Manual de Técnicas y procedimientos para la detección de Vibrio ...

Manual de Técnicas y Procedimientos para la Detección de Vibrio cholerae en Agua y Alimentos. CCAyAC Ver. 01

1

SECRETARÍA DE SALUD

COMISIÓN FEDERAL PARA LA PROTECCIÓN CONTRA RIESGOS SANITARIOS

COMISIÓN DE CONTROL ANALÍTICO Y AMPLIACIÓN DE COBERTURA

Manual de Técnicas y Procedimientos

para la Detección

de Vibrio cholerae

en Agua y Alimentos.


2

Secretaria de Salud

Mercedes Juan López

Comisionado Federal Para la Protección Contra Riesgos Sanitarios

Mikel Andoni Arriola Peñalosa

Comisionada de Control Analítico y Ampliación de Cobertura

Armida Zúñiga Estrada

Comisionada de Evidencia y Manejo de Riesgo

Rocío del Carmen Alatorre Eden-Winter

Comisionado de Operación Sanitaria

Álvaro Israel Pérez Vega

Directora Ejecutiva de Control Analítico

Imelda Rocío Guzmán Cervantes

Directora Ejecutiva de Evidencia de Riesgos

Matiana Ramírez Aguilar

Director Ejecutivo de Programas Especiales

Aldo Verver y Vargas Duarte


3

Grupo Técnico CCAyAC

Gerencia de Análisis y Desarrollo de Pruebas Microbiológicas

Gerencia de Análisis y Desarrollo de Pruebas Inmunoquímicas y Biología Molecular

Con colaboración de:

Dirección Ejecutiva de Evidencia de Riesgos

Dirección Ejecutivo de Programas Especiales


4

ÍNDICE

1. Introducción………………………………………………………………………………. 5

2. Marco Legal……………………………………………………………………………… 6

3. Justificación………………………………………………………………………………. 8

4. Objetivo General………………………………………………………………………… 8

5. Marco Teórico……………………………………………………………………………. 8

6. Medidas de seguridad en el laboratorio de microbiología………………………….. 18

7. Procedimiento de muestreo……………………………………………………………. 19

8. Preparación de la muestra para el análisis de laboratorio…………………………… 27

9. Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa, aislamiento e identificación……………………………………………………………………………...

29

10. Informe final de resultados de laboratorio……………………………………………. 46

11. Lineamientos generales…………………………………..…………………………….. 46

12. Glosario……………………………………………………………………………………. 48

13. Símbolos y abreviaturas………………………………………………………………... 52

14. Bibliografía………………………………………………………………………………... 54

Anexo I. Método de concentración CDC…………………………………………………… 57

Anexo II. Materiales, medios de cultivo, reactivos y equipo de laboratorio requerido para el análisis microbiológico………………………………………………………………

65

Anexo III. Reactivos, formulación y condiciones de preparación de Medios de cultivo para el aislamiento e identificación de V. cholerae………………………………………

67

Anexo IV. Diagrama general para aislamiento e identificación de V. cholerae a partir alimentos………………………………………………………………………………………..

77

Anexo V. Diagrama general para el aislamiento de V. cholerae en moluscos bivalvos 78

Anexo VI. Diagrama general de análisis de hisopo de Moore para el aislamiento e identificación de V. cholerae a partir de agua y hielo para consumo humano......…….

79

Anexo VII. Diagrama general para el aislamiento e identificación de V. cholerae a partir de muestras de aguas residuales ...…………………………………………………..

80

Anexo VIII. Diagrama general del uso hisopo de Spira para aislamiento e identificación de V. cholerae a partir aguas ambientales…………………………………

81


5

1. INTRODUCCIÓN.

El cólera es una enfermedad diarreica infecciosa aguda causada por bacilos de Vibrio cholerae O1 u

O139 toxigénicos el cual es transmitido en algún vehículo de la cadena de transmisión causada por la

ingesta de agua o alimentos contaminados con bacilos de Vibrio cholera toxigénicos. En general, las

enfermedades diarreicas infecciosas agudas son consideradas un problema de salud pública a nivel

mundial presentándose de manera particular en países subdesarrollados y de clima tropical4, 17. El

cólera es considerado un indicador de la falta de desarrollo social; observándose el resurgimiento de

esta enfermedad en paralelo con el incremento de población de grupos vulnerables que viven en

condiciones precarias y que condiciona la falta de higiene31.

El cólera es una enfermedad diarreica la cual había sido endémica durante años en países de Asia

como la India. Tiene ese nombre debido a que así la llamaron los romanos a partir de las palabras

griegas chole=bilis y rhein=fluir a causa del color de las evacuaciones producidas. Durante el siglo XIX,

el cólera se propagó por el mundo desde su reservorio original en el delta del Ganges en la India,

provocando el deceso de millones de personas en los diferentes continentes. La actual pandemia

(séptima) comenzó en el sur de Asia (Indonesia) en 1961 llegando a África en 1971 y registró una

letalidad de hasta un 50%. Por otra parte, en el continente americano se registró hasta el año de 1991

en las zonas costeras de Perú, causando brotes de enfermedades diarreicas y en donde grupos de

epidemiólogos y de laboratorio identificaron al agente causal como V. cholerae O1 biotipo El Tor,

serotipo Inaba, propagándose a otros países del continente; de esta manera se estableció por lo tanto

que actualmente el cólera es endémico en muchos países del mundo4,41,42.

Los casos de cólera reportados a nivel mundial han presentado una tendencia a la alza desde el 2007,

donde solo hasta el 2012 han mostrado un descenso en el número de casos5,31, 44. De acuerdo a la

OMS en la Nota descriptiva No. 107 (2014), se calcula que cada año se producen entre 3 a 5 millones

de casos de cólera y entre 100,000 y 120,000 defunciones .A México, el cólera llegó por primera vez

de Europa y se presentó en la ciudad de Guadalajara en 1833, posteriormente otros casos se

presentaron hasta 1875. En 1961 se declaró la 7a pandemia de cólera en Indonesia, siendo reportado

hasta el verano de 1991 el primer caso de cólera en la comunidad rural de San Miguel Totolmaloya,


6

ubicada en la Sierra de Goleta en el Estado de México, afectando a 19 personas sin originar ninguna

defunción; sin embargo el padecimiento se propagó a otras entidades federativas afectando

especialmente a las de menor desarrollo de infraestructura sanitaria y núcleos urbanos con factores

determinantes que favorecen la presencia y transmisión de la enfermedad, incluyendo: el bajo nivel

socioeconómico, educación sanitaria deficiente, malos hábitos higiénico-dietéticos, entre otros.11 Los

factores predisponentes son inherentes al huésped, edad, sexo, sistema inmune, genotipo, etc.43

Posteriormente se reportó el mayor número de casos de esta enfermedad siendo confirmados para

finales de 1998, con 45 963 casos en todo el país, con ocurrencia de 552 defunciones. Para el año

2000 y 2001 únicamente se reportaron 6 casos en total. Lo anterior debido al adecuado manejo de la

enfermedad y a las medidas preventivas y de control que se habían establecido para contenerla, pues

la Secretaría de Salud fortaleció su programa de acción, con el objetivo de mantener el cólera bajo

control epidemiológico en el territorio nacional. Cabe señalar que en México como en el resto de Latino

América las cepas de cólera aisladas han sido predominantemente del biotipo el Tor5.

Los últimos casos de cólera en México fueron reportados en septiembre del 2013 en el estado de

Hidalgo, donde el Centro Nacional de Enlace de México para el Reglamento Sanitario Internacional

notificó a la OMS los 10 casos confirmados de infección autóctona por Vibrio cholerae O:1 Ogawa

toxigénico. A partir de ese momento y hasta mediados del mes de octubre del 2013, se notificaron un

total de 171 casos confirmados, incluido un deceso. El análisis llevado a cabo en el estado de Hidalgo

estableció la posibilidad que el agua del río haya sido el origen de contaminación. Ante esto las

autoridades de salud de México han reforzado las actividades de vigilancia epidemiológica a nivel

nacional, con el propósito de evitar el resurgimiento de casos de cólera por cepas ya existentes en el

país o por la introducción de nuevas variantes28,31,36.

2. MARCO LEGAL.

El presente manual se sustenta en lo descrito en el Artículo 4 de la Constitución Política de los

Estados Unidos Mexicanos, así como lo establecido en el Reglamento Interno de Comisión Federal

para la Protección contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS) específicamente en el Artículo 16 que

correspondiente a las atribuciones de la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura


7

(CCAYAC), es una unidad administrativa de la COFEPRIS, en el que se estipula lo siguiente:

I. Establecer los lineamientos, criterios y procedimientos de operación aplicables al control analítico de

la condición sanitaria en las materias a que se refiere el artículo 3, fracción I, de su reglamento.

II. Proponer las políticas, criterios, procedimientos y requisitos de operación para los laboratorios de

control fisicoquímico, microbiológico, biológico, farmacéutico o toxicológico integrantes de la red

nacional de laboratorios, del sistema federal sanitario y, en general, para los terceros autorizados.

III. Definir y coordinar la aplicación de las políticas para la ampliación de cobertura a través de

laboratorios de prueba y unidades de verificación de terceros autorizados.

IV. Establecer los criterios, métodos y procedimientos para la recepción y procesamiento analítico de

los productos susceptibles de control analítico.

V. Establecer, en coordinación con la Comisión de Evidencia y Análisis de Riesgos, los criterios

aplicables al muestreo y transporte de los productos objeto de control analítico.

VI. Definir las políticas, criterios y lineamientos, en los términos de las disposiciones aplicables, para el

control de calidad sanitaria para la liberación y uso de los productos biológicos utilizados en el país.

VII. Prestar servicios de pruebas analíticas a las unidades administrativas de la Comisión Federal y a

los sectores público, social y privado, para apoyar el cumplimiento de la normatividad sanitaria en las

materias a que se refiere el artículo 3, fracción I, del presente Reglamento.

VIII. Coordinar las actividades de capacitación e investigación de laboratorios y unidades de verificación

a terceros autorizados y de la red nacional de laboratorios de Salud Pública que constituyen la

ampliación de cobertura.

IX. Apoyar la instrumentación de acciones en materia de vigilancia sanitaria, regulación y en su caso,

vigilancia epidemiológica; así como de las encaminadas a la evaluación y seguimiento de eventos

adversos asociados con el uso de medicamentos y productos biológicos.

X. Participar en el ámbito de su competencia, en la protección a la salud de la población durante las

contingencias, accidentes o emergencias en las materias competencia de la Comisión Federal.

XI. Fungir como centro de referencia nacional dentro del ámbito de competencia de la Comisión


8

Federal y;

XII. Las demás que le encomiende el Comisionado Federal.

3. JUSTIFICACIÓN.

La Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura (CCAYAC), como Laboratorio Nacional de

Referencia, tiene entre sus funciones establecer los criterios, métodos y procedimientos para la

recepción y procesamiento analítico de los productos susceptibles de control analítico, además de

coordinar a la Red Nacional de Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP). Emite políticas y

lineamientos técnicos de operación aplicables al laboratorio, en el ámbito de la protección contra

riesgos sanitarios, para el aislamiento e identificación de diversos agentes etiológicos como el cólera,

en muestras ambientales y de alimentos, a fin de garantizar resultados confiables y oportunos para

sustentar la toma de decisiones en la vigilancia y control de brotes. Tal es el caso del presente manual

para el aislamiento e identificación de Vibrio cholerae en muestras de agua y alimentos.

4. OBJETIVO GENERAL.

Proporcionar de manera práctica, clara y sencilla, principalmente a los Laboratorios Estatales de Salud

Pública y Terceros Autorizados, la metodología para el muestreo, aislamiento e identificación de V.

cholerae, en muestras ambientales y de alimentos; a fin de llevar a cabo acciones de protección contra

riesgos sanitarios en apoyo a la vigilancia sanitaria y el control de brotes de cólera en la población

mexicana, adoptando un esquema multidisciplinario, que propicia que dichas acciones sean eficaces.

5. MARCO TEÓRICO.

Los miembros del género Vibrio pertenecen a la familia Vibrionaceae, los cuales son definidos como

bacilos cortos curvos Gram negativos, de 0.5 a 1 μm de longitud, aerobios estrictos, crecen en

presencia de niveles relativamente altos de sales biliares, condiciones alcalinas, producen enzimas

como catalasa y oxidasa y fermentan la glucosa sin producción de gas, reducen los nitratos a nitritos,

no forman esporas, cápsula y fimbrias, son móviles con un flagelo polar al crecer en medio líquido,

algunos requieren de NaCl para su crecimiento, presentan un rango de temperatura de crecimiento de

18 a 37°C, pH de 6 a 9, usualmente sensibles a 0/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropil-pteridina), muestran

un contenido de G+C en DNA de 40-50%mol, así mismo son productores de varias enzimas

extracelulares como lipasas, amilasas, quitinasas, DNAsas, y lecitinasas. Tres especies, V. cholerae, V.


9

parahaemolyticus y V. vulnificus, están documentadas como patógenos en humanos. Algunas cepas de

V. mimicus son reconocidas como patógenas con características similares a V. cholerae, entre estas

que tienen un pH óptimo de crecimiento de 7.6 a 8.6, pero puede ser distinguido por su incapacidad

bioquímica de fermentar la sacarosa (Cuadro 1). Mientras que otras especies como V. alginolyticus, V.

fluvialis, V. furnissii, V. metschnikovii y V. hollisae son consideradas ocasionalmente patógenas.

Numerosas especies de Vibrio son responsables de generar enfermedades en humanos transmitidas

principalmente por el consumo de alimentos crudos o precocidos como mariscos y crustáceos; tal es el

caso de la enfermedad de cólera cuyo agente causal es V. cholerae8,22,42.

La estructura antigénica de los Vibrios está constituida por dos antígenos, que son 1 somáticos “O”

termoestables y 2 Los antígenos “H” flagelares termolábiles; estos últimos comunes en 6 grupos de las

especies Vibrio. El grupo V. cholerae presenta más de 70 serogrupos basados en características

antigénicas de su pared celular, clasificados en forma general como serogrupo O1 y No O1 (a partir de

la aglutinación o no de suero polivalente O1), además con base en características fenotípicas,

propiedades metabólicas, susceptibilidad a bacteriófagos y antimicrobianos, V. cholerae serovariedad

O1 tiene los biotipos: Clásico y el Tor que presentan a su vez los subtipos Ogawa, Inaba y Hikojima

identificados por los factores antigénicos A, B y C9,31,42.


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Cuadro 1. Características bioquímicas de diferentes miembros de la familia Vibrionaceae encontrados comúnmente en alimentos del mar (pescados

y mariscos)22.

Condición V. alginolyticus

V. cholerae

V. fluvialis

V. furnissii

V. hollisae

V. metschnikovii

V. mimicus

V. parahaemolyticus

V. vulnificus

Agar TCBS

A A A A NC A V V V

Oxidasa + + + + + - + + + Arginina dihidrolasa - - +

+ - + - - -

Lisina descarboxilasa + + - - - + + + + Crecimiento en (p/v)

NaCl: 0% 3% 6% 8%

10%

- + + + +

+ + - - -

- + + V -

- + + + -

- + + - -

- + + V -

+ + - - -

- + + + -

- + + - -

Crecimiento a 42°C + + v - nd v + + + formación de ácido a

partir de: Sacarosa

D-celobiosa Lactosa

Arabinosa D-Manosa D-Manitol

+ - - - + +

+ - - - + +

+ + - + + +

+ - - + + +

- - - + + -

+ - - - + +

- - - - + +

- V - + + +

- + + - + v

Voges-Proskauer + v - - - + - - - Gelatinasa + + + + - + + + +

Ureasa - - - - - - - v -

A= amarillas, V=Verdes, NC=crecimiento pobre o no presente, Nd no realizado, V=variable, TCBS= tiosulfato de sodio citrato sales biliares.


