) son las fases estacionarias en la cromatografía gaseosa. La adsorción diferencial sobre la superficie solida es la base para la separación en la cromatografía gas-solido.

105


Cromatógrafo de gases AGILENT 7890A con la siguiente configuración:

Columna capilar Carboxen 1010 plot

Flujo del Carrier, de Referencia y de Makeup: Argón.

Jeringa de cromatografía de 0.5 mL, en lo posible con sistema luer-gas tight.

Filamento: activo

Polaridad: Sin polaridad C. PROCEDIMIENTO

1. USO DE LAS VÁLVULAS – CILINDRO DE GAS

El gas de arrastre que emplea el cromatógrafo para medición de hidrogeno es el Argón, debido a que es el gas ideal para usar como gas de arrastre por su valor de conductividad. Los cilindros se encuentran ubicados en la caseta de gases cerca del laboratorio de calidad de aguas. Las llaves están encima del mesón del cromatógrafo (Llavero morado – central de gases), ver Figura 1.

Figura 1. Llaves de la central de gases.

El cilindro cuenta con una válvula la cual controla la salida del gas como se observa en la Figura 2 (a), ábrala totalmente en la dirección que indica la válvula.

El cilindro viene acompañado de una válvula y dos indicadores de presión como se ve en la Figura 2 (b). La presión que sale del cilindro a través de la tubería es regulada por la válvula central.

El indicador de la derecha o número 1 muestra la presión en el cilindro de gas reflejando la capacidad que tiene. El indicador de la izquierda o número 2 muestra la presión que llega a la válvula ubicada en el laboratorio y que controla la cantidad de flujo que utiliza el cromatógrafo.

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Gire la válvula 1 hacia la derecha (increase) hasta alcanzar un presión mayor de 80, si desde un principio indica un valor mayor a 80 gire hasta que el indicador 2 muestre un leve movimiento (La presión del indicador número 2 debe estar por el orden de los 100 psi), después de esto realice una purga del gas abriendo la válvula 2 dejando escapar la menor cantidad de gas y cierre nuevamente.

l

(a) (b)

Figura 2. (a) Válvula del cilindro y (b) Válvula e indicador de la primera estación.

Dentro del laboratorio en la cabina donde se encuentra el Espectrofotómetro de Absorción Atómica se encuentra una estación con una válvula que regula para cada gas la presión de entrada al aparato como se muestra en la Figura 3.

Esta estación contiene dos válvulas y un indicador. La válvula grande controla la presión de entrada al cromatógrafo mientras la válvula pequeña sirve para abrir los gases hacia el equipo. Como se ve en la Figura 3, el indicador número 3 muestra la presión de entrada al cromatógrafo para el gas Argón, el cual debe estar por el orden de 80 psi. Abra la válvula pequeña, debe estar completamente abierta antes de manejar el cromatógrafo y también abrir la válvula 3, de tal manera que su extremo apunte hacia abajo.

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Figura 3. Válvulas e indicador de la segunda estación.

2. CREACIÓN DE LA TÉCNICA DE DETECCIÓN DE GASES CON ARGÓN

a. Creación de un proyecto

Un proyecto es una carpeta donde se guardan distintos métodos cromatográficos. Además de estos métodos también se guardan los cronogramas , secuencias, conjuntos de resultados y toda la información obtenida al trabajar los métodos incluidos en el proyecto. Para crear un proyecto se empieza ingresando al icono OpenLab Control Panel en el escritorio, luego click en proyects al lado izquierdo de la pantalla, posteriormente se da click en create en la parte superior, como se ve en la Figura 4.

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Figura 4. Creación de un proyecto 1.

Cuando se ingresa a la ventana create Project se coloca en name el nombre del proyecto, en Proyect Folder Path se coloca el mismo nombre del proyecto en la siguiente forma, C:\Enterprise\Proyects\”nombre del proyecto”. Se presiona OK, como se ve en la Figura 5.

Figura 5. Creación de un proyecto 2.

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Finalmente, hacer click en la opción Instruments (parte inferior izquierda) y luego Instrument-PC, para luego seleccionar el proyecto donde que se quiere trabajar. b. Abrir el proyecto

Ingresar al OpenLab Control Panel para seleccionar el proyecto sobre el cual se va a trabajar y sobre el cual va quedar guardado el método y sus respectivos resultados. Haga clic en Browse, seleccionar “Hidrogeno con Argón”, y luego en Launch. Espere unos segundos a que se realice la conexión. Ver Figura 6.

Figura 6. Iconos para abrir el proyecto.

c. Creación del método

2.c.1 Pasos iniciales

Seleccionar en la barra de herramientas el menú Method, y luego la opción Instrument setup, ver la Figura 7.

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Figura 7. Creación del método.

En el siguiente cuadro seleccionar la opción Create a new method, ver Figura 8.

Figura 8. Creación de un nuevo método. 2.c.2 Inyector

Una vez que aparezca el siguiente cuadro, seleccionar el icono inlets para modificar los parámetros de operación, ver Figura 9.

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Figura 9. Ventana del inyector en modo Split.

Parámetros: Los parámetros para el método de detección de gases con gas Argón son:

Heater (activado): Temperatura del horno de 200 °C.

Preassure (activado): Presión del inyector de 8.0151 psi.

Septum purge flow (activado): Flujo que purga la septa de 3 mL/min.

Gas saber (On activado): Flujo del venteo del Split de 15 mL/min;

tiempo de espera para la dilución de la muestra en la columna de 2

min.

Mode (activado): Modo de inyección tipo Split; la relación de dilución

en el Split Ratio de 50:1; y flujo del Split de 75 mL/min.

2.c.3 Columna

Seleccionar el icono Columns para modificar los parámetros de esta, ver Figura 10:

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Figura 10. Ventana de la columna.

Se debe tener en cuenta que para hacer las respectivas modificaciones se debe seleccionar el tipo de columna en la parte superior izquierda (figura 10). En la parte derecha se deben ingresar los siguientes parámetros.

Los parámetros a modificar en la columna son:

Flow: El flujo que pasa a través de la columna es de 1.5 ml/min.

Pressure: La presión que pasa a través de la columna es de 8.0151

psi.

Average Velocity: La velocidad de flujo en la columna es de 25.267

cm/sec.

Holdup time: El tiempo de retención es de 1.9789 min.

Constant flow: Para un flujo constante que garantiza la presión

necesaria.

Post run: La velocidad de la circulación del gas es de 4.6758 mL/min.

Si la columna tiene especificaciones diferentes se debe ingresar estas en la opción Change Column, aparecerá una ventana como se muestra en la figura 11 donde podrá ingresar dichos parámetros.

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Figura 11. Especificación de Columna

Para poder seleccionar el gas de arrastre, se selecciona el icono Configuration, en la pestaña Modules en la cual se encuentra las opciones para activar los gases (Figura 12).