11

Existen proteínas extracelulares sintetizadas por microrganismos patógenos que favorecen el

establecimiento y mantenimiento de la enfermedad en el huésped, estos son denominados factores de

virulencia. Para el caso de V. cholerae O1 y O139 el principal factor de virulencia es la toxina colérica

(CT) la cual es considerada una exotoxina termolábil ya que es liberada al medio extracelular a medida

que crece el microorganismo (con sensibilidad a altas temperaturas) y enterotoxina por que actúa sobre

la pared celular del intestino delgado causando una secreción masiva de líquidos en la luz intestinal.

CT es una toxina A-B al estar constituida por dos polipéptidos unidos covalentemente (A y B) en donde

el componente B generalmente se une a los receptores celulares permitiendo así que el componente A

atraviese la membrana y actué provocando el daño a la célula31,32.

El componente A de la toxina presenta un peso molecular de 27,200 mientras que el componente B

está formado por 5 sub unidades cada una de peso molecular de 11,600. La sub unidad B posee el

sitio de unión a través del cual la toxina se combina específicamente con su receptor el gangliósido

GM1 en la membrana citoplasmica epitelial y así posteriormente la fracción A lleva a cabo la acción

toxica al activar la enzima adenilatociclasa causando la conversión de ATP a AMPc intracelular lo que

condiciona alteración del transporte intracelular de iones y diarrea. Cabe recordar que en mamíferos el

AMPc está involucrado en la acción de distintas hormonas así como la transmisión sináptica en el

sistema nervioso, reacciones inflamatorias e inmunes de los tejidos.

El aumento de AMPc lleva consigo una secreción activa de agua, iones cloruro y bicarbonato en la luz

del intestino procedentes de las células mucosas que van al lumen produciendo pérdida masiva de

líquidos y muerte por deshidratación extrema por lo que el tratamiento consistirá en la administración

oral de soluciones de electrolitos31,32 (Figura 1).

Diversos estudios han demostrado que la toxina colérica esta codificada por el gen ctxA y ctxB cuya

expresión está controlada por un elemento regulador positivo en el gen toxR, el producto de este gen

es una proteína trans membrana que controla no solo la producción de toxina del cólera sino otros


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factores de virulencia como la toxin co-regulated (TCP) proteínas de membrana externa y pili que se

necesitan para adherencia y la colonización exitosa de Vibrio en el intestino delgado, así como

hemolisinas, proteína reguladora (ToxR) y citotoxinas (RTX)30,32.

Algunas cepas de V. cholerae producen otras toxinas como la toxina Zot (zona occludens toxin) que

rompe las uniones (zona occludens) que mantienen la mucosa celular unida y preservan la integridad

de la membrana permitiendo así la fuga del contenido luminal alterando el equilibrio iónico y

ocasionando episodios diarreicos. Hasta 1992 el cólera únicamente era causado por cepas toxigénicas

de V. cholerae O1, pero comenzaron a aparecer brotes que reportaron cada vez más casos de diarrea

deshidratante causados por la cepa de V. cholerae No O1; se realizaron estudios posteriores

revelándose que se trataba de un nuevo serotipo al que se designó como V. cholerae O139.

Al igual que V. cholerae O1, las cepas de V. cholerae O139 tienen los genes ToxR (que regulan la

expresión de varios factores de virulencia), ctxA, cep, ace y zot (genes que codifican para la producción

de toxinas) por lo que no es sorprendente que sean capaces de producir cólera epidémico. Por otra

parte, se han observado diferencias entre V. cholerae O1 y V. cholerae O139; en donde la principal

radica en que O139 presenta una cápsula de polisacárido y distintos determinantes de virulencia del

LPS que no está presente en V. cholerae O1.


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Figura 1. Modo de acción toxina colérica. A) proceso normal de tráfico de iones. B) Colonización de V. cholerae siguiendo con la liberación de la toxina y unión a receptores GM1 (gangliósidos) del huésped, y toxinas A-B internalizando el componente A y activando la adenilato ciclasa. C) Bloqueo del flujo normal de Na+.D) Pérdida de agua en el lumen y diarrea32.

Células epiteliales

Na+

GM1

Luz del intestino delgado

Sangre A)

Toxina de V. cholerae

Lumen

V. cholerae

Epitelio

Sangre

Colonización y producción de toxina

Activación de la adenilatociclasa por la toxina colérica

Toxina del cólera

Adenilato ciclasa

ATP AMPcíclico

B)

C)

Cl-

Sangre

Lumen

Na+

Bloqueo flujo de Na+

Flujo de Cl- hacia la luz

D) Agua

Na+

Cl-

Flujo de agua masivo hacia

la luz intestinal


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La cápsula puede presentar funciones de defensa ante la respuesta inmune y la diferencia en los

determinantes antigénicos explicaría porque la respuesta inmune es distinta para ambos serogrupos8.

Además existen cepas de V. cholerae No O1 diferentes a O139, que no presentan la capacidad de

producir cólera encontrándose que algunas cepas producen un cuadro de gastroenteritis de suave a

moderada en adultos debido a la generación de β-hemolisina (característica de estos serogrupos),

junto con cuadros de apendicitis aguda, colecistitis aguda, otitis media, celulitis, neumonía,

meningoencefalitis y septicemia además de que solo en muy raras ocasiones producen las toxinas CT

y Zot (Figura 2)30,31,41.

Figura 2. Clasificación de agente causal del cólera31.

Vibrio cholerae

O1 Toxina colérica (+)

No O1 198 serogrupos

O:2 – O:199 O:139 Toxina colérica (+)

Biotipos

Clásico y El Tor

Serotipos

Inaba, Ogawa, Hikojima

Toxigenicidad

CT - CT +


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V. cholerae forma parte de la microbiota de ambientes marinos y se ha encontrado asociado con

especies de vertebrados e invertebrados como peces, mariscos y zooplancton. Además es posible

aislarlo de fuentes de agua dulce como son ríos, lagunas, pantanos, corrientes y lagos. Se considera al

ser humano como un huésped incidental y transitorio, para este microorganismo, el cual realiza la

función de diseminarlo hacia otras fuentes de agua y alimentos de otras poblaciones y ecosistemas.

La razón por la que V. cholerae tenga diversos reservorios naturales ha llevado a considerar a varios

investigadores que el control del cólera pueda ser mediante la prevención de la exposición del hombre

a reservorios no detectados y el control de la diseminación secundaria de la enfermedad. Por otra parte

durante el curso de un brote, es posible aislar V. cholerae O1 de pacientes y de muestras ambientales,

sin embargo en los periodos inter epidémicos es difícil aislarlo permaneciendo este en una forma viable

no cultivable debido a condiciones desfavorables ambientales y de nutrientes presentando una alterada

morfología con disminución de su tamaño y acción metabólica (detectables por métodos de

inmunofluorescencia al no mostrar crecimiento sobre medios de cultivo no selectivos), postulándose

que estas formas no cultivables son la manera de sobrevivir y mantenerse en ambientes acuáticos en

periodos inter epidémicos; pero al encontrar condiciones favorables de temperatura, pH alcalino y

concentración de materia orgánica, estas formas no cultivables pueden ser recuperadas manifestando

plenamente su capacidad de infección, patogenicidad y transmisibilidad. Así mismo, se ha propuesto la

capacidad de estos microrganismos de asociarse a fitoplancton, zooplancton y sustratos específicos

como la quitina de mariscos mediante la producción y actividad de quitinasas. Este proceso de igual

forma ocurre y se favorece por condiciones nutrimentales pobres sobreviviendo por tiempo prolongado

al asociarse a la quitina de los artrópodos marinos considerándose esta relación un modo de

persistencia ambiental y diseminación30,31,41.

La enfermedad de cólera.

Los microorganismos patógenos para el hombre pueden ser trasmitidos a través del agua de consumo

ya sea para beber, cocinar, bañarse o nadar. Ya que todos usamos y consumimos agua, en el caso

particular del agua potable, cuando ésta está contaminada, es considerada una importante fuente de


16

transmisión de enfermedades y epidemias de graves consecuencias. En países desarrollados la

transmisión de enfermedades por el agua está restringida debido a los altos estándares de higiene y

calidad, ocurriendo brotes debido a fallas en el proceso de potabilización de la misma; sin embargo, los

países en vías de desarrollo sí son afectados por brotes importantes debido comúnmente a la falta de

sistemas eficientes de potabilización de agua y tratamiento de aguas residuales dando lugar a

enfermedades intestinales como cólera, fiebre tifoidea y amebiasis las cuales son consideradas

grandes problemas económicos, sociales y de salud pública.

Los microorganismos que son transmitidos por el agua regularmente se reproducen en el intestino del

huésped (ser humano) y se eliminan a través de la materia fecal; por tanto si esta contaminación no es

identificada y tratada con un proceso de desinfección, un nuevo huésped consumirá el agua y el

patógeno podrá colonizar los intestinos y originar la enfermedad en nuevos individuos32.

Esta enfermedad es un claro ejemplo de enfermedades trasmitidas y asociada al consumo de agua y

alimentos como moluscos bivalvos y vegetales crudos. El huésped una vez infectado con el agente

causal puede tener un periodo de incubación que va de algunas horas hasta 3 o 5 días, presenta

severos cuadros de vómito, dolor abdominal, fiebre, choques hipovolémicos, procesos diarreicos

(pérdida de agua aproximadamente de 1 L/h en adultos, con una tasa de mortalidad del 60% en

pacientes no tratados, presentando evacuaciones de apariencia de agua de arroz) con la consecuente

deshidratación, hipotensión y muerte32,42.

Fuente y distribución del agente causal de cólera.

V. cholerae O1 es excretado en las heces de pacientes y convalecientes de cólera; así la enfermedad

es trasmitida de manera primaria vía fecal-oral indirectamente a través de suministros de agua

contaminados, siendo la propagación de persona a persona poco común. Cabe mencionar que

aproximadamente el 75% de las personas infectadas con V. cholerae pueden NO presentar ningún

síntoma a pesar que estar presente en las heces durante 7 a 14 días después de la infección.

La infección por cólera se da por ciclos de humano – medio ambiente - humano, transmitiéndose

principalmente de un individuo a otro por la vía fecal-oral a través del consumo de agua o alimentos


17

crudos o precocinados del mar (mariscos, moluscos bivalvos, cangrejos, pescado) contaminados con

heces humanas, así mismo individuos enfermos, portadores transitorios y portadores crónicos son

reservorios naturales del agente causal. En las zonas endémicas los brotes tienden a ocurrir en

temporadas de calor con elevada incidencia en niños, mientras que en las zonas no endémicas

aparecen en cualquier época del año y sin un grupo específico de edad. Además los grandes desastres

naturales son también factor de riesgo pues favorecen la contaminación del agua con heces humanas

dando lugar a brotes severos42.

Los agentes causales de cólera como V. cholerae O1 o V. cholera O139 requieren de una ingestión de

108 a 109 Vibrios a través del consumo de agua y alimentos contaminados con heces y/o vómito de

individuos infectados, para generar la enfermedad31,32.

Sin embargo, la posibilidad de que se genere un brote de cólera en una región específica dependerá de

varios factores como: el número de individuos susceptibles, la exposición a aguas cloacales o agua no

tratada y alimentos contaminados además de la presencia de un reservorio acuático de V. cholerae. La

interacción de estas variables podría explicar la aparición del cólera endémico ya sea en forma

estacional o el surgimiento del cólera epidémico (Figura 3)30.

Figura 3. Dinámica de transmisión del V. cholerae30.

En función de la concentración de V. cholerae en

el agua contaminada o alimento de origen marino

En función del grado de exposición al agua.

A través de la excreción Se incrementa la población microbiana

Cambios climáticos: °T del agua, pH, nutrientes e interacciones bióticas.


18

Medidas de prevención del cólera.

Las medidas eficaces de control y prevención de brotes deben adoptar un enfoque multidisciplinario e

interdisciplinario a través de un sistema de vigilancia eficaz. El suministro de agua potable y el

saneamiento son medidas decisivas para reducir las repercusiones del cólera y otras enfermedades

transmitidas por el agua. Las medidas de prevención del cólera consisten principalmente en

proporcionar agua salubre y saneamiento a las poblaciones que todavía no tienen acceso a servicios

básicos, la educación sanitaria y la higiene de los alimentos son igualmente importantes, cual debe

recordársele a la población en general y principalmente en riesgo (comunidades) a través de los

distintos medios de comunicación. La contaminación ambiental del agua puede prevenirse mediante la

disposición adecuada de las excretas humanas y animales así como a nivel doméstico es importante

educar a la población de los comportamientos higiénicos básicos, mediante la correcta desinfección del

agua de uso o para beber; adecuado almacenamiento y manejo, el lavado regular de manos con agua

y jabón después de ir al baño, antes de comer, así como previo a la preparación y conservación de

alimentos4,31.

Ante la aparición y detección de un brote epidémico la respuesta implica la estrategia de reducir las

defunciones mediante el rápido acceso de tratamiento médico, la reducción de la mortalidad es por el

manejo de sostén y la rehidratación el tratamiento médico y sirve para contener la diseminación, es

decir para que no se continúe reproduciendo el patógeno en el intestino y se evita la propagación de la

enfermedad mediante la tendencia al suministro de agua potable, saneamiento apropiado y educación

sanitaria para mejorar la higiene y las prácticas de manipulación segura de los alimentos por la

comunidad. El suministro de agua potable y saneamiento representan una gran dificultad y

consideración, siendo un factor de importancia decisiva para reducir las repercusiones y brotes de

Cólera y de otras enfermedades transmitidas por el agua4.

6. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA.

El laboratorio de análisis de muestras sospechosas de contener V. cholerae debe estar siempre

perfectamente limpio y desinfectado durante el monitoreo microbiológico ambiental el recuento de


19

colonias en placa de agar soya tripticasa o agar peptona-glucosa extracto de levadura, no debe rebasar

la cuenta de 15 colonias al ser previamente expuestas 15 minutos e incubadas a 35°C/48h22. Además

de que los procedimientos analíticos y recomendaciones que se ofrecen en el presente Manual deben

ser realizadas considerando las directrices en materia de bioseguridad que recomienda la

Organización Mundial de la Salud a través de su Manual de Bioseguridad en el Laboratorio25, debido al

manejo de microorganismos infecciosos. Es recomendable seguir medidas de bioseguridad nivel II25.

Usar bata de laboratorio blanca, limpia y abotonada, esta vestimenta no debe ser usada fuera de las

áreas de trabajo.

Limpieza y desinfección de mesa de trabajo antes y después de procesar muestras.

Mantener cerrada la puerta del laboratorio.

Lavado de manos antes y después de trabajar.

No hablar, estornudar ni toser durante el sembrado de la muestra.

No pipetear directamente con la boca.

Programa para el manejo de RPBI.

7. PROCEDIMIENTO DE MUESTREO.

7.1. Condiciones generales.

El personal técnico responsable del muestreo deberá realizarlo en condiciones asépticas, usar guantes

de látex estériles desechables; la muestra deberá ser colectada y depositada en recipientes estériles

con tapa de rosca. Si es necesario el uso de bolsas de plástico se deberá tener especial cuidado en

que las bolsas estén íntegras y sean de cierre hermético, de tal manera que la muestra no presente

derrames.

Realizar el etiquetado de la muestra, en la cual se suministre como mínimo la siguiente información:

Nombre del producto.

Número o código de ingreso de muestra.

Número de acta de muestreo.

Nombre del verificador o del responsable del muestreo.

Procedencia (Domicilio o punto de muestreo o nombre del establecimiento).

Fecha y hora de recolección.


20

Así como cualquier otra información relevante, que pueda ser de utilidad para la rastreabilidad de la

misma.