Figura 12. Selección gas de arrastre

Aquí se encuentran las siguientes opciones donde se debe seleccionar el gas con el cual se va a trabajar en este caso el Argon:

Front Inlet: Se selecciona el gas ArMe

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Front Detector: Como no se encuentra la opción de ArMe se selecciona el He por su similitud

Back Detector: Como no se encuentra la opción de ArMe se selecciona el He por su similitud

En la figura 13 se observa como deben quedar estos parámetros.

Figura 13. Selección gases

NOTA: Al finalizar el método y cargarlo al cromatógrafo, para verificar que el gas de arrastre se encuentre activo en el equipo se puede realizar el siguiente procedimiento. Pulsar el botón [Config], ubicado en la esquina inferior izquierda en el cromatógrafo, seguido seleccione en el display la opción Front Inlet con el botón [Enter].

Figura 14. Acceso a la selección del gas de arrastre Al seleccionar la opción Front Inlet aparecerá en el display las opciones Configured, Ignore Ready y Gas type, seleccione esta última opción con el botón

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[Mode/Type] ver figura 15, seguido busque el tipo de gas de arrastre que en este caso es el Argon methane 5% el cual tendrá un asterisco si es el adecuado (Figura 15).

Figura 15. Acceso a la selección del gas de arrastre Si se quiere cambiar el gas de arrastre desde el cromatógrafo, se selecciona el gas deseado con la tecla Enter, y para finalizar el proceso se hace clic derecho en la pantalla escogiendo la opción Upload Method From GC (figura 16).

Figura 16. Envío del método del cromatógrafo al computador

Antes de descargar el método al cromatógrafo, verifique en la sección Signals, que se encuentre activa la opción Front Signal (TCD), ver figura 17. Tener activa esta opción permite que el cromatograma se active en el momento de hacer la inyección y se pueda registrar los resultados de lo contrario no guardara información de los resultados de la inyección.

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Figura 17. Envío del método del cromatógrafo al computador 2.c.4 Horno

Seleccionar el icono oven para modificar los parámetros en los que va a trabajar el horno en el nuevo método, ver Figura 18.

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Figura 18. Ventana del horno.

Parámetros:

Revisar las siguientes opciones:

Oven temp on (activada): Primera temperatura de la rampa de

temperaturas es de 40 °C.

Equilibration time: Tiempo en que se equilibra el horno antes de

colocar otra muestra es de 1 min.

Maximun oven temperatura: Temperatura máxima que soporta la

columna es de 250 °C.

Programación de temperatura: A la derecha de la ventana aparece un cuadro que permite hacer la rampa de temperaturas según el método que se va a trabajar.

Fase inicial (initial):

o Value °C: Colocar 40 °C. o Hold Time: Colocar 2 min.

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o Run time: Colocar 2 min.

Rampa 1: o Rate: Colocar 5 °C/min. o Value °C: Colocar 60 °C. o Hold Time: Colocar 0 min. o Run time: Colocar 6 min.

Rampa 2: o Rate: Colocar 25 °C/min. o Value °C: Colocar 95 °C. o Hold Time: Colocar 5 min. o Run time: Colocar 12.4 min.

Rampa 3: o Rate: Colocar 24 °C/min. o Value °C: Colocar 230 °C. o Hold Time: Colocar 5 min. o Run time: Colocar 23.025 min.

2.c.5 Detectores

Seleccionar el icono detectors para modificar sus parámetros de funcionamiento, ver Figura 19.

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Figura 19. Ventana del Detector. En el icono TCD-Front se verifica el estado de los siguientes parámetros:

Heater (activado): Temperatura de 250 °C.

Reference Flow (activado): El flujo de la referencia es de 27 mL/min.

Makeup Flow (activado): El flujo es de 12 mL/min.

Filament: Seleccionar la opción para activarlo.

Negative Polarity: Seleccionar la opción para activarlo.

En el icono FID-Back se verifica el estado de los siguientes parámetros:

Heater: Temperatura del detector no activado.

H2 flow: Flujo de hidrogeno a través del detector no activado.

Air flow: Flujo de aire a través del detector no activado.

Makeup flow: No activado.

Flame: Llama que quema los hidrocarburos, siempre debe estar activada.

d. Guardar el método

Una vez que se han modificado todos los parámetros del método a desarrollar se procede a guardarlo en su respectivo proyecto, se va a file>save as >method.

e. Descargar el método

Para descargar el método al cromatografo, hacer click boton izquierdo del mouse>Download method to GC. Luego oprima OK.

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Figura 20. Opción descargar método.

Espere 5 minutos hasta que el cromatógrafo llegue a las condiciones del método, pulse [Status] para ver qué parámetros no están listos, el método estará listo cuando en el display aparezca “Waiting for prep run-Front inlet purging”.

f. Analizar las muestras de gas patrón

Una vez descargado el método al cromatógrafo, se deben realizar las inyecciones manuales del gas patrón (25% de Hidrogeno, 25% Nitrógeno, 25% Metano y 25% Dióxido de Carbono), con concentraciones de 0.3 ml, 0.4 ml y 0.5 ml (realizar tres replicas por cada concentración). Luego se presiona el icono single run, ver Figura 21.

Figura 21. Cilindro gas patrón, jeringa e icono de single run. A continuación aparece un recuadro, ver Figura 22, en el que se tiene que completar la siguiente información:

Sample ID: Colocar el nombre de la muestra que será inyectada, ejemplo: R1.0.3 ml, R2.0.3ml, R3.0.3ml, R1.0.4ml, R2.0.4ml, R3.0.4ml, R1.0.5ml, R2.0.5ml, R3.0.5ml.

Method: Aparece el método por defecto.

Data File: Colocar el mismo nombre de Sample ID.

Result Path: Seleccionar la carpeta donde se van a guardar los resultados.

Result Name: Colocar el mismo nombre de Sample ID y de Data File.

Number of resp: Recomendable dejar el valor de 1.

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Figura 22. Ventana de single run.

Una vez completada la información se presiona start. Luego de oprimir el botón Status y que el display del cromatografo muestre ready for inyection, se realiza la inyección y se presiona start en el cromatografo en el menor tiempo posible ver Figura 23.

Figura 23. Método de Inyección

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Este método tiene una duración de 25 minutos el cual se puede verificar pulsando [Status] donde se muestra el tiempo de análisis.

Al finalizar el análisis en la pantalla aparece una ventana la cual indica si quiere guardar los cambios en el método, a lo cual siempre debe pulsar “NO”, ver Figura 24.

Figura 24. Ventana para aceptar cambios en el método.

En seguida se mostrara el cromatograma con los picos con el nombre de cada gas (Figura 25).

Figura 25. Cromatograma.

Si desea realizar otra inyección presione nuevamente el icono single run y siga los pasos ya descritos.

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g. Abrir los resultados

Para abrir los resultados se debe hacer click en File>Open>Data. Luego se busca el resultado en la ventana open data file y una vez seleccionado se da click en open, ver Figura 26.

Figura 26. Ventana de open data. h. Proceso de integración

2.h.1 Ingreso a los eventos de integración

Una vez se abre el cromatograma o el dato, el primer paso es analizar los resultados y ubicar los picos de interés que suelen ser los más sobresalientes.

Para empezar a hacer la integración es necesario hacer click en integratión events en la hoja de navegación donde nos aparece un cuadro como el de la figura 27 con los parámetros de integración threshold y widht.

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Figura 27. Integration events.

2.h.2 Zoom y full unZoom

Para observar los picos de los analitos que suelen ser pequeños con respecto a la totalidad del cromatograma, se deben realizar acercamientos a la línea que traza el cromatograma. Para esto, se dibuja un cuadro negro con el click izquierdo del mouse sobre el sector que se quiere analizar como se ve en la Figura 28.

Figura 28. Zoom en el cromatograma.

Para volver a ver la totalidad del cromatograma se presiona sobre el resultado click derecho > full unZoom.

2.h.3 Programación grafica

Para realizar la integración de los picos de interés (Hidrogeno, Nitrógeno, Metano y dióxido de Carbono), primero se debe escoger el cromatograma que presente mayor ruido; luego se presiona click derecho sobre el cromatograma>Grafical Programming, como se ve en la figura 29.

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Figura 29. Herramientas del grafical programming.

Grafical programming nos permite obtener todas las herramientas o “eventos” para realizar la integración que se requiere, se recomienda usar las 5 más comunes en el siguiente orden:

Width: Se indica el ancho mínimo de los picos que detecta el programa en el cromatograma. Para el caso del ancho es recomendable seleccionar el punto inicial y el punto final del pico más pequeño que se quiere analizar cuando el programa nos lo pregunta una vez abrimos la herramienta, ver Figura XX.

Figura 30. Herramientas del grafical programming.

Luego aparece la siguiente ventana, ver Figura 30, la cual pregunta Add to table y Analyze now; es recomendable hacer click en Analyze now.

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Figura 31. Configuración Evento Width.

Threshold: Sirve para detectar en la línea base el inicio y el final de un pico, con el fin de decidir que es ruido y que es señal. Primero se define con el punto inicial y el punto final una región de la línea base donde no haya picos de interés. Posteriormente ir aumentando el valor para que el programa reconozca los picos más pequeños como ruido y solo se obtengan los picos que nos interesan.

Negative peak: Sirve para definir una región donde queremos que se detecte un pico negativo, Ver Figura 31.

Figura 32. Ejemplo de pico de Hidrógeno negativo y la presencia de ruido en

el cromatograma.

Integrafion off: Cuando se detectan picos fuera del área de interés es recomendable usar la herramienta integratión off, donde se nos pregunta el tiempo inicial y final de una región que deseemos que no tenga picos.

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Minimum área: Es una herramienta que abarca el tiempo inicial y final todo el cromatograma, en la cual se coloca un área para que detecte solo los picos por encima de esta misma. Esta opción debe ser usada cuando la opción de Anotaciones este activada (ver numeral 2.8.4), para que nos muestre las áreas de cada pico de interés.

Los valores de los eventos de integración pueden ser modificados en la tabla “Integration Events – Front Signal”, Figura 33, que se encuentra debajo del cromatograma. Cada vez que se realice una modificacion, hacer click en la opción Analysis, de la barra de tareas, y luego click en Analyze.

Figura 33. Ejemplo de método de integración.

Recomendaciones en la integración

o Es recomendable empezar las integraciones con los estándares de más baja concentración y con los picos más pequeños y más problemáticos.

o Es importante eliminar los parámetros que sobran desde la tabla de eventos de integración para que no afecte el análisis, se dejan en blanco y se analiza el cromatograma.

o Cuando en los parámetros de threshold y widht hay un solo intervalo de tiempo, ese valor se aplica para todo el cromatograma. Cuando esta dos veces el mismo parámetro con distintos intervalos de tiempo y diferentes valores, la herramienta opera de forma distinta en los dos intervalos del cromatograma.

Una vez se tiene la metodología de integración lista y se han integrado los picos que queremos, se pueden abrir otros resultados con distintas

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concentraciones y el mismo método para analizar todos los resultados. Finalmente se guarda el método.

2.h.4 Anotaciones

Es una opción que nos permite visualizar en el cromatograma la información que queremos, ya sea altura, área, nombre del pico, tiempo de retención, platos teóricos, resolución, etc. Se abre haciendo click derecho sobre el cromatograma y luego click en annotations. En el cuadro Trace Annotations Properties se elige la información que se

quieren ver y se pasa al lado derecho con la flecha verde para luego dar OK,

ver Figura 34.

Figura 34. Propiedades de anotaciones.

i. Creación de una tabla de picos

Es una tabla donde se definen y organizan los picos de los cromatogramas integrados para realizar las curvas de calibración. Inicialmente se hace click se hace click en peaks/groups table en la hoja de navegación. Se abre el primer dato de la secuencia File>Data>Open, y se definen individualmente los picos con el grafical programming, haciendo click derecho>grafical programming>define single peak. Se obtiene un cuadro como el de la Figura 35.

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Figura 35. Creación de una tabla de picos.

En el cuadro anterior, se asigna los tiempos de retención a cada pico. También se introduce la información que se pide a continuación:

Peak name: Se coloca el nombre del compuesto o analito que se está evaluando; Ej: Hidrógeno, Nitrógeno, etc.

Conc level: Primero se indica el nivel (Ej: 1, 2, 3, etc) y luego se coloca la concentración o volumen en la que está trabajando la muestra en ese cromatograma; Ej: 0.5 mL, 0.4 mL, etc.

Units: Se colocan las unidades del volumen puesto anteriormente; Ej: µL si se trabajan microlitros o mL si se trabajan mililitros.

Retention time window: Es un porcentaje recomendado para la ventana de retención relativa; valor recomendable de 2%.

Una vez se han colocado todos los parámetros en el cuadro se presiona Next pasando al siguiente pico. El valor del tiempo de retención cambia automáticamente cuando se ingresa al pico siguiente. Cuando se llega al último pico se presiona Done. Las características de cada pico pueden ser modificadas en el cuadro que se encuentra debajo del cromatograma, ver Figura 36.

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Figura 36. Tabla picos.

En cada columna aparecen distintas características de cada pico como son:

Name: Aparece el compuesto que representa cada pico.

Ret Time: Aparece el tiempo de retención de cada compuesto.

Window: Es el Retention time window previamente definido, a medida que el tiempo de retención es más grande la ventana es mayor y abarca más espacio.

Ref ID#: Se utiliza cuando se emplean picos de referencia para los tiempos de retención. Su valor es 0.

ISTD ID#: Se utiliza cuando se está usando estándar interno. Su valor es 0.

Resolution ID #: Sirve para calcular la resolución o separación entre dos picos, por defecto su valor es 0.

Units: Aparecen las unidades empleadas en la concentración.

Rt Update: Actualiza los tiempos de retención cuando se mueven los picos. Por defecto aparece None.

LOD: Se definen los límites de detección; valor estándar 0.