V. cholerae sobrevive mejor en las muestras conservadas a temperaturas de refrigeración que de

congelación, por lo que será conveniente mantenerlas a temperaturas de entre 4°C a 8°C y ser

transportadas a la mayor brevedad una vez colectadas para su análisis en el laboratorio.

Si las muestras se refrigeran en hielo, evitar el contacto de la muestra con el agua de deshielo, por lo

que es recomendable utilizar refrigerantes (Gel Ice) con el fin de evitar la contaminación cruzada y al

mismo tiempo la muestra conserve las características del entorno donde fue tomada.

7.2. Alimentos.

Los alimentos que por lo general se asocian con la transmisión del cólera son: pescados, mariscos

(particularmente moluscos y crustáceos obtenidos de aguas contaminadas) frutas, vegetales y

alimentos preparados contaminados.

Los alimentos colectados en el muestreo deberán conservarse en refrigeración (4°C a 8°C). No

deberán examinarse muestras con un tiempo mayor a 24h de haber sido colectadas24.

7.2.1. Frutas y vegetales.

Para el muestreo de frutas y vegetales proceder a la selección de piezas tal y como se indica a

continuación en el cuadro 2.

Cuadro 2. Muestreo para frutas y verduras 1,18.

Alimento Que colectar o muestrear

Vegetales frescos (con hoja) pequeños

Ejemplo: cilantro, perejil, berro, pápalo, germinados,

etc.

Seleccionar el total de manojos que en

conjunto pesen como mínimo 250 g

Vegetales frescos (con o sin hoja) medianos

Ejemplo: brócoli, rábanos, cebolla, jitomate, calabaza,

betabel, camotes, zanahoria, jícama, etc.

Seleccionar 10 piezas de manera individual

que en conjunto pesen como mínimo 250 g


21

Alimento Que colectar o muestrear

Vegetales frescos

(con hoja grandes, por ejemplo: lechuga, espinaca,

coliflor, apio, acelga, col, etc).

Seleccionar 10 piezas de manera individual

que en conjunto pesen como mínimo 250 g.

Frutas, pequeñas por ejemplo: fresas, zarzamora,

uvas, etc.

10 sub muestras que en total pesen como

mínimo 250 g.

Frutas, medianas por ejemplo: duraznos, manzanas,

aguacate, etc.

10 piezas que en total pesen mínimo 250 g.

Si sobrepasan este peso en conjunto, tomar

10 piezas de manera individual.

Frutas, grandes por ejemplo: melones, sandia, etc. 2 pieza individuales las cuales

corresponderán a una muestra.

Fruta fresca picada o rebanada. Muestrear mínimo 250 g.

Vegetales picados o rebanados Muestrear mínimo 250 g.

Continuar como se indica en el punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.

7.2.2. Productos de la Pesca.

Frecuentemente, ostras y peces recién capturados que se cultivan como muestras de vigilancia

epidemiológica. Además existe la probabilidad que los intestinos y en menor grado la piel de los

pescados, contengan más bacilos de cólera que el tejido muscular, sin embargo hay que considerar la

contaminación cruzada ya que la carne del pescado que se descama, limpia y almacena en zonas

comerciales puede dar cultivos positivos debido a la contaminación cruzada durante estas operaciones.

Para el muestreo de este tipo de productos considerar a continuación lo correspondiente en el cuadro

3/ Continuar el análisis acorde al punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.

Cuadro 3. Muestreo para productos de la pesca1,18.

Producto Que cantidad muestrear

Mariscos frescos o pre-cocido Tomar 10 sub muestras aleatorias para completar un peso

mínimo de 250 g que corresponderán a una muestra.


22

Pescado fresco o congelado Tomar preferentemente mínimo 5 piezas enteras o en su

defecto o contingencia, filetes.

7.2.3. Moluscos Bivalvos.

Cuadro 4. Muestreo para Moluscos bivalvos.

Moluscos bivalvos

El muestreo de este tipo de producto deberá consistir de la

cantidad necesaria para obtener mínimo 200g de líquido y

carne. Ejemplo: 10 a 12 ostras grandes o 20 a 30 pequeñas

y considerar el peso total de la muestra.

Limpieza y Desconche6.

Limpieza de la concha: Lavarse las manos con agua potable y jabón antes de comenzar. Enjuagar el

exceso de suciedad de las conchas y cepillar con un cepillo estéril bajo el chorro de agua potable

poniendo particular atención en las hendiduras de las conchas. Colocar las conchas limpias en toallas

de papel absorbente o gasas limpias. Desechar los moluscos que tengan las conchas dañadas o con

las valvas abiertas.

Remoción del contenido: Lavarse las manos con agua, jabón y enjuagarse con alcohol al 70%. Se

puede utilizar guantes para evitar lesiones. Sostener el molusco en la mano sobre una gasa, dirigiendo

la unión de las valvas o bisagra hacia el analista apoyándose sobre la mesa. Con un cuchillo estéril,

insertar la punta entre las valvas y hacer palanca para cortar el musculo abductor de las conchas y

pasar el cuerpo del animal dentro del mismo recipiente.

Para moluscos bivalvos desconchar no menos de 12 organismos grandes o 20 – 30 pequeños.

Continuar acorde al punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.

7.3. Agua.

La colecta de la muestra de agua debe realizarse en recipientes de polipropileno de capacidad

aproximada de 3000 mL, previamente lavados con detergente y verificando que no existen residuos del

mismo, esterilizados en autoclave a 121°C/15min/15 lb antes de su uso. Las muestras de agua deben


23

analizarse lo más pronto posible después de su recolección; para lo cual se deberán enviar al

laboratorio en condiciones de refrigeración (4°C a 10°C). No deberá transcurrir un periodo de más de

8 h entre la colecta de la muestra y el análisis. Además, es recomendable realizarle al agua de

muestreo durante la colecta, la determinación de parámetros fisicoquímicos (temperatura, salinidad,

conductividad, pH y oxígeno disuelto, cloro libre residual) pues estos pueden influir en la densidad

celular de V. cholerae presente, esto también puede ayudar a estimar correlaciones en la incidencia de

brotes de cólera20. .

Para desactivar el cloro residual en muestras de agua para uso y consumo humano, el recipiente

deberá contener 0.1 mL de tiosulfato de sodio estéril al 1% o agregar esta solución antes de esterilizar

los recipientes; por cada 120 mL de capacidad de los frascos6.

7.3.1. Agua y hielo para uso y consumo humano.

El análisis de agua y hielo se requiere una cantidad mínima de 3 L o 3 Kg respectivamente. Para

muestras de hielo, este deberá fundirse completamente antes de su análisis, por lo que se puede dejar

toda la noche en la parte baja del refrigerador o si es necesario el análisis de inmediato, se deberá

colocar dentro de un baño de agua de 44°C-46°C, por no más de 15 minutos, teniendo extremo

cuidado en que la muestra no entre en contacto con el agua del baño6.

Continuar el análisis acorde al punto 8. Preparación de la muestra para el análisis en el laboratorio.

7.3.2. Aguas residuales.

La técnica del hisopo de Moore es considerada de gran utilidad para la búsqueda de V. cholerae en

aguas residuales (domiciliarias, hospitalarias, industriales, de puertos, aeropuertos, plantas de

tratamiento de aguas residuales, etc.) y de aguas superficiales de ríos. Esto debido a la facilidad con la

que se elaboran, montan y colocan los hisopos en las tuberías de entrada o puntos centrales del

sistema municipal de aguas residuales. El empleo del hisopo de Moore permite determinar si existen en

la zona infecciones por V. cholerae O1, además que se puedan detectar infecciones por V. cholerae en

áreas donde la vigilancia epidemiológica de enfermedades diarreicas no ha logrado detectar cólera.

A continuación se describe el material y la preparación del hisopo de Moore.

Para elaborar 10 hisopos de Moore considerar el siguiente material:

12 m de gasa de algodón.


24

100 m de hilo de pescar de nylon (resistencia tensil ≥11.35 Kg).

Cortar un trozo de gasa de 90 cm de ancho por 180 cm de largo. La gasa se dobla 5 veces en sentido

longitudinal obteniéndose las siguientes dimensiones: 30 cm de ancho por 36 cm de largo. A partir de

la base inferior de 30 cm se cortan 6 tiras de 5 cm de ancho y 26 cm de largo dejándose 10 cm en la

parte superior sin cortar. En este sitio se amarra con un cáñamo de nylon o de otro material fuerte. Se

coloca en papel kraft (o equivalente) y esterilizar a 121 °C/ 15 lb /15 minutos.

Figura 4. Hisopo de Moore, dispositivo para búsqueda de V. cholerae en aguas residuales y

contaminadas11.

La colocación de hisopos debe hacerse corriente arriba del vertedero o de desechos o aguas

residuales, suspendiendo el hisopo en las aguas residuales a analizar. En el caso de las tuberías de

entrada accesible solo por un pozo de inspección, se ata al extremo del hilo un trozo de alambre para

evitar que el hilo se corte al colocar la tapa del pozo, se deja colocado entonces el hisopo durante 24 a

48 h y posteriormente los hisopos e hilo que los sostiene son recolectados introduciéndose en

recipientes previamente estériles de cierre hermético (utilizar guantes de látex y cambiarlos entre tomas

de muestra) y tamaño adecuado con 500 mL de agua peptonada alcalina (APA); las muestras son

rotuladas con datos del lugar de muestreo, tipo de muestra, persona que colectó, número de muestra

hora y fecha de obtención; posteriormente serán trasladadas al laboratorio en una caja de hielo (tipo

cooler) con bolsas de material refrigerante antes de transportarlos al laboratorio. EI hisopo de Moore y

la muestra de agua que lleva impregnada debe constituir cerca de 10% a 20% del volumen total de la

muestra a la que se agrega APA.



25

Figura 5. Hisopo de Moore para el monitoreo de agente causal de cólera14.

7.3.3. Aguas superficiales.

Para las muestras provenientes de aguas blancas es decir poco contaminadas, se empleará el método

de hisopo de Spira, consiste en someter el agua de análisis a un filtrado a través de gasa de algodón.

Previo a la toma, se debe medir la temperatura ambiente y determinar pH del punto en que se tomara

la muestra. Para lo cual la gasa se introduce en un frasco de plástico con tapa de rosca (capacidad de

500 g o 500 mL y hasta 1000 mL) el frasco debe tener un orificio de 2 cm de diámetro en el fondo (el

diámetro del orificio es importante; ya que si es demasiado grande, el agua expulsara la gasa, y si es

muy pequeño el flujo será muy lento). La gasa debe tener 30 cm de ancho y se empaca en el frasco

doblándola en capas. Se usará suficiente gasa (aproximadamente de 120 a 180 cm) para formar un

paquete firme pero compresible que ocupe cerca de las 2/3 partes del volumen del frasco. La

esterilización de las trampas de Spira es opcional; para lo cual se envuelve cada frasco en papel de

estaño o de estraza y se esteriliza 121°C/15 min/15 lb. Ya preparada la trampa de Spira para el análisis

de agua, este comienza por verter por la boca del frasco el agua que se va a muestrear y se deja

escurrir por el fondo, posteriormente la gasa se retira bajo condiciones asépticas del frasco Spira y se

coloca en un matraz o frasco con 100 mL de agua peptonada alcalina 10x y se agrega suficiente agua

de la fuente para obtener un volumen final de 1L, registrar el sitio de toma de la muestra, fecha, hora y

responsable, y se traslada la muestra al laboratorio a temperatura ambiente26,41.


26

Figura 6. Trampa de Spira, empleado para filtrar grandes volúmenes de agua a través de gasas de

algodón que generan el atrapamiento de V. cholerae para su posterior aislamiento en el laboratorio11.

Cuando el muestreo se hace en cuerpos de agua en movimiento como ríos limpios, se coloca el filtro

en el cuerpo del río por lo menos durante 24 h, permitiendo que el flujo del agua entre por la boca del

recipiente y salga por el orificio inferior.

Para el caso de cuerpos de agua sin movimiento como lagos, lagunas y estanques; verter el agua por

la boca del frasco indicando el volumen muestreado, el cual deberá ser como mínimo 5 L, dejando

escurrir por el fondo.


En casos de emergencia donde no sea posible el aislamiento del agente causal de cólera (V. cholerae)

de muestras de aguas ambientales (río, arroyo, pozo, suministro público-grifo-, manantial etc.,) por los

métodos tradicionales mencionados en el presente manual, se sugiere el uso de la metodología de

concentración por ultrafiltración (Anexo I).


27

8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL ANÁLISIS EN EL LABORATORIO.

8.1. Alimentos.

8.1.1. Frutas y vegetales.

Analizar los alimentos tomando como guía general, la siguiente tabla:

Cuadro 5. Preparado de algunos frutos y vegetales para la detección de V. cholerae18,1.

Vegetales frescos (con hoja)

pequeños Tomar aleatoriamente 25 g del total a de la muestra, en

225 mL de APA. Frutas pequeñas

Fruta fresca picada o rebanada.

Vegetales picados o rebanados

Vegetales, medianos y grandes. Colocar las piezas individuales en una bolsa de plástico

estéril y enjuagar con 1 L de APA. Frutas medianas y grandes.

Continuar el análisis acorde al punto 9. Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa,

aislamiento e identificación y/o ver el Anexo IV el cual muestra el diagrama general para el aislamiento

de V. cholerae en alimentos/ Para la preparación de la muestra y su análisis microbiológico los

materiales, medios e insumos necesarios se muestran en el Anexo II mientras que en el Anexo III se

muestran las formulaciones de los medios de cultivo y reactivos requeridos.

8.1.2. Pescados.

Es de suma importancia que los pescados sean enteros, sin ser descamados o eviscerados, tomar

tejidos superficiales, vísceras y agallas. Pesar agallas y vísceras en un total de 25 g de todas las piezas

de pescado, cortar en piezas pequeñas y colocar dentro de un vaso de licuadora estéril. Agregar 225

mL de agua peptonada alcalina (APA) al vaso y licuar homogeneizando por 2 minutos a alta velocidad.

Esta será la dilución 10-1 y a partir de esta preparar la dilución 10-2 y 10-3 en 9 o 90 mL de APA e incube

a 35 ± 2°C6,18,1.



de V. cholerae en alimentos.


28

8.1.3. Mariscos.

Mariscos frescos o pre-cocidos.

Tomar el animal completo, si es posible o la parte central, incluidas las vísceras. Pesar 50 g de cada

muestra de 250 g y licuar durante 2 minutos a alta velocidad (Dilución 10-1) 6,18,1. Se deberá preparar

diluciones 10-2 y 10-3.



de V. cholerae en alimentos.

8.1.4. Moluscos bivalvos.

De todos los organismos incluir carne y líquido hasta obtener 200 g del producto, agregar la misma

cantidad (200 g) de solución reguladora de fosfatos y homogeneizar en licuadora de 60 – 120

segundos, esta mezcla constituye una dilución 1:2.

Realizar dos series de diluciones, pesando 50 g de la dilución (1:2) y colocarlos en un frasco que

contenga 225 mL de APA. Realizar mínimo una dilución decimal o más en APA acorde a la carga

microbiana esperada. Incubar una serie de diluciones a 35°C ± 2°C /6-8h y otra serie a 42°C ± 0.2°C

/18-21 h. Realizar el aislamiento6.


aislamiento e identificación y/o ver el Anexo V el cual muestra el diagrama general para el aislamiento

de V. cholerae en moluscos bivalvos.

8.2. Agua.

8.2.1. Agua y hielo para consumo humano.

Filtrar 3 L de la muestra liquida a través de una membrana de celulosa de 0.45 µm de tamaño de poro.

Colocar la membrana en un tubo con 10 mL de APA y homogenizar por 90 s e incubar a 35 ± 2°C.

Para muestras de hielo proceder como marca el punto 6.3.1 y filtrar de 500 mL a 3 L de la muestra

liquida por una membrana de celulosa 0.45 µm de poro. Colocar la membrana en un tubo con 10 mL

de APA y homogenizar por 90 s e incubar a 35 ± 2°C6,18. Continuar el análisis acorde al punto 9.

Procedimiento de enriquecimiento y siembra en placa, aislamiento e identificación. Y ver el Anexo VI


29

que muestra el diagrama general para aislamiento e identificación de V. cholerae a partir agua para el

consumo humano.

8.2.2. Aguas residuales.

Hisopo de Moore.


aislamiento e identificación y ver el Anexo VII el cual muestra el diagrama de análisis de hisopo de

Moore para el aislamiento e identificación de V. cholerae a partir de aguas residuales.

8.2.3. Aguas superficiales.

Hisopo de Spira.


aislamiento e identificación y/o ver el Anexo VIII que muestra el diagrama general del uso hisopo de

Spira para el aislamiento e identificación de V. cholerae a partir aguas ambientales respectivamente.

9. PROCEDIMIENTO DE ENRIQUECIMIENTO Y SIEMBRA EN PLACA, AISLAMIENTO E

IDENTIFICACIÓN.

Para los productos de la pesca, realizar el procedimiento como se describe en la Norma Oficial

Mexicana NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados,

congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba.

Para productos lácteos realizar el procedimiento como se describe en la Norma Oficial Mexicana NOM-

243-SSA1-2010, Productos y servicios. Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y derivados

lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Métodos de prueba.

Para todos los productos diferentes a los anteriores seguir el proceso analítico como a

continuación se indica:

El Anexo IV muestra el diagrama general para el aislamiento e identificación de V. cholerae a partir de

muestras de alimentos.

Recomendaciones generales:

*Para todas las etapas del análisis en el aislamiento e identificación de Vibrio cholerae se deben incluir

controles positivos y negativos.


30

*Aflojar todos los tapones de tubos y frascos de APA antes de incubar.

Enriquecimiento: Incubar los frascos de APA a 35 °C ± 2 °C por 6 a 8 h y resembrar. Re-incubar los

frascos toda la noche y hacer una segunda resiembra.

Incubar los frascos de hisopos de Moore y Spira a 35 °C ± 2 °C durante toda la noche.

Siembra en placa: Preparar placas de agar TCBS. También se puede incluir placas de agar modificado

m-CPC. Asegurarse de que las placas no contengan agua de condensación.

Transferir una asada de 3 mm de diámetro de la parte superficial del cultivo del caldo APA a placas de

agar TCBS (y mCPC). Estriar por estría cruzada para obtener colonias aisladas.

Incubar las placas de TCBS toda la noche a 35 °C ± 2 °C. (Incubar las placas de agar mCPC toda la

noche a 39 °C – 40 °C; si no dispone de una incubadora a esta temperatura, entonces incubar a 35 °C

– 37 °C), ya que la selectividad de estos agares está dada por los antibióticos que contiene, no tanto

por su incubación a altas temperaturas.

Las colonias típicas de V. cholerae en TCBS son grandes (2 a 3 mm), mucosas, amarillas, umbilicadas

ligeramente aplanadas con centro opaco y translúcidas en la periferia24,26.

Las colonias típicas de V. cholerae en agar mCPC, son pequeñas, suaves, opacas, verdes a púrpura

con un halo púrpura que se extiende con la incubación.

Las colonias sospechosas deben aislarse en agar T1N1, T1N3 o agar AST – 2% NaCl.

Incubar toda la noche a 35°C ± 2°C y proceder con su identificación. Resembrar tres o más colonias

aisladas de cada placa en agar T1N1. Incubar toda la noche a 35°C ± 2°C6.

Identificación bioquímica.

Pruebas tamiz: La prueba del hilo o cuerda (desoxicolato), es útil para descartar otros microrganismos

particularmente Aeromonas spp. Mientras que la prueba de oxidasa descarta a miembros de la familia

Enterobacteriaceae, El crecimiento en caldo triptona 0% NaCl es una prueba fundamental para

descartar a V. cholerae de otras especies como V. haemolyticus y V. mimicus, cabe señalar que en

ambas pruebas debe utilizarse un cultivo fresco en agar no selectivo;

Serología. El análisis serológico de las colonias aisladas en medios TCBS o mCPC puede ser

suficiente para la identificación preliminar de colonias de V. cholerae. Sin embargo en ocasiones resulta

apropiado realizar pruebas bioquímicas previamente a esto; o si la disponibilidad de antisueros es

limitada algunas pruebas bioquímicas como la del hilo, oxidasa y tolerancia a las sales; son útiles en


31

identificación antes de practicar el análisis con antisueros sobre todo cuando hay poca disponibilidad

de estos (Cuadros 6 y 7)24,26,30,.

Pruebas bioquímicas de identificación y confirmatorias.

Prueba de oxidasa.

Esta prueba identifica la actividad de la citocromo oxidasa presente en V. cholerae, la cual es una

enzima de la cadena respiratoria perteneciente al grupo de las hierro porfirinas. Para lo cual son

sometidas para su análisis colonias obtenidas y aisladas recientemente en un medio que no contenga

carbohidratos como agar infusión de corazón (BHI), agar T1N1, agar T1N0, agar soya tripticaseina, (No

deben utilizarse colonias aisladas en agar TCBS).

Se colocan dos o tres gotas del reactivo de oxidasa (tetrametil-p-fenilendiamina al 1%) sobre un

pedazo de papel filtro en una caja de Petri. Se extiende el cultivo sobre el papel filtro humedecido con

un asa de platino (No de nicromio) o aplicador de madera. Si la reacción es positiva, el cultivo

bacteriano cambiara de color a morado oscuro a los 10 s. Si el color aparece después de este tiempo

no se considerara por tanto deben analizarse al mismo tiempo testigos positivo y negativo; la

identificación y descarte por esta prueba radica en que microorganismos de diferentes géneros como

Vibrio, Neisseria, Campylobacter, Aeromonas, Plesiomonas, Pseudomonas y Alcaligenes son oxidasa

(+); mientras que miembros de la familia Enterobacteriaceae son oxidasa (-)20.


32

Cuadro 6.Características bioquímicas diferenciales entre especies del género Vibrio y otras bacterias25.

K/A=alcalinidad/acidez. AHK=Agar hierro kligler K/A (cuña roja/fondo amarillo), no produce gas, no H2S a (18–24h) V=reacción variable K/AG=alcalinidad acidez y gas AHTA=agar hierro triple azucares A/A (cuña amarilla/fondo amarillo, no produce gas, no H2S a (18–24 h) VP=Voges-proskauer. AHL=agar hierro lisina=K/K (cuña púrpura/fondo púrpura), no produce gas, no H2S a (18–24 h).A V. parahaemolytlcus, V. cincinnatiensis y V. damsela dan reacciones variables. BV. fumissii y V. damsela dan reaccionas variables. Las tapas de los tubos de las pruebas bioquímicas deben de mantenerse poco apretadas antes de la incubación en especial para medios de AHK y AHTA en plano inclinado, ya que pueden condicionar etapas anaerobias, no generando las reacciones características de V. cholerae.

Cuadro 7. Características de identificación en ensayos bioquímicos de V. cholerae O126.

Ensayo % positivo

Hilo mucoide o cuerda 100 Oxidasa 100

Agar hierro de Kligler K/A sin gas, sin H2S Agar hierro de tres azucares A/A sin gas, sin H2S

Glucosaa (Generación de ácido) 100 Glucosa (producción de gas) 0

Sacarosa (producción de ácido) 100 Lisinaa 99

Argininaa 0 Ornitinaa 99

Crecimiento en 0% NaClb 100 Crecimiento en 1% NaClb 100

Voges-Proskauerc 75 K/A = alcalinidad/acidez; A/A = acidez/acidez. aModificada mediante Ia adición de 1% de NaCI. Base de caldo nutritivo

(Difco laboratories). cMayor parte de los aislamientos de V. cholerae serotipo O1, biotipo el Tor, dan positiva

Voges~Proskauer, mientras que para cepas del biotipo clásico es negativa.

Prueba Vibrio cholerae

Vibrio mimicus

Vibriones halofilos

Aeromonas hydrophila

Aeromonas veronii

Plesiomonas shigelloides

Enterobacteriaceae

AHK K/A K/A V V K/AG K/A V AHTA A/A K/A V V A/AG K/A V Hilo + + +A - - - -

Oxidasa + + + + + + - Gas - - -B + + - V

Sacarosa + - V V + - V AHL + + V V + + V

Arginina - - V + - + V Ornitina + + V - + + V

VP V - V V + - V NaCl 0% + + - + + + + NaCl 1% + + + + + + +


33

Prueba del hilo (desoxicolato).

La prueba del hilo se realiza en un portaobjetos o en una caja de Petri de plástico, en la cual se

suspenden colonias de un cultivo de 18 a 24 h en BHI, AST, T1N1, o T1N0 en una gota de solución

acuosa de desoxicolato de sodio al 0.5%. La prueba será positiva cuando las células se lisan por efecto

del desoxicolato, por tanto la suspensión perderá turbidez y el ADN liberado ocasionará que la mezcla

se vuelva viscosa de tal manera que al retirar lentamente de la suspensión el asa, se formara una

cuerda. Generalmente los vibriones son positivos, y cepas del genero Aeromonas suelen ser

negativas26.

Crecimiento en caldos con contenido salino.

Este crecimiento de analiza al sembrar con un inoculo ligero de cultivo fresco tubos con caldo T1N0,

T1N1y T1N3 (1% triptona, 0% NaCl, 1% triptona, 1% NaCl y 1%, triptona, 3% NaCl) y se incubaran a

35°C ± 2 por 18 a 24h, V. cholerae puede crecer sin NaCl y con NaCl al 3%. Si no se presenta

crecimiento se pueden incubar hasta por 7 días, se debe incluir tubos testigos con una cepa

perfectamente identificada26.

Análisis en agar hierro de Kligler (KIA) y agar hierro triple azúcar (TSI).

Ambos medios de cultivo son selectivos con plano inclinado y se inoculan mediante picadura y estría e

incubándose de 35 a 37 °C /18 a 24 h se debe procurar que las tapas de los tubos estén poco

apretadas antes de incubar ya que pueden ocurrir reacciones no características ocasionando fallos de

interpretación de resultados. Estos medios contienen distintos carbohidratos y son muy usados en

microbiología de diagnóstico. El medio KIA contiene glucosa y lactosa por lo que las reacciones de V.

cholerae en el son semejantes a la de varios integrantes de la familia Enterobacteriaceae que no

metabolizan la lactosa (K/A, no producen gas ni H2S). EI medio TSI está constituido por sacarosa,

glucosa y lactosa, por lo que V. cholerae presenta reacciones de A/A y no produce gas ni H2S26.

Pruebas de análisis de descarboxilación e hidrólisis (LIA).

El metabolismo microbiano involucra reacciones de descarboxilación a partir de fuentes aminoacídicas,

en el cual enzimas decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando el

correspondiente compuesto amínico. Los tres aminoácidos que se prueban regularmente en la


34

identificación de Enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La decarboxilación de lisina y ornitina da

cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que arginina genera citrulina por acción de una di

hidrolasa, provocando cambios en el pH del medio donde se llevan a cabo dichas reacciones.

A partir de un cultivo recién obtenido o fresco, los caldos en tubo para las pruebas de arginina, lisina,

ornitina y testigo (sin aminoácidos) modificados por la adición de 1% de NaCl, son ligeramente

inoculados. Posteriormente al caldo en cada tubo se agrega una capa superficial de aceite mineral

estéril de 4 a 5 mm de espesor y se incuba a 35 a 37 °C /48h leyéndose los tubos cada 24h. Si la

prueba es negativa se incuba hasta 7 días. Si se emplean indicadores como el purpura de bromocresol

y rojo de cresol, una reacción alcalina favorece un color morado y por tanto indica una prueba positiva,

por lo que una coloración en amarillo será consecuencia de una prueba negativa y de carácter acido.

La prueba será válida solamente si el tubo testigo permanece negativo (amarillo).

El agente causante de cólera (V. cholerae) es generalmente positivo para la reacción de

descarboxilasa de Iisina y ornitina (K/K, coloración morada el tubo) en tanto que otras especies de

Vibrio son negativas. Además V. cholerae es frecuentemente negativo para la dihidrolasa de arginina

(K/A, color morado–amarillo el tubo) en tanto que Aeromonas, Plesiomonas y ciertas especies de Vibrio

son positivos26.

Voges-Proskauer.

Para esta prueba se utiliza emplea un caldo de Voges-Proskauer con rojo de metilo (MR-VP) al que se

le incorpora 1% de NaCl; además se le adicionan dos reactivos denominados: reactivo A que consiste

en 5% de alfa naftol en etanol absoluto, y el reactivo B el cual es una solución de 0.3% de creatina en

40% de KOH. Se inocula el microorganismo de análisis y se incuba por 48 h y posteriormente se le

agrega los reactivos A y B posteriormente la generación de un color rojo cereza en la parte superior del

caldo en el tubo indicara una reacción positiva26.

En el cuadro 6 y 7 se muestran las características necesarias para identificar cepas del genero Vibrio y

a su vez la especie V. cholerae O1. La habilidad de V. cholerae para desarrollarse en triptona al 1 % en

ausencia de NaCl, lo diferencia de los otros Vibrios sacarosa positivo. Así mismo las tiras diagnósticas

API 20E se han usado exitosamente para su identificación y confirmación de aislamientos por lo que

su uso es ampliamente recomendado.


35

Análisis serológico.

Las colonias sospechosas se someten a la prueba de aglutinación con antisuero polivalente O1. Los

aislamientos que no aglutinen con el antisuero polivalente al serogrupo O1 se probaran con el antisuero

O139, si la reacción con el antisuero O1 y/o O139 es positiva, se identificará como presuntiva V.

cholerae O1 u O139. Posteriormente el V. cholerae O1 positivo se someterá a confirmación mediante

aglutinación con antisueros monovalentes o antisueros Ogawa o Inaba. Por el tipo específico de

antígenos O, el serogrupo O1 de V. cholerae se ha dividido en otros tres serotipos: Inaba, Ogawa y

Hikojima y una reacción positiva con cualquiera de los antisueros Inaba u Ogawa es suficiente para

confirmar la identificación de un aislamiento de V. cholerae O1, con frecuencia las cepas de un serotipo

producen una aglutinación lenta o débil con el antisuero de otro serotipo. Por tanto se deben analizar

paralelamente las reacciones de aglutinación con ambos antisueros de Inaba y Ogawa; debiendo

usarse la reacción más fuerte y más rápida para la identificación del serotipo (Cuadro 8)26,37. El

antisuero polivalente para V. cholerae O1, y monovalente Inaba y Owaga, y para antisuero O139 se

encuentran comercialmente disponibles. Los resultados de los cultivos que no aglutinan, deberán

reportarse como Vibrio cholerae No O1/ No O139.

Cuadro 8.Reacciones de aglutinación en antisuero de serotipos de Vibrio cholerae serogrupo O126,37..

V. cholerae antisuero Ogawa antisuero Inaba

Ogawa + -

Inaba - +

Hikojima + +

a + indica una reacción de aglutinación positiva en el antisuero absorbido. b – indica una reacción de aglutinación negativa en el antisuero absorbido. c si existe una reacción positiva en ambos antisueros (Ogawa y Inaba) y se sospecha como serotipo Hikojima, se envía el aislamiento a un laboratorio de referencia.