LOQ: Se definen los límites de cuantificación; valor estándar 0.

Quantitative: Se coloca la forma de cuantificar ya sea por altura o por área que es lo recomendable.

Fit Type: Indica cómo se ajusta la curva de calibración, lo más adecuado es dejar este campo en Linear.

Zero: Se emplea para que la curva de calibración comience en el origen (0,0), es lo recomendado según la teoría cromatográfica.

Calibratión Flag: Indica con que inyecciones se realiza la calibración según estas dos opciones:

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o Replace: Para hacer la calibración con la última inyección. o Wt Average: Para hacer la calibración con el promedio de todas las

inyecciónes lo cual es lo recomendado.

Calibratión Weight: Se asigna un factor de peso al promedio de las

inyecciones de las réplicas, pero va a reemplazar el factor de respuesta que

existía en el anterior método; el valor recomendado es de 100.

Level 1,2,3…:Los niveles indican las concentraciones que se colocan para realizar las curvas de calibración, ver Figura 37.

Figura 37. Niveles de concentraciones en la tabla de picos.

Una vez revisadas todas las características, se procede a guardar el método.

j. Calibración

El proceso de calibración se realiza a partir de una secuencia de las réplicas con diferentes concentraciones que se deben hacer con el método ya establecido, para la creación de la secuencia se oprime el icono mostrado en la figura # que se encuentra en la parte superior izquierda de la pantalla, ahí aparecerá una ventana para la creación dela secuencia y se da doble clic al icono Blank.seq (figura 38).

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Figura 38. Creación de nueva secuencia

Aparecerá una ventana con una tabla donde se puede editar la secuencia, a continuación se mostrara cada una de las opciones que deben ser editadas y que debe ponerse en cada parámetro: Run Type: En esta columna al oprimir la flecha, aparecerá una ventana con varias opciones para elegir en este caso se elige la opción Begin Calibration (figura 39) Level: Se coloca el número de nivel que corresponde a cada una de las concentraciones que se va a utilizar empezando nivel 1 como la concentración más baja. Reps: Se coloca el número de replica que es para cada nivel Vial: Se coloca el vial que se va inyectar Sample: Se pone un nombre que especifique el proceso que se está realizando que en este caso podría ser Calibración. Method: Se escoge el método al cual se le va realizar la calibración Fliename: Se busca la inyección que corresponde al nivel y el número de replica que se vaya a evaluar. Al llenar la primera fila se da doble clic en la fila siguiente y se habilitaran más filas para seguir introduciendo los niveles restantes con sus respectivas replicas. Después de esto selecciones una serie de líneas las cuales alcancen para el total de datos por la columna Run#, clic derecho sobre esta selección y escoja la opción Fill Down (figura40). Aparecerá una ventana como muestra la figura 41, en el primer botón de flecha que aparece en Simple ID dele clic y escoja la opción Increment Number, oprima el botón Ok.

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Figura 39. Opcion Begin Calibration

Figura 40. Fill Down

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Figura 41. Increment Number

Al final debe quedar una ventana como en la figura 42, donde aparecerán todos los niveles.

Figura 42. Ventana final con la secuencia completa

Aparecerán algunos valores y se modifican los niveles según la inyección que se haya cargado. Posteriormente se debe guardar la secuencia en el icono de la figura 43, y se da la opcion Save Sequence

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Figura 43. Salvar secuencia

Para analizar la secuencia se oprime en la opción Sequence que se encuentra ubicado en la parte superior, y se le da clic en Process (figura 44). Aparecerá una ventana como se muestra en la figura 45 donde se pone el nombre de la calibración y se presiona Start. Automáticamente la secuencia empezara a correr.

Figura 44. Opción para correr la secuencia

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Figura 45. Ventana para empezar a correr la secuencia Cuando el proceso esté completo los resultados estarán analizados. Recomendación en la calibración: Antes de realizar una calibración con distintas replicas para un mismo nivel, se recomienda desactivar la opción Automatically average consecutive replicates of the same level en el caso que no se promedien las réplicas. La opción se encuentra ubicada en method>propierties>calibration, ver Figura 46.

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Figura 46. Propiedades de la calibración.

k. Revisión de la calibración

Se da click en Review Calibration, en el menú que se encuentra al lado izquierdo, obteniéndose una ventana como la mostrada en la Figura 47.

Figura 47. Revisión de la calibración.

Sobre esta ventana se pueden observar ciertas características de la curva: Zoom: Haciendo zoom sobre alguno de los puntos se observa todos los puntos experimentales y el promedio en un diferente color, observar Figura 48.

Figura 48. Zoom en la revisión de la calibración.

Para volver al zoom original se presiona click derecho > full unzoom. Tabla de puntos: En el cuadro superior se puede observar toda la información característica de las muestras que se utilizaron para la curva de calibración. El componente correspondiente se escoge en el cuadro de la parte derecha. Posteriormente aparecen las áreas de cada replica con cada concentración, el archivo donde está guardado y su hora de calibración. Para cada componente, la tabla contiene:

RF: Indica el factor de respuesta promedio.

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Last Area: Indica el área en la última calibración.

Rep StDev: Desviación estándar de la réplica.

Rep %RSD: Porcentaje de desviación estándar de la réplica dependiendo el

volumen inyectado, normalmente debe estar debajo de 2%.

Información estadística: Toda la información estadística aparece en el cuadro de la derecha:

Average RF: Factor de respuesta promedio.

RF StDev: La desviación estándar.

RF %RSD: El RSD que mide la precisión media de los resultados.

Scaling: Indica si se aplicó alguna escala.

LSQ weighting: Indica el factor de mínimos cuadrados aplicada en la

calibración.

Force through zero: Indica si la curva de calibración pasa por el punto (0,0).

En el texto azul se indica la pendiente de la curva de calibración con “a“, el punto de corte con “b”, además del coeficiente de determinación. Haciendo click derecho sobre el cuadro de estadísticas se pueden cambiar todos los tipos de ajuste. Una vez se realicen los ajustes recomendados, se guarda los cambios en el método.

1. USO DEL PROGRAMA

1.1 Método de acondicionamiento

Para realizar el análisis de la muestras primero se necesita realizar una limpieza a la columna. Esto se hace abriendo el método de acondicionamiento.

Encienda el computador primero y luego el cromatógrafo con el botón blanco que se encuentra en la parte inferior izquierda, Ver Figura 49.

139

Figura 49. Cromatógrafo de gases y computador de control Haga clic en el icono OpenLab Control Panel>>Browse>>HidrogenoconArgon>>Launch. En la nueva ventana, oprima file > open > Method y seleccione “Acondicionamiento Argon”, y por ultimo oprima “Open”(Figura 50).

Figura 50: Apertura del método de acondicionamiento.

NOTA: A lo largo del análisis de muestras aparecerá una ventana la cual indica si quiere guardar los cambios, a lo cual siempre debe pulsar “NO”.

Se abrirá una ventana que muestra las condiciones del método; haga clic derecho y seleccione la opción “Download Method to GC”, el método se empezara a descargar cuando en la pantalla aparezca una confirmación “Download Method to GC” y oprima “OK” Figura 51.

140

Figura 51. Descargar un método al cromatógrafo

Espere 5 minutos hasta que el cromatógrafo llegue a las condiciones del método, pulse [Status] para ver qué parámetros no están listos, el método estará listo cuando en el display aparezca “Waiting for prep run-Front inlet purging”

Figura 52. Método descargado A continuación pulse [PREP RUN] el cual activa los procesos necesarios para poner el cromatógrafo en las condiciones de inicio que dicte el método y cuando el display muestre “Ready for inyection” pulse [START] para iniciar la limpieza.

Figura 53. Teclas Prep Run- Start

Este método tiene una duración de 38 minutos el cual se puede verificar pulsando [Status] donde mostrara el tiempo de análisis.

141

Figura 54. Tecla Status

1.2 Método de análisis

Para realizar el análisis de la muestra Oprima file > open > Method y seleccione “MetodoHidrogeno”, y por ultimo oprima “Open”.

Se abrirá una ventana que muestra las condiciones del método, haga clic derecho y seleccione la opción “Download Method to GC”, el método se empezara a descargar cuando en la pantalla aparezca una confirmación y oprima “Ok”; siga las mismas recomendaciones del anterior paso. La toma de la muestra se realiza directamente en el reactor desde la manguera por donde se libera el biogás producido, tomando volúmenes entre 0,4 a 0,7 ml según se haya estipulado por un tiempo de 30 segundos aproximadamente, mediante la jeringa tipo luer-gas tight de capacidad 1 mL. Cuando se descarga el método al cromatógrafo y se tiene la muestra preparada para ser inyectada manualmente, se presiona el icono Single Run, (Figura55).

Figura 55. Icono Single Run.

A continuación aparece un recuadro, en el que se debe diligenciar la siguiente información:

o Sample ID o Data File o Result Name

Una vez se ha llenado toda la información se presiona Start, y luego cuando el display del cromatógrafo muestre “ready for inyection” se inyecta la jeringa se desplaza la muestra, se retira la jeringa, y en seguida se presiona [START] para iniciar el análisis después de inyectar la muestra manualmente (Figura 56).

142

Figura 56. Confirmación para la inyección

Al finalizar el análisis (después de 25 minutos) en la pantalla aparece una ventana la cual indica si quiere guardar los cambios en el método, a lo cual siempre debe pulsar “NO”. En seguida se mostrara el cromatograma con los picos con el nombre de cada gas, el área y tiempo de retención. Para obtener el reporte de los resultados pulse el icono “reports” que aparece en la parte inferior y en seguida pulse “external estandard”, aparecerá un resumen de la concentración de cada gas como se muestra en la Figura 57. En la columna de concentración muestra el volumen de los cuatro gases y al final muestra el total del gas que fue inyectado realmente.

Figura 57. Cromatograma de la muestra.

143

Figura 58. Reporte de estándar externo generado para la muestra. Recomendación: Para guardar los Reportes realizados, debe ingresar al icono de “imprimir” (Figura 58); luego en la opción Name, seleccionar “CDS PDF-XChange S-33” y después OK. Espere unos segundos para que cargue el proceso de impresión para luego guardar el reporte en el destino deseado.

2.3 Método de apagado

Para apagar el equipo cierre la ventana haga clic en el icono OpenLab Control Panel>>Browse>>Induccion>>Launch. Espere mientras carga y oprima file>>Open>> Method y seleccione el que dice “Frio”, y por ultimo oprima “Start”.

Se abrirá una ventana que muestra las condiciones del método, haga clic derecho y seleccione la opción “Dowlound method”, el método se empezara a descargar cuando en la pantalla aparezca un mensaje de confirmación y oprima “Ok”.

Dejar entre 5 a 10 minutos que descargue el método, en seguida apague el computador, siempre se debe apagar primero el computador, luego cierre la válvula pequeña y apague el cromatógrafo.

Por ultimo cierre las válvulas de la caseta de gases.

144

D. CALCULOS

El cálculo de la concentración de los gases se realiza tomando como base los resultados de la concentración que aparecen en el reporte de estándar que se observa en la Figura 33. Para expresar los datos en unidades de % se hace el siguiente procedimiento:

a. En el reporte nos muestra la concentración de cada gas y el total de la muestra que fue analizada en esta caso los valores fueron:

Hidrogeno 0.003 Nitrógeno 0.269 Metano 0.046 Dióxido de carbono 0.079 TOTAL 0.397

% 𝑯𝟐 = 0.003 ∗100

0.397= 0.76%

% 𝑵𝟐 = 0.269 ∗100

0.397= 67.76%

% 𝑪𝑯𝟒 = 0.046 ∗100

0.397= 11.59%

% 𝑪𝑶𝟐 = 0.079 ∗100

0.397= 19.90%

Para expresar los resultados en unidades: mmol, mmol/L, umol, umol/L y mg/L se debe usar una planilla en Excel . Estas concentraciones se calculan con la ecuación de los gases ideales con los valores de presión y temperatura locales. El procedimiento es:

Para pasar a moles se utiliza la ecuación de los gases ideales:

𝑃𝑉 = 𝑛𝑅𝑇

𝑃 = 𝑃𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛 𝑎𝑡𝑚ó𝑠𝑓𝑒𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝐵𝑜𝑔𝑜𝑡á = 560 𝑚𝑚𝐻𝑔 → 0.74 𝑎𝑡𝑚

𝑉 = 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑔𝑒𝑛𝑜 = 0.003 𝑚𝑙 → 0.000003𝐿

145

𝑅 = 𝐶𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑒𝑟𝑠𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑔𝑎𝑠𝑒𝑠 𝑖𝑑𝑒𝑎𝑙𝑒𝑠 = 0.082𝐿 ∗ 𝑎𝑡𝑚

º𝐾 ∗ 𝑚𝑜𝑙

𝑇 = 𝑇𝑒𝑚𝑝𝑒𝑟𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎 𝑎𝑚𝑏𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = 15º𝐶 → 288º𝐾

𝑛 =0.74 ∗ 0.003

0.082 ∗ 288= 9.36𝐸 − 08 𝑚𝑜𝑙

Para pasar a mmol:

𝑚𝑚𝑜𝑙 = 𝑚𝑜𝑙 ∗ 1000 = 9.36𝑒 − 05

Para pasar a mmol/L:

𝑚𝑚𝑜𝑙

𝐿=

𝑚𝑀𝑜𝑙

𝑉𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑒𝑛 𝐿=

9.36𝐸 − 05

0.000397= 0.24

𝑚𝑚𝑜𝑙

𝐿

Para pasar a μmol:

𝜇𝑚𝑜𝑙 =𝑚𝑚𝑜𝑙

1000=

9.36𝐸 − 05

1000= 0.09𝜇𝑚𝑜𝑙

Para pasar a μmol/L:

𝜇𝑚𝑜𝑙

𝐿=

𝜇𝑚𝑜𝑙


0.09

0.000397= 236𝜇𝑚𝑜𝑙

Para pasar a gr: 𝑔𝑟 = 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 ∗ 𝑚𝑜𝑙 = 2 ∗ 9.36𝐸 − 08 = 1.87𝐸 − 04𝑔𝑟

Para pasar a gr/L:

𝑔𝑟

𝐿=

𝑔𝑟


1.87𝐸 − 04

0.000397= 4.72𝐸 − 04

Para pasar a mg/L:

𝑚𝑔

𝐿=

𝑔𝑟

𝐿∗ 1000 = 0.47𝑚𝑔/𝐿

146

ANÁLISIS DE SUELOS

21. MÉTODO PARA DETERMINAR CALCIO Y MAGNESIO SOLUBLES EN SUELO

A. MÉTODO CUANTIFICACIÓN COMPLEXOMÉTRICA.


Balanza analítica de 0.0001g de precisión.