Existe la posibilidad de que no se necesite la confirmación de todos los aislamientos, en especial

cuando la disponibilidad de antisueros sea limitada. En tal caso la identificación mínima de V. cholerae

O1 demandará únicamente la confirmación serológica de presencia de antígenos del serotipo O1 en los

aislamientos presuntivos. Sin embargo, si el aislamiento proviene de una región o zona amenazada por

el cólera epidémico o que se encuentra en las primeras fases de un brote de cólera, es necesario


36

confirmar la producción de toxina del cólera y la identificación bioquímica26.

Existe la posibilidad de que no se necesite la confirmación de todos los aislamientos, en especial

cuando la disponibilidad de antisueros sea limitada. En tal caso la identificación mínima de V. cholerae

O1 demandará únicamente la confirmación serológica de presencia de antígenos del serotipo O1 en los

aislamientos presuntivos30. Por otra parte, si el aislamiento proviene de una región o zona amenazada

por el cólera epidémico o que se encuentra en las primeras fases de un brote de cólera, es necesario

confirmar la producción de toxina del cólera y la identificación bioquímica26.

Procedimiento serológico.

Las pruebas de aglutinación para V. cholerae pueden realizarse en una placa de Petri o en una lámina

de cristal limpia, comience por:

1) Fraccionar la lámina en secciones con un lápiz de cera y coloque una gota de solución salina

fisiológica en cada sección de la lámina.

2) Adicionar aproximadamente una gota de 10 μL de antisuero. Retirar una porción del crecimiento de

la superficie del medio de AHK, TSI o BHI u otro medio de agar no selectivo usando un asa de

inoculación, aguja o palillo aplicador estéril. Se debe recordar que no es apropiado realizar pruebas

serológicas con crecimiento de medios selectivos ya que esto puede generar resultados serológicos

falsos; por lo tanto emulsione y mezcle completamente el crecimiento en cada gota de solución salina

0.85% en la lámina para crear una suspensión de apariencia lechosa.

3) La segunda suspensión funcionará como control. De manera general, se mezclan en volúmenes

iguales antisuero y suspensión; sin embargo el volumen de la suspensión puede llegar a ser el doble.

4) Mezclar bien la suspensión; y el antisuero moviendo la lámina en forma de mecedora. La

aglutinación se mostrará mejor si se observa la lámina bajo una luz brillante y sobre un fondo negro. Si

la reacción positiva, aparece de 30 segundos a 1 minuto generándose un precipitado. Inspeccione la

suspensión de salina cuidadosamente para asegurarse de su uniformidad y de que no muestra grumos

resultantes por auto aglutinación; si esta aparece, el cultivo se caracteriza como “rugoso” y no podrá

ser serotipificado (Figura 7)26.


37

Figura 7.- Diagrama general de identificación serológica para V. cholerae6,26,30.

Cepa con características bioquímicas de V. cholerae

Estría en del agar de infusión de corazón (BHI), agar hierro de Kligler (KIA),

agar de tres azucares (TSI) u otro medio de agar no selectivo.

Aglutinación con solución salina

0.85%

(+)

(-)

Aglutinación con polivalente O1

Cepa rugosa

(-) (+)

Aglutinación Inaba

V. cholerae O1 V. cholerae No O1

Aglutinación con O139

(-) (+)

V. cholerae No

O139, No O1 V. Cholerae

O139

Aglutinación Ogawa

(+) (+)

V. cholerae O1,

Inaba

V. cholerae O1,

Ogawa


38

Pruebas diferenciales de identificación para biotipos de V. cholerae (El Tor y Clásico).

La determinación de la diferenciación de V. cholerae O1 en los biotipos clásico y EI Tor se considera

de importancia en el ámbito de salud pública y de epidemiologia ya que permite contribuir a identificar

la potencial fuente de la infección. Sin embargo, hay que considerar que la tipificación no es apropiada

para V. cholerae distinto de O1, y las pruebas pueden dar resultados atípicos para V. cholerae O1 no

toxígenico. Además dado que el biotipo El Clásico, se encuentra rara vez, las siguientes son pruebas

opcionales que diferencian al biotipo El Tor:

Las pruebas que se utilizan comúnmente para determinar el biotipo de V. cholerae O1 previamente

sembrado por 24h a 35-37°C en agar base sangre (ABS) son:

1.-Sensibilidad a la Polimixina B (50U), donde el Tor no presenta sensibilidad a diferencia del clásico

que muestra zonas de inhibición y 2.-Hemólisis, la cual es negativa para el clásico y positiva para Tor.

Es conveniente utilizar las dos determinaciones para especificar el biotipo, debido a que los resultados

varían entre diferentes aislamientos. Cabe señalar también que eI biotipo el Tor es el que predomina

actualmente en el mundo y es el único que se ha aislado en el continente americano21,26.

Análisis de pruebas de hemólisis y sensibilidad a polimixina B.

Desde hace tiempo el biotipo Clásico y el Tor se diferenciaban por la capacidad de este último para

producir β-hemolisinas y lisar eritrocitos (hemólisis)23. Sin embargo en décadas recientes ha habido una

tendencia a que casi todos los aislamientos del Tor en el mundo presentaron una ausencia de

hemolisis. Hay excepciones de esta tendencia y han sido las clonas de V. cholerae O1 aisladas de las

aguas del Golfo de México específicamente del área de los Estados Unidos y Australia, que son

altamente hemolíticas en placa o tubo. Por tal motivo, la reacción de hemólisis sigue siendo una

característica fenotípica útil para diferenciar cepas de V. cholerae O1 de las dos regiones mencionadas

del biotipo el Tor del resto del mundo y Latinoamérica. La hemólisis en placa se lleva a cabo al inocular

cepas sospechosas por estría en placas de agar sangre que contengan de 5% a 10% de sangre de

carnero, y se incuban a 35°C +/- 2 /18 a 24 h bajo en condiciones aerobias, debiendo incluir un testigo

altamente hemolítico. La hemólisis se determinara por la zona de colonias aisladas no en las zonas de

confluencia de las colonias. Por tanto, las colonias hemolíticas presentan zonas claras alrededor

cuando se han lisado por completo los eritrocitos así mismo las cepas que producen hemólisis

incompleta no se deben notificar como hemolíticas23,26.


39

La sensibilidad a polimixina B es otra característica del tipo Clásico, por lo que al inocular cultivos en

agar T1N1 y colocar un disco de polimixina B e incubar a 35°C+/- 2° por 12 a 18h, estas presentarán un

halo >12mm, mientras que el biotipo Tor es resistente; incluso si se inocula los cultivos sospechosos y

crecen en agar mCPC el cual contienen polimixina es considerado biotipo Tor6,23.

Determinación de la enterotoxigenicidad.

Los aislamientos identificados como V. cholerae O1 u O139, deberán probarse para la del gen ctxAB o

sus productos.

Pruebas en el laboratorio de detección de la toxina del cólera.

Un factor de virulencia de las cepas epidémicas de V. cholerae O1 es la producción de la toxina

colérica. Existen diferentes técnicas para valorar la producción de toxina del cólera, incluidas pruebas

de su actividad (biovaloraciones y cultivo de tejidos), antígenos (ELISA, coaglutinación, aglutinación en

látex) y de genes que la codifican (Sondas de ADN, PCR). Los métodos de biovaloración los cuales

emplean animales tienen el inconveniente de causarles un excesivo dolor consume mucho tiempo, es

costosa, incomoda y difícil de estandarizar, mientras que los métodos de cultivo de tejido presentan

una alta sensibilidad y fácil reproducción en el estudio de la producción de toxina. La acción de la

toxina sobre un cultivo celular ha permitido la investigación de las bases moleculares de la

patogenicidad, sin embargo el uso de cultivo de tejidos presenta inconvenientes al requerir laboratorios

con recursos especializados como personal técnico capacitado, reactivos y equipo especial. Por tal

razón y para fines prácticos de dar respuesta rápida a brotes de cólera mediante metodologías

sencillas y prácticas en el presente documento se abordaran los aspectos relacionados en los métodos

basados en inmunovaloraciones y análisis de ADN27.

Inmunovaloraciones.

Análisis de aglutinación pasiva reversa en látex (RPLA).

En el análisis de aglutinación en látex se emplean anticuerpos específicos contra la toxina colérica, los

cuales están unidos a partículas de látex; por tanto esta técnica requiere antisuero de alta calidad o

anticuerpos purificados, una adecuada preparación de látex y material de laboratorio común. Sin

embargo, ya existe un kit comercial32.

Desarrollo de la prueba: Inocular los cultivos en medio AKI y se incuban a 30±2°C/18h en agitación a


40

110 rpm; pasado este tiempo se centrifuga de 5 a 7 mL del cultivo a 8000 x g/20 minutos a 4°C,

posteriormente se filtra el sobrenadante a través de un filtro de tamaño de poro de 0.2 µm o usar sin

filtrar para emplearlo en la prueba RPLA. Reconstituir la toxina control con 0.5 mL del diluyente,

agitando suavemente hasta disolución total del contenido. El control de toxina aglutinara con el látex

sensibilizado. Su uso proporcionara los patrones positivos de referencia ilustrados más abajo, para la

interpretación de resultados. Debe incluirse el control siempre que se haga la prueba para confirmar el

funcionamiento correcto de la prueba de látex6,23,27.

Los reactivos de látex y el diluyente están listos para su uso.

Agitar los reactivos antes de usarse.

a) Distribuir una placa de microtitulación fondo en V de manera que cada fila tenga 8 pozos y por

tanto cada muestra conste de 2 filas.

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

b) c)

d) Adicionar 25 µL de diluyente en todos los pozos de las dos filas exceptuando el primer pozo.

Fila 1

Fila 2

25 μL de diluyente


41

e) Adicionar 25 μL de la muestra a probar en el primero y segundo pozo de cada fila

25μL de la muestra

f) Realizar diluciones al doble (1:2) a partir del segundo pozo de cada una de las dos filas

tomando 25μL hasta el pozo 7, dejar el último pozo que contiene solo diluyente.

Diluciones 1.2

g) Agregar 25 μL de látex sensibilizado a cada pozo de la primera fila y adicionar 25 μL de latex

control a cada pozo de la segunda fila.

h) Mezclar el contenido rotando la placa, evitar derrames del líquido entre los pozos.

i) Posteriormente cubra la placa con plástico adherible para evitar la evaporación. Colocar la

placa en un lugar libre de vibraciones a temperatura ambiente, evitando mover la placa durante

20-24h. Después coloque la placa en un lugar con fondo negro para facilitar la lectura durante

la incubación.

j) Al término de la incubación se deberá examinar cada pozo de cada fila y comparar con

testigos (2ª fila).


42

k) Descontaminar los tubos de centrifuga, filtros de membrana, placas de microtitulación, puntas

de pipetas, y esterilizar en autoclave o desinfectar antes de su desecho con solución de

hipoclorito al 1.3%. Desechar los controles de la toxina y los extractos de los cultivos en

solución de hipoclorito 1.3%.

l) La interpretación de resultados consistirá en que el patrón de aglutinación debe mostrar el

siguiente comportamiento ejemplificado a continuación. Los resultados clasificados con (+),

(++) y (+++) se consideran como positivos.

Los resultados en los pozos de la fila que contiene el látex control deben ser negativos. Y solo en

algunos casos pueden observarse aglutinaciones no específicas; en tales casos los resultados deben

interpretarse como positivos si la reacción con el látex sensibilizado es positiva a una dilución mayor

con la muestra como se ve con el látex control. El último pozo de todas las filas debe ser negativo. Si

se observan patrones positivos en algunos de estos pozos la reacción debe considerarse no valida. Por

otra parte cuando existe una cantidad excesiva de toxina, puede observarse un efecto prozona. Por

ejemplo se da un patrón negativo en pozos que contienen la muestra no obstante, como resultado de

las diluciones al doble, la concentración de toxina en cada pozo a lo largo de la fila se va reduciendo

progresivamente y por lo tanto, el efecto prozona originado por el exceso de toxina desaparecerá. Un

patrón positivo de aglutinación puede ser observado tras haber visto patrones negativos en los

primeros pozos de la fila. Con tales resultados la muestra debe reportarse como positiva. La prueba

presenta limitaciones y estas son que la sensibilidad para detectar la toxina es de 1-2 ng/mL, por tanto

si la toxina esta es proporciones menores arrojara un resultado negativo

Detección del gen toxigénico de cólera por PCR.

Esta técnica tiene la ventaja de ser rápida por no requerir cultivos puros ni microorganismos viables. Se

pueden amplificar los segmentos seleccionados de ADN a partir de los caldos incubados de

Botón

(-) (±) (+) (++) (+++)


43

enriquecimiento o preenriquecimientos ambientales determinando la presencia del microorganismo o

toxina que se busca un microorganismo sin cultivarlo. Mediante el uso de PCR se puede identificar al

gen relacionado directa o indirectamente con el potencial toxigénico del microorganismo aunque no se

esté expresando la proteína.

La técnica de PCR se lleva a cabo dentro del termociclador e involucra que la doble cadena de ADN

blanco o molde, obtenido previamente a partir del ADN total extraído de los microorganismos presentes

en la muestra, se desnaturalice mediante calor, para suministrar moldes de cadena sencilla, a los que

se unen los cebadores de oligonucleótidos específicos (primers). Éstos se hibridan a su secuencia

complementaria en el ADN blanco, seguido por la extensión del cebador a cargo de una ADN

polimerasa termoestable, con lo cual se van generando copias de la región del ADN molde que

flanquean los cebadores. Este ciclo se repite muchas veces, enriqueciéndose de copias del fragmento

de interés (porción del gen ctxAB). Múltiples métodos de PCR aplicada a diferentes microorganismos

están basados en la inclusión de un paso que involucra la extracción de ADN a partir de alimentos

contaminados, esto por supuesto implica un mayor tiempo de análisis y regularmente también cambios

en la matriz alimentaria; por lo que para esto la reacción de amplificación se puede desarrollar con

lisados crudos de células o en su caso una breve ebullición de una suspensión bacteriana. La PCR

puede detectar hasta una sola célula bacteriana con regímenes de ciclo extendido (50-60) sin embargo

el límite de detección de la PCR directa es limitado (alrededor de 104 unidades bacterianas/g de

alimento). Este nivel de detección se debe a las limitaciones de volumen de reacción (25-100 μL), el

aumento en los productos no específicos y del efecto inhibidor de muchos componentes de los

alimentos sobre la enzima polimerasa Taq. A partir de procedimientos de enriquecimiento resultando en

un aumento de la sensibilidad límites de 0.1 células microbianas/g de alimentos. Los resultados de

amplificación en PCR se obtienen mediante la separación de los productos de amplificación

(amplicones) mediante electroforesis en gel de agarosa peso molecular en pares de bases, por

comparación de un marcador de peso, tinción con colorante intercalante (p. ej. Bromuro de etidio) y

visualización con fluorescencia inducida por luz UV. El método de amplificación y análisis

electroforético requiere generalmente de 2 a 4h después de un enriquecimiento, la sensibilidad,

especificidad y el tiempo permiten que este método de PCR se ha una manera rápida, eficaz y robusta

para la detección de genes de microrganismos patógenos en alimentos. La producción de toxina del

cólera (codificada por los genes ctxAB) es el principal factor en la patogenicidad de la bacteria. El gen


44

de la principal toxina del cólera CT puede estar presente en cepas pero no expresarse bajo condiciones

experimentales. Las colonias aisladas en placas de agar selectivo o diferencial e identificadas

bioquímica y serológicamente como V. cholerae, se someten a la prueba de PCR, en la cual se

amplifica una secuencia de ADN específica: el fragmento ctxAB del genoma de V. cholerae (factor

genético relacionado a la producción de enterotoxina), tiene un tamaño de 777 p.b., detectados

mediante electroforesis en gel de agarosa15,23,27,.

Procedimiento para la amplificación de secuencia de gen de V. cholerae que codifica para toxina

de cólera usando APA como caldo de enriquecimiento.

Se realiza preparando la muestra de alimento con el caldo de enriquecimiento e incubando por 6 a 24h

a 35°C±2°C, posteriormente se somete a ebullición 1 mL de la mezcla en tubos de microcentrifuga de

1.5 mL durante 10 min. Los lisados pueden ser almacenados en congelación a -20°C hasta su uso o

inmediatamente para someterlos a su análisis por PCR. Si se procesa inmediatamente se debe hacerlo

de manera simultáneamente con un cultivo control de V. cholerae, de un volumen de 1 mL en APA,

incubado 18 h a 35 °C ±2°C y repitiendo el mismo proceso de ebullición.

A partir de cepas aisladas: Se toma una asada poco abundante de la cepa problema y se resuspende

en un tubo estéril de 1.5mL que contenga 100µL de agua grado biología molecular. Realizar este pasó

por duplicado. En otro tubo adicionar 100µL de agua grado biología molecular como control negativo

de extracción. Colocar los tubos tapados en el termobloque el cual previamente debe encontrarse a

95°C. Incubar los tubos por 5 minutos. Sacar los tubos del termobloque y almacenarlos en refrigeración

por no más de 8 h o en congelación por más tiempo.

Preparación de la reacción PCR.

Consistirá primeramente en minimizar la contaminación cruzada de los reactivos para lo cual se

recomienda que las mezclas maestras o madre sean preparadas, alicuotadas y almacenadas en

congelación hasta su uso, las mezclas maestras contendrán todos los reactivos necesarios excepto

Taq polimerasa y los lisados (molde) a ser amplificados. La reacción final contendrá 10 mM Tris-HCl,

pH 8.3; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM de cada dATP, dCTP, dGTP, y dTTP; 2 a 5% (v/v) APA

lisado; 0.5 µM de cada primer y 2.5 U Taq polimerasa por cada 100 µL de reacción; los volumen de

reacción que pueden ser usados son de 25-100 µL se adiciona la Taq polimerasa a la mezcla maestra


45

y el lisado APA en una distribución de 0.6 mL en los tubos de microcentrifuga de reacción. Cubrir con

aproximadamente 50-70 µL de aceite mineral esto si el termociclador lo requiere. A continuación se

ajustan las condiciones del termociclador para una eficiente amplificación del gen ctx considerando no

más de 35 ciclos y una desnaturalización inicial de 3 minutos a 94°C, desnaturalización de un minuto a

94°C, hibridación de primers a 55°C por 1 minuto, extensión de primers 1 minuto a 72°C, y

amplificación final durante 3 minutos a 72°C. Posteriormente se lleva acabo el análisis en gel de

agarosa de los productos de PCR que consistirá en mezclar porciones de 10-20 μL de la reacción de

PCR con buffer de carga 6X y colocar la muestra en los pocillos de gel de agarosa de concentración de

1.5-1.8% sumergido en 1X TBE conteniendo 1 µg/mL de bromuro de etidio. Suministre voltaje

constante de 5-10 V/cm, posteriormente visualice las bandas y la migración de los marcadores

moleculares. El producto de la PCR es un fragmento de 777bp de ctxAB, tome las fotografías

respectivas de los geles y reporte resultados, debiéndose incluir los controles positivos y negativos

cada que se realice un análisis en PCR15,23,27. El reporte final por PCR debe incluir las características

de identificación mínimas para los aislados de V. cholerae (Cuadro 9) así mismo la identificación de V.

cholerae por ensayos de PCR deben incluir procedimientos de microbiología tradicional.

Cuadro 9. Pruebas mínimas para la identificación de cepas aisladas de Vibrio cholerae15,23.

Prueba de análisis Reacción Porcentaje (%)

Gram (-) negativo, no esporulado + 100

Oxidasa + 100

Desoxicolato ± 100

L-lisina descarboxilasa + 100

L-arginina dihidrolasa - 0

L-ornitina descarboxilasa + 98.9

Crecimiento en caldo triptona 1%1 + 99.1b

1Sin adición de cloruro de sodio.

bV. cholerae (V.mimicus)


46

10. INFORME FINAL DE RESULTADOS DE LABORATORIO.

El informe final de V. cholerae, debe incluir la identificación serológica, bioquímica de los aislamientos y

los resultados de enterotoxigenicidad.

En caso de muestras positivas debe ser emitido de forma inmediata para permitir las acciones

pertinentes, en el caso de una vigilancia sanitaria.

Reportar ausencia de V. cholerae incluyendo la masa o volumen de muestra utilizado cuando no se

localicen colonias características.

Reportar como presencia de V. cholerae (incluir la masa o volumen de muestra empleado)

dependiendo de los resultados encontrados)

V. cholerae O: 1

V. cholerae O: 139

V. cholerae No O1 o V. cholerae No O: 139.

Todas las muestras positivas a V. cholerae O: 1 y O: 139, aisladas de aguas y alimentos deberán ser

enviadas para su confirmación y prueba de toxigenicidad a la CCAyAC6.

11. LINEAMIENTOS GENERALES.

a) Envío de cepas a CCAyAC para su confirmación y prueba de toxigenicidad.

Todas las cepas positivas a V. cholerae O:1 y V. cholerae O:139, deberán ser

enviadas a la CCAyAC, en un plazo no mayor a 48 horas. En caso de brote, deberán

enviarse de inmediato.

Asimismo, deberán enviarse el 30 % de las cepas de V. cholerae No O:1

En caso de aislar V. parahaemolyticus, deberá enviarse el 10 % de las cepas. Él envió

de cepas deberá realizarse de acuerdo a los lineamientos de embalaje de triple

envasado descritas en el Manual de Bioseguridad en el Laboratorio emitido por la

Organización Mundial de la Salud29 correspondiente al transporte de sustancias

infecciosas.

b) Asimismo, deberá cumplirse con lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM-016-SSA2-

2012, Para la vigilancia, prevención, control, manejo y tratamiento de cólera. Tanto para la

vigilancia regular, como para la atención de brotes de cólera.


47

c) En caso de brotes, la cantidad de muestra colectada deberá ser la necesaria para el análisis

acorde a la naturaleza de la misma conforme a lo establecido en el presente manual, sin

embargo se podrán hacer excepciones a la cantidad disponible de las muestras para la

ejecución del análisis.

d) El análisis en el laboratorio de muestras involucradas en brotes, deberá ser ejecutado acorde a

la metodología establecida en el presente manual. Adicionalmente para estos casos, se puede

hacer uso de métodos rápidos de detección de V. cholerae; como es el caso del PCR en

tiempo real automatizado debidamente establecido y validado. Sin embargo, cualquier

resultado positivo por esta metodología deberá ser confirmado por los métodos descritos en el

presente manual.

e) Las áreas de regulación deberán notificar con anticipación a los laboratorios en donde se

reciba la muestra para su análisis, preferentemente 48 h antes de realizar el muestreo y bajo

un programa de muestreo establecido en conjunto, con excepción de situaciones emergentes.

Durante un brote, los laboratorios deberán informar de manera expedita y oportuna los resultados

obtenidos de las muestras analizadas al área de Protección Contra Riesgos Sanitarios del nivel

Estatal, a la Comisión de Evidencia y Manejo de Riesgo, Comisión de Operación Sanitaria y a

la Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.


48

12. GLOSARIO :

Alimento: Cualquier sustancia en estado sólido o liquido el cual es consumido por los seres vivos con

finalidades nutricionales, metabólicas y fisiológicas.

ADN: Molécula polimérica natural o sintética formada por el azúcar desoxirribosa, fosfato y una base

púrica (adenina, guanina) o pirimidínica (citosina, timina), ordenadas de acuerdo a una secuencia

específica. Cuando el ADN es de doble cadena, cada hebra que lo forma es de secuencia auto

complementaria y se mantienen unidas en dirección anti paralela, una con respecto a la otra, mediante

puentes de hidrógeno.

Agar Selectivo: Medio solido de cultivo que favorece el crecimiento de cierto tipo de microrganismos.

Agua Potable: Agua apta para el consumo humano, libre de riesgos físicos, químicos y biológicos para

la salud, después de ser sometida a procesos de purificación.

Agua Superficial: Es la proveniente de las precipitaciones, que no se infiltra ni regresa a la atmósfera

por evaporación o la que proviene de manantiales o nacimientos que se originan de las aguas

subterráneas.

Anaerobio: Microorganismo capaz de crecer en condiciones ausentes de oxígeno.

Antígeno: Sustancia generalmente de naturaleza proteica que estimula el sistema inmunitario con la

formación de anticuerpos.

Brote: Presencia de dos o más casos confirmados relacionados epidemiológicamente entre sí o la

aparición de un caso en un área donde no se había demostrado la existencia previa de enfermedad.

Caldo de Enriquecimiento: Medio de cultivo en estado líquido el cual contiene todos los nutrientes

necesarios para favorecer el aislamiento de uno o varios microorganismos específicos.

Condición Sanitaria: Especificaciones o requisitos sanitarios que deben reunir cada uno de los

insumos, establecimientos, actividades y servicios que se establecen en los ordenamientos

correspondientes.

Congelación: Método físico que se efectúa por medio de equipo especial para lograr una reducción de

la temperatura de los productos de tal manera que garantice que su centro térmico esté congelado (-

20°C).

Control Sanitario: Conjunto de acciones de orientación, educación, muestreo, verificación y, en su

caso, aplicación de medidas de seguridad y sanciones, que ejerce la Secretaría de Salud con la


49

participación de los productores, comercializadores y consumidores, con base en lo que establece la

Ley General de Salud, el presente manual, las Normas Oficiales Mexicanas y otras disposiciones

aplicables.

Electroforesis: Técnica de biología molecular que consiste en la separación de moléculas acorde a la

movilidad y masa molecular de estas bajo un campo eléctrico; las muestras de análisis común son

mezclas de proteínas o ácidos nucleicos.

Endemia: Presencia constante o prevalencia habitual de casos de una enfermedad o agente

infeccioso, en poblaciones humanas, dentro de un área geográfica determinada.

Enterotoxina: Sustancia producto del metabolismo celular principalmente bacteriano el cual presenta

efectos tóxicos en el sistema gastrointestinal del ser humano.

Enzima: Molécula de origen proteico que realiza funciones catalíticas al incrementar la velocidad de

reacciones químicas termodinámicamente posibles en sistemas biológicos.

Epidemia: Aumento en la frecuencia esperada de cualquier daño a la salud en el ser humano, durante

un tiempo y un espacio determinados. En algunos padecimientos la ocurrencia de un solo caso se

considera epidemia.

Etiquetado: Acción de colocar cualquier rótulo, marbete, inscripción, imagen u otra materia descriptiva

o gráfica, escrita, impresa, estarcida, marcada, grabada, adherida, sobrepuesta o fijada al contenedor

de la muestra.

Inmunoglobulina: Elementos del sistema inmunitario para identificar y neutralizar partículas extrañas

nocivas para la salud del organismo productor.

Medidas de Prevención: Conjunto de acciones encaminadas a la preparación y disposición que se

hace anticipadamente para evitar un riesgo.

Mezcla maestra: disolución acuosa que contiene todos los componentes o ingredientes reactivos

necesarios para que se efectúe la reacción en cadena de la polimerasa, excepto el ADN molde o

templado sujeto de amplificación.

Microbiota: Conjunto de microorganismos que se localizan de manera normal en diferentes sitios los

cuales pueden ser desde el cuerpo humano hasta diferentes ecosistemas.

Muestreo: Operación de selección de una muestra representativa a partir de una población sujeta a

una determinación analítica.

Oligonucleótidos: Pequeñas hebras de ADN artificial de cadena sencilla, de secuencia conocida, que


50

flanquean los extremos de la región genética del templado de interés, y que sirven para ubicar el sitio

de síntesis de ADN para la enzima ADN polimerasa. Se consideran un reactivo de la PCR. También se

les llama iniciadores o primers.

Operón: Elemento genético bacteriano que contiene varios genes agrupados en bloque, corregulados

transcripcionalmente. Está formado por: sitios operadores, promotores y genes estructurales.

Patógeno: Entidad biológica capaz de producir enfermedad y daño al huésped.

Procedimiento: Conjunto de acciones realizadas siempre de la misma forma para obtener los mismos

resultados.

Rastreabilidad: Capacidad para seguir el desplazamiento de un alimento a través de una o varias

etapas especificadas de su producción, transformación, distribución o muestreo.

Refrigeración: Método físico de conservación con el cual se mantiene la temperatura interna de un

producto de 0°C a 4°C.

Reacción en cadena de la polimerasa: Técnica de biología molecular in vitro que permite incrementar

de manera exponencial el número de copias de un segmento de ADN de interés, gracias a la enzima

ADN polimerasa, la cual es termorresistente.

Riesgo Sanitario: Probabilidad de ocurrencia de un evento exógeno adverso, conocido o potencial,

que ponga en peligro la salud y/o la vida humana.

Salud Pública: Conjunto de actividades encaminadas a proteger y mejorar la salud de la población,

entendiendo por salud al estado de bienestar somático, psicológico y social de un individuo y de la

población general.

Sistema Nacional de Salud: Conjunto de dependencias y entidades de la administración pública, tanto

federal como local y las personas físicas o morales de los sectores social y privado que prestan

servicios de salud, así como por los mecanismos establecidos para la coordinación de acciones. Tiene

por objeto dar cumplimiento al derecho de la protección a la salud.

Sub muestra: Porción representativa de un conjunto total que corresponde a una muestra.

Sustrato: Molécula a la cual se une la enzima para su posterior trasformación en otra molécula de

diferentes características.

Técnica: Conjunto de procedimientos y recursos de que se sirve una ciencia o un arte para obtener un

resultado determinado.

Templado: Molécula de ADN de interés; también se conoce como molde ya que sirve para obtener


51

copias fieles de la misma mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa.

Termociclador: Equipo que permite tener y mantener de manera programada, grandes cambios de

temperatura, de forma muy rápida y repetida. Su fundamento es la tecnología Peltier y en él se lleva a

cabo la PCR.

Termolábil: Sustancia o compuesto sensible a su descomposición por acción del calor.

Transporte: Acción de traslado en condiciones asépticas y de refrigeración de los productos o

muestras hasta el laboratorio para su análisis microbiológico.

Vigilancia Sanitaria: Conjunto de acciones de evaluación, verificación y supervisión del cumplimiento

de los requisitos establecidos en las disposiciones aplicables que deben observarse en los procesos,

productos, métodos, instalaciones, servicios o actividades relacionados con las materias competencia

de la Comisión Federal.


52

13. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS.

/: Por.

–: Negativo.

+: Positivo.

±: Más, menos.

≤: Menor o igual que

≥: Mayor o igual que

°C: Grados centígrados.

°T: Temperatura

A/A: Ácido/Ácido.

ABS: Agar Base Sangre.

ADN: Ácido desoxirribonucleico.

AMPc: Monofosfato de Adenosina Cíclico.

APA: Agua Peptonada Alcalina.

ATP: Trifosfato de Adenosina.

BHI: Agar Infusión de Corazón.

CCAYAC: Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura antes Laboratorio Nacional de

Referenecia

CDC: Centers for Disease Control and Prevention-Centros para la Prevención y Control de

Enfermedades de los Estados Unidos de América.

COFEPRIS: Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.

CST: Caldo Soya Tripticasa.

CT: Toxina de Cólera.

d: Día.

DO: Densidad Óptica.

ELISA: Ensayo por inmunoadsorción Ligado a Enzimas.

g: Gramo.

h: Hora.

INDRE: Instituto Nacional de Referencia Epidemiológica.


53

INEGI: Instituto Nacional de Estadística y Geografía.

K/A: Alcalino/Ácido.

K/K: Alcalino/Alcalino.

Kg: Kilogramo.

KIA: Agar Hierro Klieger.

L: Litro.