Materiales.

Erlenmeyer de 125ml.

Pipetas aforadas de 1.5 y 20ml.

Microbureta de 10ml.

Soporte universal.

C. REACTIVOS

Solución EDTA 0.02N.

Solución patrón de Ca 0.02N.

Solución amortiguadora cloruro de amino-hidróxido de amonio.

Hidróxido de sodio 6N.

Solución de carbamato al 1.5%.

Indicador murexide.

Indicador Negro de Eriocromo T.

D. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Solución EDTA 0.02N

Pesar en un vaso de 250 ml 7.4448 g de sal disódica del ácido etilen-diaminotetraacético (𝐶10𝐻14𝑁2𝑁𝑎2𝑂82𝐻2𝑂), adicionar 100ml de agua destilada y agitar. Transvasar a un balón aforado de 2l y completar el volumen. Normalizar la solución estándar de ZnO 0.02N.

Solución patrón de Ca 0.02N

Pesar 1g de 𝐶𝑎𝐶𝑂3 Cp., pasar cuidadosamente la muestra a un erlenmeyer de 250 ml de forma alta. Tapar el vaso con un vidrio de reloj y agregar poco a poco HCL al 10%. Hasta que cese la efervescencia. Llevar a sequedad en plancha caliente y disolver luego el

147

residuo con HCL 0.01N. Pasar a un balón aforado de 1l y ajustar el volumen con el mismo ácido.

Solución amortiguadora cloruro de amino-hidróxido de amonio

Disolver 67.5g de cloruro de amonio en 570ml de hidróxido de amonio concentrado y llevar a 1l con agua destilada.

Hidróxido de sodio 6N

Disolver 240 g de NaOH, en 1l de agua destilada. Almacenar en frasco de plástico.

Solución de carbamato al 1.5%

Disolver 1.5g de sal del acidodietilditiocarbámatico en agua destilada y llevar a volumen de 100ml con agua destilada.

E. PROCEDIMIENTO

1. Del filtrado proveniente de la muestra de agua tomar con una pipeta aforada una alícuota de 5ml y colocar en un Erlenmeyer de 125ml. Llevar muestra a control y blanco de proceso.

2. Diluir con 20 ml de agua destilada y agregar 5ml de solución de carbamato. 3. Agregar 1ml de hidróxido de sodio 6N y mezclar bien. Agregar 0.05g de indicador

murexide. 4. Titular con EDTA 0.02N hasta que cambien el color de rosado a púrpura. 5. Consignar el número de ml de EDTA gastados. 6. Tomar una alícuota de 5ml con una pipeta aforada en un Erlenmeyer de 125ml. 7. Diluir con 20ml de agua destilada y agregar 1ml de solución buffer. 8. Agregar 5 gotas de solución de carbamato y agregar 0.05g de indicador negro

ericromo T. 9. Titular con EDTA hasta que desaparezca el color vinotinto y se torne azul celeste o

verde. 10. Anotar el número en ml de EDTA gastado.

F. CÁLCULOS

Se deben realizar los siguientes cálculos:

𝐶𝑎 + 𝑀𝑔𝑚𝑒𝑞

𝑙=

𝑉 ∗ 𝑁 ∗ 1000

𝐴𝑙í𝑐𝑢𝑜𝑡𝑎, 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 29

148

𝐶𝑎𝑚𝑒𝑞

𝑙=

𝑉 ∗ 𝑁 ∗ 1000

𝐴𝑙í𝑐𝑢𝑜𝑡𝑎

𝑚𝑔𝑚𝑒𝑞

𝐿=

𝑚𝑒𝑞

𝐿(𝐶𝑎 + 𝑀𝑔) − 𝑚𝑒𝑞/𝐿(𝑐𝑎)

Donde:

V = Volumen de EDTA gastados en la titulación.

N = normalidad del EDTA

149

22. MÉTODO PARA LA MEDICIÓN DE pH EN SUELOS

A. EQUIPOS Y MATERIALES

Potenciómetro.

B. REACTIVOS

Solución amortiguadora (Buffer) de ácido ftalato de potasio (0.05M).

Solución de cloruro de calcio.

Solución de cloruro de calcio (0.01M).

C. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Solución amortiguadora (Buffer) de ácido ftalato de potasio (0.05M)

Se disuelven 10.21g (secado por una hora) de ftalato en agua y se diluye hasta 1l. El pH de esta solución deberá ser 4.0 a 20°C. Se protege la solución contra la evaporación y la contaminación de mohos. Se debe remplazar la solución en presencia de mohos.

El efecto demuestra que el pH de la solución no cambia en los límites de temperatura de 5 a 37°C.

Solución de cloruro de calcio

Disolver 147 g de 𝐶𝑎𝐶𝑙2 ∗ 2𝐻2𝑂 en agua, en un frasco volumétrico de 1l, enfriar, diluir su volumen con agua y mézclese.

Solución de cloruro de calcio (0.01M)

Diluir en 20ml de solución de trabajo 1.0M 𝐶𝑎𝐶𝑙2 a 2l de agua. El pH de esta solución deberá estar entre 5 y 7.

D. PROCEDIMIENTO

1. Se coloca el suelo al aire para poder tamizarlo por un tamiz No. 10 (2mm). 2. Se pesan aproximadamente 10g de suelo seco al aire. Se coloca el suelo en un

recipiente de vidrio y se añaden aproximadamente 20ml de 𝐶𝑎𝐶𝑙2 0.01M. se mezcla por 30 minutos y se deja reposar por 30 minutos.

3. Leer el pH del medidor.

150

23. MÉTODO PARA LA MEDICIÓN DE LA MATERIA ORGÁNICA EN SUELOS

A. EQUIPOS Y MATERIALES

Horno.

Balanza (sensibilidad de 0.01g).

Mufla.

Crisoles o platos de evaporación.

Desecadores.

B. PROCEDIMIENTO

Preparación de la muestra

1. Se deberá tomar una muestra representativa, que pese al menos 100g, de una porción de material que pase el tamiz de 2mm.

2. Se coloca la muestra en un recipiente y se lleva al horno a una temperatura de 105°C para secarla hasta peso contante. Posteriormente se remueve la muestra del horno y se lleva a un desecador y se permite su enfriamiento.

Medición materia orgánica

1. Se coge una muestra que pese aproximadamente de 10 a 40g, se coloca en crisoles tarados o en platos de evaporación de porcelana y se pesa.

2. Se coloca el crisol o el plato que contiene la muestra dentro de la mufla durante 6 horas a 445°±10°C. Se saca la muestra de la mufla, se coloca en un desecador y se permite su enfriamiento.

3. Se remueve del desecador la muestra y se pesa.

C. CÁLCULOS

El contenido orgánico deberá expresarse como un porcentaje del peso del suelo en el horno de la siguiente forma

% 𝑑𝑒 𝑀𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎 𝑂𝑟𝑔á𝑛𝑖𝑐𝑎 =𝐴 − 𝐵

𝐴 − 𝐶𝑥100, 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 30

Dónde:

A = Peso del crisol más el suelo antes de la ignición.

B = Peso del crisol o plato de evaporación después de la ignición.

C = Peso del crisol.

151

ANALISIS MICROBIOLÓGICO

A.CONCEPTO

La evaluación de calidad microbiológica juega un papel importante dentro de las características que le confieren la calidad a un tipo de agua determinado, ya que su valoración supone un riesgo para la salud humana.

B.PRINCIPIO DEL MÉTODO

La filtración con membrana se utiliza un con un medio preparado a una temperatura de incubación de 44.5 ±0.2 °C, que permite diferenciar las heces que provienen de las heces de animales de sangre caliente y las procedentes de otras fuentes. El análisis mediante la filtración de membrana lleva de cerca de 24 ±2horas. Este método es capaz de detectar coliformes que crecen pobremente o fermentan lentamente.

La cantidad de muestra deberá ser escogida dependiendo del tipo de agua filtrada. En general, se recomienda que la cantidad de muestra sea de 100 ml. El siguiente cuadro muestra los volúmenes sugeridos de muestra para la cuantía de coliformes por la técnica de filtración de membrana (Tabla 9).

Tabla 1 . Volúmenes de muestra.

Fuente de agua Volumen (ml)

100 50 10 1 0.1 0.01 0.001

Agua para consumo humano x

Agua de piscina X

Pozos X X X

Lagos X x X

Aguas marinas x x X

Agua de rio x X X x

efluentes x x X

152

24. TÉCNICA DEL FILTRO MEMBRANA PARA MIEMBROS DEL GRUPO COLIFORME

A. PRINCIPIO DEL METODO

Este procedimiento se realiza para determinar la densidad de bacterias fecales en una muestra de agua o suelo.

Se trata de separar los microorganismos del agua por filtración a vacío a través de membranas filtrantes de 0.45 micras de tamaño de poro, y depositar las membranas con el residuo en cajas de Petri, que contienen un medio de cultivo M-FC para el crecimiento de los microorganismos que se desea determinar, en un soporte de papel de filtro.

Todo el material que se utiliza debe estar esterilizado con el objeto de que no exista contaminación externa.

El medio de cultivo propuesto es líquido ya que este medio tiene más facilidad para penetrar en los poros de las membranas y bañar la superficie de las mismas.


Placas de cultivo.

Unidades de filtración.

Filtro de membrana diámetro de poro de 0.45 µm

Almohadillas absorbentes (Pads).

Pinzas sin dientes esterilizados.

Incubadora.

Lupa para aumento.

C. REACTIVOS

Medio M-FC


Medio M-FC

La necesaria uniformidad obliga a emplear medios deshidratados. Nunca se preparan medios a partir de sus ingredientes básicos, si se dispone de medios deshidratados adecuados.

Para la rehidratación se siguen las instrucciones del fabricante. Para este caso y de acuerdo al producto que se tiene, se disuelve el 3.7g del polvo en 100ml de agua purificada o destilada, añadiendo 1ml de ácido rosólico al 1 por 100. Se debe calentar

153

hasta casi ebullición y dejar enfriar. Luego ajustar si es necesario el pH a 7.4.El medio debe ser usado para un solo día, luego desecharlo.

E. PROCEDIMIENTO

a. En el caso del suelo, en el laboratorio se debe tomar 5g del mismo en un tubo para centrifuga con 10ml de agua destilada y centrifugar a 2000 revoluciones durante 5 minutos. Luego tomar el sobrenadante como muestra para filtrar.

b. La selección del tamaño de la muestra dependerá de la densidad bacteriana que se espere, y estará limitada por el grado de turbidez o por el crecimiento de no Coliformes en el medio. Un volumen ideal de muestra es el que proporciona alrededor de 20 a 60 colonias fecales por membrana.

c. Se filtran 10 ml de cada muestra si la dilución es menor a estos. d. A cada caja Petri debidamente esterilizadas se pone un pad y se impregna con la

pipeta alrededor de 2 a 3 ml del medio M-FC, preparado como se ha descrito, hasta saturar el pad.

e. Se coloca con pinzas estériles un filtro de membrana estéril con la trama hacia arriba sobre la placa porosa del receptáculo, se sitúa la unidad de embudo sobre el receptáculo y se fija. Se filtra la muestra diluida o no según el caso y se hace un enjuague final con un poco de agua destilada. La filtración se lleva a cabo bajo un vacío parcial.

f. Luego se desconecta el proceso de vacío, se desbloquea y retira el embudo, inmediatamente se quita el filtro de membrana con unas pinzas estériles colocándolo sobre el pad impregnado con el caldo M-FC.

g. Se tapa cada caja y se voltea. Luego se llevan a incubación durante 24 ± 2 horas a 44.5°C ± 2°C.

h. Las colonias producidas por bacterias Coliformes Fecales en el medio M-FC presentan distintos matices de azul. Las colonias se cuentan a simple vista o mediante la lupa.

Usando los Nutrepads, el procedimiento y los materiales cambiaran:

EQUIPOS Y MATERIALES:

Nutrepads medio M-FC

Equipo de incubación.

Equipo de filtración

Micropipeta de 100 a 1000 uL

Papel aluminio

Beaker

Membrana filtrante (manipularlas con pinzas estériles)

Mechero

154

Procedimiento: a. El volumen estándar de la muestra a usar es de 100 ml; sin embargo, esta puede

variar usando diferentes diluciones, de acuerdo al origen de la muestra y la

cantidad de contaminantes que pueda poseer.

b. Usando la membrana de filtración se sigue el mismo procedimiento descrito en el

ensayo de sólidos.

c. Para la preparación de la placa de cultivo, primero se debe adecuar un ambiente

estéril por medio del uso del mechero, mientras dicha placa se satura con agua

destilada entre 2 ml- 3 ml.

d. Una vez la muestra sea filtrada, se coloca la membrana sobre la almohadilla que

contiene la placa de cultivo, se tapa y a continuación se voltea, de tal manera que

el caldo moje en su totalidad la membrana.

e. Par la incubación, se colocan las placas de cultivos ya preparadas dentro de un

beaker el cual será sellada por medio de una papel aluminio y evitar así la

humedad dentro de las placas. La incubadora húmeda debe encontrarse a una

temperatura de 44.5 ±0.2 °C, durante 24 ±2 horas.