Lb: libras de presión

LPS: Lipopolisacárido.

m: Metro

mCPC: Agar Modificado de Celobiosa, Polimixina, B- Colistina.

mg: Miligramos.

mL: Mililitro.

ng: Nanogramo

NTC: Control negativo de reactivos de PCR.

OMS: Organización Mundial de la Salud.

OPS: Organización Panamericana de la Salud.

p.b.: pares de bases

p/v: Peso/Volumen.

PBS: Solución Salina Reguladora de Fosfatos.

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa.

pH: Potencial de Hidrogeno.

RPBI: Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos.

RPLA: Prueba de Aglutinación Pasiva Reversa en Látex.

s: Segundo.

TCBS: Agar tiosulfato, citrato sales biliares sacarosa.

TSI: Agar Hierro Triple Azúcar.

UV: Luz ultravioleta

Vf: Volumen final.

Vi: Volumen inicial.

μL: Microlitro.


54

14. – BIBLIOGRAFÍA.

1. Elisa L. Elliot, Charles A. Kaysner y Mark L. Tamplin. (1984). Sample collection and Preparation for

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3. Castañeda, F., Torres-Infante, E., Gálvez-González, C.O. (2013). Catálogo Oficial de Medios de Cultivo. CCAYAC-CT-03. Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura (CCAYAC).

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5. Hernández-Cortez, C, Aguilera-Arreola Ma. Guadalupe, y Castro-Escarpulli G. (2011). Gastrointestinal diseases, situation in México. Enf Inf Microbiol. 31(4): 137-151.

6. Cano Ramirez L.A., Dehmer Mariel C.J, Soberanes Durán R.M. (2014). Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura (CCAYAC). Método de prueba para la determinación de V. cholerae en alimentos y agua para consumo humano. CCAYAC-M-002.

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16. Tovar Guzmán, V y Bustamante Montes, P. (2000). Historia del cólera en el mundo y México.


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Ciencia Ergo Sum, (7):2. 17. Vargas Tapia Prándiz A. y Gallardo y Ramos R. (1992). Manual de técnicas y procedimientos para

la investigación de Vibrio cholerae en agua y alimentos. Secretaría de Salud. Series Manuales Técnicos. OPS.

18. Weekly epidemiological record Relevé épidémiologique hebdomadaire 2 August 2013, 88th year / 2 AOÛT 2013, 88e année No. 31, 2013, 88, 321–336.http://www.who.int/wer

19. Huq, A., Haley, B.J., Taviani, E., Chen, A., Hasan, N.A., and Colwell, R.R. (2012). Detection, isolation, and identification of Vibrio cholerae from the environment. Curr. Protoc Microbiol. 6A.5. doi:10.1002/9780471729259.mc06a05s26.

20. Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos. Lineamientos para la vigilancia por laboratorio de la enfermedad diarreica aguda bacteriana (cólera, salmonelosis y shigelosis). InDRE – RNLSP 2012.

21. Kaysner Charles A. and De Paola, A. (2001). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods edited by Frances Pouch Downes, Keith Ito, American Public Health Association. Fourth edition. Chapter Vibrio. pp. 405-420.

22. Kaysner Charles A. and De Paola, Angelo. (2004). Vibrio. Bacteriological Analytical Manual (BAM). Chapter 9. http://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ucm070830.htm

23. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. Chapter V. Examination of food and environmental samples. http://www.cdc.gov/cholera/laboratory.html.

24. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. Chapter IV. Isolation of Vibrio cholerae from fecal specimens. http://www.cdc.gov/cholera/laboratory.html.

25. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. Chapter V. Examination of food and environmental samples. http://www.cdc.gov/cholera/laboratory.html

26. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. Chapter VI. Laboratory identification of vibrio cholerae. http://www.cdc.gov/cholera/laboratory.html

27. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. Chapter VII. Detection of cholera toxin. http://www.cdc.gov/cholera/laboratory.html

28. Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad. Centro de coordinación de alertas y emergencias sanitarias. Secretaria General de Sanidad y Consumo Dirección General de Salud Pública, Calidad e Innovación. Brote de cólera en México. Informe de situación y evaluación del riesgo para España. 24 de octubre de 2013. www.msssi.gob.es/profesionales/.../ccaes_colera_octubre2013.pdf

29. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio (2005). Organización Mundial de la Salud. Tercera edición. ISBN 9243546503. http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf

30. Departamento Bacteriología. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.(2010). Manual de Procedimientos Aislamiento, identificación, caracterización y pruebas de sensibilidad a antimicrobianos de Vibrio cholerae. Ministerio de salud-Argentina.

31. Manual de Procedimientos Estandarizados para la Vigilancia Epidemiológica de Cólera. (2012). Secretaría de Salud .Subsecretaría de Prevención y Promoción de la Salud. Dirección General de Epidemiología. www.salud.gob.mx · www.dgepi.salud.gob.mx


56

32. Madigan M.T., Martinko John M., Parker, J. (2004). Brock biología de los microorganismos. 10ma

Edición. Prentice Hall. 33. Mull, B and Hill, VR. (2012). Recovery of diverse microbes in high turbidity surface water samples

using dead-end ultrafiltration. J. Microbiol. Meth. 91:429-433. 34. Norma Oficial Mexicana NOM-243-SSA1-2010, Productos y servicios. Leche, fórmula láctea,

producto lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Métodos de prueba.

35. Norma Oficial Mexicana. NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba. DOF: 10/02/2011.

36. Organización Panamericana de la Salud. Situación actual del cólera en la Región de las Américas. 19 octubre. [Internet]. 2013. Available from: http://www.paho.org/hq/index.php?option=com_docman&task=doc_view&gid=23407&Itemid=

37. Perilla Mindy J., Ajello Gloria, Bopp Cheryl, Elliott John, Facklam Richard, Knapp Joan S., Popovic Tanja, Wells Joy, And Dowell Scott F. (2004). Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella serotipo Typhi, Shigella y Vibrio cholerae. Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Centro Nacional para las Enfermedades Infecciosas y Organización Mundial de la Salud, Enfermedades Transmisibles. Vigilancia y Respuesta. WHO/CDS/CSR/RMD/2003.6 © Organización Mundial de la Salud.

38. Marco Sebastiano Nicolò and Salvatore Pietro Paolo Guglielmino (2012). Viable but Nonculturable Bacteria in Food, Public Health - Methodology, Environmental and Systems Issues, Prof. Jay Maddock (Ed.), ISBN: 978- 953-51-0641-8, InTech, Available from: http://www.intechopen.com/books/public-health-methodologyenvironmental- and-systems-issues/viable-but-not-culturable-bacteria-in-food

39. Smith, CM and Hill, VR. (2009). Dead-end Hollow Fiber Ultrafiltration for Recovery of Diverse Microbes in Water. Appl. Environ. Microbiol. 75(16):5284-5289.

40. Procedimientos para la búsqueda de Vibrio cholerae en muestras ambientales (2010). Organización Panamericana de la Salud (OPS). http://new.paho.org/hq/dmdocuments/2010/Muestreo_ambiental_V_cholerae.pdf

41. Rodríguez Solís, E., Ruiz Rodríguez, MA., Pineda Mejía, R., Murguía Martínez, P. y Valtierra Ruiz, A. (2012). Manual Para la Vigilancia Epidemiológica del Cólera; 2ª Edición. Secretaría de Salud México.

42. Romero Cabello R. (2007). Microbiología y Parasitología Humana/Bases etiológicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias. 3ra edición. Editorial Médica Panamericana. ISBN: 978-968-7988-48-1. Pp.846-857.

43. Basic Epidemiology. Bonita R. Beaglehole r and Kjellstrröm. World Health Organization. 2nd edition. Rev y Reempresion 2014.

44. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs107/es/#


57

ANEXO I.

MÉTODO DE CONCENTRACIÓN-CDC-33,39.

1. Introducción.

El presente procedimiento describe el método de ultrafiltración o concentración a través de fibra

hueca sin salida para el muestreo y recuperación de virus, bacterias y parásitos en grandes

volúmenes de agua. Esta técnica conocida como ultrafiltración es aplicable a todas las muestras

de agua, sin embargo el agua con turbiedad puede afectar las tasas de filtración. La técnica ha

demostrado ser efectiva para el agua de proceso que contenga valores de turbiedad < 5NTU

(unidades nefelométricas de turbidez), así como para muestras de aguas residuales y muestras de

agua con una turbiedad de hasta 80 NTU. Este método puede realizarse en campo o laboratorio

con un mínimo entrenamiento técnico del personal.

2. Equipo, reactivos y suministros.

2.1. Equipo e instrumentos

2.1.1. Bomba peristáltica

2.1.2. Totalizadora de flujo de agua, caudalímetro o probeta graduada de 1L

2.1.3. Balanza

2.1.4. Pipeteador automático

2.1.5. Micropipeteador de 1000 µL

2.1.6. Pinzas manuales

2.1.7. Cronometro con segundero de mano

2.2. Reactivos

2.2.1. Polifosfato de sodio (NaPP).

2.2.2. Tween 80

2.2.3. Emulsión antiespumante Y-30

2.2.4. Tiosulfato de sodio

2.2.5. Agua desionizada, dH2O

2.2.6. APA 2X

2.3. Suministros.

2.3.1. Filtro de diálisis Modelo -REXEED-25S-


58

2.3.2. Tubería de silicón L/S 36

2.3.3. Tubería de silicón I/P 89

2.3.4. Adaptador DIN

2.3.5. Tapas de puerto

2.3.6. Tapas de almacenamiento para filtros

2.3.7. Conector de reducción 5/8" x 3/8"

2.3.8. Abrazaderas, SNP-8




2.3.12. Adaptador 3/4" GHT

2.3.13. Adaptador de inserción giratorio x NPT

2.3.14. Contenedores plegables de 20L

2.3.15. Pipetas desechables de plástico de 10mL

2.3.16. Guantes de látex

2.3.17. Vasos de precipitado de 1L

2.3.18. Botellas pyrex de tapa rosca de 500mL

2.3.19. Botellas de plástico de 1L

2.3.20. Botellas de plástico de 125mL

2.3.21. Jeringas de 60 mL

2.3.22. Canoas de pesado

2.3.23. Espátulas de pesado

2.3.24. Puntas para micro pipeta de 1000 µL


59

3. Procedimiento.

3.1. Ultrafiltración.

3.1.1. La técnica es útil para cualquier cuerpo de agua ya sea presurizadas como el caso de

ríos y agua de la llave o sin presión como son pozos y lagunas.

3.1.2. Para ejecutar la técnica se debe registrar la información pertinente para asegurar la

trazabilidad de la muestra, para este fin se puede utilizar una hoja de datos de colecta,

además de etiquetar el ultrafiltro con el nombre de la muestra, fecha y hora de colecta.

3.1.3. Ensamblar el dispositivo acorde a la siguiente figura:

Figura 1. Componentes del equipo de concentración por ultrafiltración durante el muestreo de

agua en campo.

Adaptador a

puerto de

entrada

Sujetador

de tubería

de succión

Dirección

de flujo

Encendido

Caudalimetro Agua filtrada Muestra de agua

Sellar puertos extras de

filtro


60

Se utilizara un caudalimetro para medir el volumen de agua filtrada y así calcular la totalidad;

registrar el volumen inicial en la hoja de datos (Figura 1).

3.2. Instrucciones.

3.2.1. Colocar el tubo de entrada (conectado al puerto final azul) en el cuerpo de agua,

garantizando que el extremo de la tubería se mantenga por debajo de la superficie del

agua.

3.2.2. Alimente la entrada del tubo a través de la cabeza de la bomba, cierre el nivel de la

bomba y coloque el extremo de la tubería en la fuente de agua.

3.2.3. Conecte el cable de alimentación adecuado a la toma en la parte posterior de la bomba y

el otro extremo del cable de alimentación a la fuente de poder. La fuente de poder puede

ser externa 12-18 V DC 70 watts o 90-260V AC 47-65Hz.

3.2.4. Determine la dirección de flujo deseada y ajuste el interruptor de dirección de flujo.

Asegurarse que la velocidad se ajusta a cero antes de comenzar a funcionar la bomba.

3.2.5. Encienda la bomba, una vez que la bomba ha iniciado, la velocidad puede ser ajustada

para aumentar gradualmente hasta la velocidad máxima ajustada.

3.2.6. Dejar filtrar el volumen deseado.

3.3. Registre el tiempo de inicio de la filtración.

3.3.1. Por medio del flujometro de agua o caudalimetro tome las lecturas iniciales y finales, la

unidad de medida serán galones (ejemplo 100 L=26.4 gal; 50 L=13.2gals); y deje correr

el agua hasta la lectura deseada.

3.3.2. Si no se utiliza un totalizador de flujo, medir periódicamente la velocidad de flujo y

registrar el tiempo y la velocidad de flujo. Estimar el volumen total de agua filtrada al

multiplicar el tiempo de filtración acumulativo y mediciones de la tasa de flujo.

3.3.3. Monitorear el flujo usando la graduación en la probeta, leer el nivel de agua en el cilindro

y multiplicar por 2 para calcular la tasa de flujo por minuto (ejemplo 900 mL X 2 = 1800

mL/min= 1.8 L / min) y registrarlo en la hoja de datos.

3.3.4. Calcule el tiempo necesario para filtrar el volumen de agua deseado (ejemplo 100 L/1.8 L

= 55.5 minutos). Repita este cálculo cada 15 minutos para medir con precisión cuanto

tiempo debe funcionar la bomba con el fin de filtrar el volumen deseado de agua.

3.3.5. Durante la filtración, inspeccione visualmente el caudal de la tubería de efluentes.


61

Cambios drásticos en el caudal indicaran obstrucción del filtro en función de la calidad del

agua o atrapamiento de un objeto en la tubería o filtro.

3.3.6. Detener la bomba/cerrar el grifo o llave de agua después del volumen de agua filtrado y

es registrado el tiempo final de la filtración.

3.3.7. Si existe cloro libre o se sospecha en la fuente de agua, adicione solución de tiosoulfato

de sodio al 1% al filtro inmediatamente después de colectar la muestra de agua.

3.3.8. Retire todos los tubos del ultra filtro y coloque sus tapas en todos los puertos y almacene

y envíe inmediatamente al laboratorio para su análisis..

3.3.9. No es necesario colocar el filtro en refrigeración para su transporte al laboratorio.

3.3.10. Los tubos de efluentes puede ser desechado después de la colecta de la muestra, la

tubería de filtrado puede ser re utilizado para consecuentes muestreos.

3.3.11. Registrar todos los datos obtenidos en la hoja de campo utilizada (figura 3).

3.4. Manipulación en el laboratorio de la muestra colectada.

3.5. Ultrafiltrado por retro enjuague.

3.5.1. Realizar la solución de polifosfato de sodio al 10% adicionando 1g a 10 mL de agua

desionizada.

3.5.2. Preparar la solución emulsionante al 1% de antiespumante Y-30, esto adicionando 100

µL, a 9.9 mL de agua desionizada.

3.5.3. Preparar la solución de enjuague (Tween 80 al 0.5%, polifosfato de sodio 0.01% y

0.001% antiespumante Y-30) adicionando 2.5mL de Tween 80, 500 µL de solución de

polifosfato de sodio al 10% y 500 µL de la solución de antiespumante Y-30 al 1% y

complementar con 496.5 mL de agua desionizada (solución de enjuague).


62

3.5.4. Montar el equipo de filtración para el retro enjuague acorde a como se muestra en la

figura 2.

Figura 2. Procedimiento de ultrafiltración por retro enjuague de la muestra de agua colectada

en campo.

3.5.5. Retirar las tapas de la entrada o puerto final azul y lateral naranja

3.5.6. Conecte el tubo al puerto lateral naranja y asegure con una abrazadera de manguera.

3.5.7. Coloque la manguera de tubería a través de la bomba peristáltica y lleve el extremo de la

tubería dentro de la solución de enjuague para el retro lavado.