Una vez pasado el tiempo requerido comienza con el conteo de colonias; las colonias que presentan matices azules son bacterias producidas por coliformes fecales; las colonias de color amarillos pueden ser E.Coli; y las colonias de color gris o cremoso son coliformes no fecales.

F. CÁLCULO

La densidad de Coliformes se presenta como el número total de colonias de una caja petri por el valor reciproco de la dilución empleada, es decir: (ver Ecuacion 31)

(𝑈𝐹𝐶/𝑚𝐿) = número de colonias ∗ E , 𝐸𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 31

Ejemplo:

a.Muestra sin duplicado

Dilución: 10−4

No de colonias encontradas: 180

Luego, se tiene: 180 x 104……….1.800.000 UFC/mL ó 1.8 x 106 UFC/mL

155

b. Muestra con duplicado.

Dilución: 103

Caja 1: número de colonias contadas: 37

Caja 2: número de colonias contadas: 45

Caja 1: 37000 UFC/mL

Caja 2: 45000 UFC /mL

Valor medio: 37000+45000

2= 41000

Resultado: 41000 UFC/mL o 4,1 x 104 UFC/mL

156

ANÁLISIS DE TOXICIDAD

25. ENSAYO DE TOXICIDAD TOTAL CON BULBOS DE CEBOLLA ALLIUM CEPA L

A. CONCEPTO

Cuando un bulbo de cebolla (Allium Sp.) se rehidrata se produce una estimulación del crecimiento de las células, lo cual permite la elongación de las raíces de la planta. Sin embargo, cuando la hidratación se lleva a cabo en presencia de sustancias tóxicas, la división celular de los meristemos radiculares puede inhibirse, ya sea retardando el proceso de mitosis o destruyendo las células. Este tipo de alteraciones generalmente impiden el crecimiento normal de la raíz, y por tanto su elongación (Fiskesjo 1985,1993, 1997).


Medidor de pH.

Balanza analítica.

Tubos de ensayo esterilizados.

Gradilla.

Pipeta graduada.

Agitador.

D. REACTIVOS

Ácido clorhídrico HCl (3M).

Sulfato Cúprico Pentahidratado CuSO4·5H2O. (Control positivo).

E. PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS

Control negativo

El control negativo se realizó con una muestra de agua de llave.

Control positivo

Se preparan tres diferentes soluciones de sulfato de cobre (CuSO4·5H2O) diluidas en agua así:

157

Al 25% 25 mg/L

Al 15% 15 mg/L

Al 5% 5 mg/L

Preparación de la muestra

El valor de pH de todas las muestras debe ser analizado y estandarizado en 7. De esta forma se descarta, que la inhibición en el crecimiento de la raíz pueda ser debido a que tan acida o básica este el agua.

Se deben realizar dos tipos de controles, el positivo utilizando solución de sulfato de cobre con el fin de inhibir por completo el crecimiento de la raíz y por otro lado el control negativo, el cual no posee ningún componente causante de inhibición (ej. Agua destilada o agua ultrapura).

Ambos controles se realizan con el fin de estandarizar la longitud de las raíces y determinar la toxicidad total.

F. PROCEDIMIENTO

Selección de los individuos

1. Seleccionar los bulbos de las cebollas que estén libres de contacto con pesticidas, con un diámetro aproximado de 20 mm.

2. Cortar las raíces muertas.

Figura 1. Selección de los bulbos de cebolla

158

MONTAJE DEL EXPERIMENTO

a. Retirar cuidadosamente la primera capa de piel de la cebolla, tomando cuidado de no lastimar la superficie donde crece la raíz.

Figura 2. Retirar cascara de la cebolla.

b. Determinar los diámetros de las cebollas hicimos uso de un calibrador, con el fin de establecer una medida promedio y lograr uniformidad.

c. Medir el pH de las muestras. d. Se exponen 12 bulbos a las muestras correspondientes, situando una por cada

tubo con el área radicular en contacto con la solución por 72 horas (3 días).

Positivo 1: Sulfato de cobre (CuSO4·5H2O) 25mg/L Efluente

Positivo 2: Sulfato de cobre (CuSO4·5H2O) 15mg/L Efluente

Positivo 3: Sulfato de cobre (CuSO4·5H2O) 5mg/L Afluente

159

Figura 3. Exposición de bulbos con diferentes diluciones

e. Se debe reponer hasta 1.5mL por cada tubo cada 24 horas con la muestra correspondiente (por que se pierde por evaporación), ayudados de una pipeta Pasteur manteniendo las raíces inmersas. Los bulbos deben estar alejados de fuentes luminosas, además de permanecer a una temperatura constante de 200C.

f. Las raíces son medidas en papel milimetrado, aquellas que sean muy largas o muy cortas deben ser descartadas.

G. CÁLCULOS

Porcentajes de inhibición (Soluciones al 100%)

𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 (%) =𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜−𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠

𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100

Ecuación 32

Calculo del CE50 – ensayo de toxicidad con Allium cepa L.

De acuerdo con Fiskesjo (1993), el CE50 en el ensayo de toxicidad con Allium cepa L, significa, la dilución de la sustancia estudiada que permite el crecimiento de la raíz del 50% cuando comparada con el control negativo. El cálculo se realiza con la ecuación 33:

𝐶𝑟𝑒𝑐𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑎í𝑧 (%) = 𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠

𝐿𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100, Ecuación 33

En la Tabla 8 se tiene un ejemplo de cálculo para un experimento realizado aplicando ozono en diferentes tiempos de reacción.

160

Tabla 8. Datos para cálculo del CE50

% crecimiento tratamiento 1 % crecimiento tratamiento 2 Dilución tratamientos (%)

38,78 64,24 100

44,90 65,31 50

67,35 89,90 25

61,25 80,61 12,5

La concentración CE50 se obtiene de forma gráfica así.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0

25

50

75

100

Cre

cim

iento

de

la r

aiz

(%)

Dilucion muestra (%)

Trat 1

Trat 2

CE50

=45%

Figura 4. Determinación del CE50 para un ensayo de toxicidad utilizando Allium cepa L.

161

BIBLIOGRAFÍA

APHA, AWWA, WEF. (2005). Standard methods for the examination of water & wastewater (21st ed.). Baltimore: Port City Press.

BARROS DE MACEDO, J. (2005). Métodos laboratoriais de análises físico-químicas e microbiológicas. (2ª.ed).Belo Horizonte: CRQ-MG.

ÇEÇEN, F. (1999). Investigation of sustrate degradation and nonbiodegradable portion in several pulp bleaching wastes. Water Science and Technology, 40(11-12), 305-312.

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Manual de protocolos

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