3.5.8. Mantener el puerto final azul sobre un recipiente de 1L para capturar la solución de retro

lavado.

3.5.9. Bombear la solución de enjuague a través del ultrafiltro a 650 mL/min, colectando la

solución de enjuague en un frasco o recipiente estéril. Si la bomba no presenta pantalla

digital la velocidad de flujo se ajusta a una menor.

3.5.10. Continúe bombeando hasta que la velocidad de flujo de salida del ultrafiltro ha

disminuido al mínimo y no queda más solución de enjuague.

Puerto de

conexión al

filtro Ajustador de

tubería para

succión de

solución de

enjuague

Puerto de

salida de la

solución de

enjuague

filtrada

Solución de

enjuague

Puerto

sellado

Puerto

sellado


63

3.5.11. Medir y registrar el volumen de enjuague si es necesario.

3.5.12. Proceder al enriquecimiento de la muestra (solución de enjuague colectada).

3.5.13. 1.-Enriquecimiento con agua peptonada alcalinizada (APA)

3.5.14. Llevar a temperatura ambiente el APA a 10x y 2x

3.5.15. Mezclar 500mL del agua del retrolavado por ultrafiltro con 500mL de APA 2X en un

frasco de 1L e incubar a 37°C toda la noche.

3.5.16. El aislamiento de V. cholerae O1 puede ser incrementado a 42°C y si los recursos del

laboratorio lo permiten, se puede realizar un duplicado e incubar las muestras a 42°C.

3.5.17. Proceder a la identificación microbiológica convencional y/o específica.

3.6. Manejo de residuos.

3.6.1. Es completamente responsabilidad del laboratorio cumplir con las normas de regulación

en la gestión de residuos de riesgo biológico y normas de identificación de residuos

peligrosos, restricciones de eliminación en tierra para protección del aire, agua y tierra,

reduciendo al mínimo y controlando todas las emisiones de las campanas de extracción y

las operaciones.

3.6.2. Las muestras, materiales de referencia y equipo si se sabe o sospecha de la presencia

de microorganismos viables pueden ser desinfectados antes de su eliminación o reúso.


64

Fecha Nombre del verificador (a):

Laboratorio ID / descripción del proyecto

Nombre de la muestra

Ultrafiltro empleado: [ ] Fresenius F250NR [ ] Rexeed- 25S

[ ] Baxter Exelra Plus 210 [ ] Otros-______________

Tiempo inicial de filtración

Tiempo de flujo medido Volumen en 30 s: Tasa de filtración

(mL/min)

Tiempo para filtrar

volumen deseado:

Fin de tiempo de filtración: Tiempo Total:

Muestra sin cloro? [ ] No [ ] SI,

Firma: Nombre: Fecha: Hora: Condición de la muestra:

Cedido o suministrado por: (Para uso de laboratorio únicamente)

Temperatura Actual:

Recibida por:

Recibido en hielo

Si / No

Cedido o suministrado por:

Preservado Si / No

Recibido por:

Sellos presentes

Si / No

Comentarios/Observaciones: Favor de enviar muestras en hielo para mantener en condiciones de refrigeración durante toda la noche.

Contenedor intacto

Si / No

Preservado en el Lab

Si / No

Figura 3. Hoja de datos de colecta de la muestra para Ultrafiltración.


65

ANEXO II.

MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y EQUIPO DE LABORATORIO

REQUERIDO PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.

1. EQUIPO.

1.1. Autoclave. 1.2. Balanza granataria con capacidad de 2 Kg y sensibilidad de 0.1 g. 1.3. Baño de agua a 42 ± 1 °C con termómetro. 1.4. Cámara fotográfica. 1.5. Cámara horizontal para electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa 1.6. Congelador (-20°C) 1.7. Documentador de geles con Transiluminador UV. 1.8. Equipo de filtración por membrana. 1.9. Fuente de poder para cámara de electroforesis. 1.10. Incinerador para agujas y asas de siembra. 1.11. Incubadora de 35 ±2ºC con termómetro. 1.12. Microcentrifuga. 1.13. Motor de licuadora u homogeneizador peristáltico. 1.14. Placa de calentamiento. 1.15. Potenciómetro. 1.16. Termobloque. 1.17. Termociclador. 1.18. Termómetro de máximas.

Todos los equipos e instrumentos deberán contar con mantenimiento, calificación y/o calibración de

equipos según aplique, en cumplimiento con las Buenas Prácticas de Laboratorio.

2. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS, MATERIALES E INSUMOS. 2.1. 10X PCR buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2). 2.2. 10X TBE (0.9 M Tris-borato, 0.02 M EDTA, pH 8.3). 2.3. Aceite mineral ligero. 2.4. Agar modificado con Celobiosa, Polimixina B y Colistina (mCPC). 2.5. Agar sangre. 2.6. Agar soya tripticasa. 2.7. Agar T1N1 (Agar triptona y sal). 2.8. Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS). 2.9. Agarosa (grado electroforesis ácido nucleico). 2.10. Agua estéril desionizada. 2.11. Agua peptonada alcalina (APA). 2.12. AKI Medio.


66

2.13. Antisuero polivalente V.cholerae Hikojima, Inaba, Ogawa. 2.14. Antisuero Vibrio cholerae Inaba. 2.15. Antisuero Vibrio cholerae O139. 2.16. Antisuero Vibrio cholerae Ogawa. 2.17. Arginina glucosa inclinado (AGS). 2.18. Asas bacteriológicas de 3 a 5 mm de diámetro con porta asa. 2.19. Botellas con capacidad de 500 mL. 2.20. Botellas de dilución de vidrio de borosilicato. 2.21. Buffer de carga de muestra 6X. 2.22. Cajas Petri desechables estériles 15 x 150 mm. 2.23. Caldo casamino ácidos, extracto de levadura sal (CA-YE) (Gorbach). 2.24. Caldo triptona y caldos triptona sal T1N0, T1N1, T1N3, T1N6, T1N8 y T1N10 2.25. Desoxicolato de sodio al 0.5 % en agua destilada estéril. 2.26. Discos de Polimixina –B 2.27. Espátulas, cuchillos desconchadores, tijeras, cucharas y/o cuchillos estériles. 2.28. Filtros de membrana de 0.45 µm de poro y 47 mm de diámetro. 2.29. Guantes de látex estériles. 2.30. Kit PCR assay, para Vibrio cholerae, parahaemolitycus, vulnificus. 2.31. Kit VET-RPLA, Oxoid. 2.32. Marcadores de peso moleculares DNA. 2.33. Medios de Cultivo y Reactivos (Anexo I). 2.34. Micropipeta calibradas a volúmenes adecuados (0.5-20 µL, 20-200 µL). 2.35. Palillos de madera estériles. 2.36. Pinzas para membranas. 2.37. Pipetas serológicas de 1 mL estériles. 2.38. Pipetas serológicas de 10 mL estériles. 2.39. Pipetas serológicas de 2 mL estériles. 2.40. Placas con 96 pozos con fondo plano estériles con tapa. 2.41. Placas de 96 pozos con fondo en “V”. 2.42. Primers Oligo para toxina cholera PCR, 10 pmol/µL soluciones stock (5'-

TGAAATAAAGCAGTCAGGTG-3', 5'-GGTATTCTGCACACAAATCAG-3'). 2.43. Puntas para micropipeta. 2.44. Reactivo de oxidasa. 2.45. Solución bromuro de etidio, 10 mg/mL. 2.46. Solución salina fisiológica al 0.85% (estéril). 2.47. Taq ADN polimerasa (Disponible comercialmente) ó Amplitaq® 2'-Deoxinucleosido-5'-

trifosfatos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); solución stock 1.25 mM de cada dNTP. 2.48. Tubos con tapa de rosca de baquelita de 13 x 100 mm. 2.49. Tubos con tapa de rosca de baquelita de 16 x 150 mm.


67

ANEXO III.

REACTIVOS, FORMULACIÓN Y CONDICIONES DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, PARA EL

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V. cholerae3,23.

Agua Peptonada Alcalina (APA).

FÓRMULA.

Peptona. 10 g

Cloruro de Sodio 10 g

Agua destilada 1000mL

Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8.5± 0.2. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121°C.

Agua Peptonada Alcalina 2X APA.

Peptona 10.0 g

Cloruro de sodio (NaCl)

10.0 g

Agua destilada

500 mL

Preparación: Mezclar 10g de peptona y 10g de NaCl en un frasco de 1L. Adicione 500mL de agua destilada y mezcle hasta disolver. Ajuste pH a 8.5 usando NaOH. Esterilice en autoclave a 121°C/15psi/20minutos. Almacene en refrigeración a 4°C.

Agua Peptonada Alcalina 10X (APA).

FÓRMULA.

Peptona. 100 g


Agua destilada 1000 mL

Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8.5± 0.2. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C.


68

Agar Tiosulfato, Citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS).

FÓRMULA.

Extracto de levadura 5 g

Proteosa peptona 10 g

Sacarosa 20 g

Tiosulfato de sodio.5H2O 10 g

Citrato de sodio.2H2O 10 g

Colato de sodio (sales biliares) 3 g

Bilis de buey (Oxgall) 5 g

Cloruro de sodio 10 g

Citrato férrico 1 g

Azul de bromotimol 0.04 g

Azul de timol 0.04 g

Agar 15 g

Agua destilada 1 000 mL

Preparar en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen requerido de medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 50°C y colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45°C antes de usar. pH, ver las instrucciones del fabricante.

Agar T1N1 (Agar Triptona y Sal).

FÓRMULA.

Triptona o tripticasa 10 g


Agar 20 g


Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C. Deje solidificar los tubos inclinados, para placas enfríe el medio de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles.


69

Agar Gelatina.

FÓRMULA.

Peptona 4 g


Gelatina 15 g

Agar 15 g


Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7.2 ± 0.2. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C. Enfríe de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles.

Agar Gelatina con Sal

Preparar agar gelatina, pero adicionando 30 g de NaCl/L. Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7.2 ± 0.2. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121°C. Enfríe de 45-50°C, y coloque en cajas Petri. Si es necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp tal como V. alginolyticus, use de 25-30 g de agar /L.

Medio base de descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina).

FÓRMULA BASE.

Peptona 5 g


Dextrosa (D-glucosa) 1 g

Púrpura de Bromocresol 0.02 g


Para caldo de arginina, lisina y ornitina, adicione 5 g de L-aminoácido a 1 L de base. Como control, use base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio spp halofílicos, adicionar 15 g NaCl / L. Ajuste el pH de tal manera que después de la esterilización sea de 6.5 ± 0.2. Distribuya en tubos y esterilice en autoclave 10 minutos a 121°C.

Caldo Triptona y Caldos Triptona Sal T1N0, T1N1, T1N3 y T1N6, T1N8 y T1N10

FÓRMULA.

Triptona o Tripticasa 10 g

Cloruro de Sodio 0,10,30,60,80, o 100 g


Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue NaCl, para T1N1 use 10 g de NaCl (1% w/v concentración de cloruro de sodio); así respectivamente. Para T1N3 usar 30 g de NaCl por litro (3% p/v concentración de cloruro de sodio) Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 150 mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Ajuste el pH a 7.2 ± 0.2.


70

Caldo Soya Tripticasa (CST).

FÓRMULA.

Peptona de Tripticasa (Triptona) 17 g

Peptona de fitona (Soytona) 3 g


Fosfato dipotásico 2.5 g

Dextrosa 2.5 g


Suspenda los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolución. Distribuya 225 mL en matraces de 500 mL o tubos. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121°C. El pH final debe ser de 7.2 ± 0.2.

Agar Soya Tripticasa (AST).

FÓRMULA.

Peptona tripticasa (Triptona) 15 g

Peptona de fitona (Soytona) 5 g


Agar 15 g


Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva durante un minuto hasta disolución del agar. Para Vibrio spp halofílicos, agregar 15 g de NaCl. Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfriar de 45-50°C y distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7.3 ± 0.2.


71

Agar de Hierro Kligler (KIA).

FÓRMULA.

Peptona polipeptona 20 g

Lactosa 20 g

Dextrosa 1 g


Citrato férrico amoniacal 0.5 g

Tiosulfato de sodio 0.5 g

Rojo de fenol 0.025 g

Agar 15.0 g


Suspender los ingredientes y hervir hasta disolución del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Dejar solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de 7.4 ± 0.2.

Agar Arginina Glucosa Inclinado.

FÓRMULA.

Peptona 5 g


Tristona 10 g


Glucosa 1 g

L-Arginina. (hidrocloruro) 5 g

Citrato férrico amónico 0.5 g

Tiosulfato de Sodio 0.3 g

Púrpura de Bromocresol 0.2 g

Agar 13.5 g


Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolución del agar, y distribuir en cantidades de 5 mL a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6.8 a 7.0. Esterilizar en autoclave de 10 a 12 minutos a 121°C y deje solidificar el medio inclinado.


72

Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI).

FÓRMULA.

Polipeptona 20 g


Lactosa 10 g

Sacarosa 10 g

Glucosa 1 g

Sulfato ferroso amónico 0.2 g

Tiosulfato de Sodio 0.2 g

Rojo de fenol 0.025 g

Agar 13 g


Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente hasta completa disolución, enfriar a 60°C y ajuste el pH de 7.3 ± 0.1.

Agar de Hierro y Lisina (LIA).

FÓRMULA.

Peptona o gelisato 5.0 g

Extracto de levadura 3.0 g

Glucosa 1.0 g

L-Lisina 10.0 g

Citrato férrico amónico 0.5 g

Tiosulfato de sodio 0.04 g

Púrpura de bromocresol 0.02 g

Agar 15.0 g

Agua destilada 1 000 g

Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121°C. Enfriar de 50-60°C y ajustar el pH de 6.7 ± 0.1. Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfrían en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.


73

Solución salina reguladora de fosfatos.

FÓRMULA.

NaCl 7.65 g

Na2HPO4 0.724 g

KH2PO4 0.21 g


Disolver todos los ingredientes en agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 con NaOH y esterilice en autoclave a 121°C/15 min.

Medio AKI.

FÓRMULA.

Peptona 15 g


NaCl 5 g


NaHCO3 al 10% esterilizado por filtración 30 mL

Disuelva la peptona, extracto de levadura y NaCl en agua destilada. Esterilice durante 15 minutos a 121°C enfrié y adicione 30 mL de NaHCO3 recién preparado y filtrado y mezcle pH Final, 7.4. Deposite en condiciones asépticas en tubos con tapón de rosca (15 mL de 16 x 125 mm).

Caldo Rojo de Metilo y Vogues Proskauer (RM-VP).

FÓRMULA.

Peptona 7 g

Glucosa 5 g

Fosfato dipotásico 5 g


Disolver los ingredientes en 800 mL de agua tibia. Para Vibrio spp halofílicos, agregar 15 g más de NaCl (concentración final del 2%). Filtrar, enfriar a 20°C y diluir a 1 L. Distribuya en tubos. Esterilizar en autoclaves durante 12 - 15 minutos a 121°C. Ajustar el pH de 6.9 ± 0,2.


74

Medio para prueba de movilidad (Semisólida).

FÓRMULA.

Peptona 10 g

Extracto de carne 3 g


Agar 4 g


Calentar con agitación y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolución del agar. Para Vibrio spp halofílicos agregar 15 g más de NaCl (para una concentración final del 2%). Distribuir en tubos con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121°C. Ajustar el pH de 7.4 ± 0,2.

Soluciones y reactivos.

Prueba de Rojo de Metilo.

Reactivo. Fórmula.

Rojo de metilo 0.1 g

Alcohol etílico 300 mL


Disolver el Rojo de Metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 gotas de la solución a 5 mL del cultivo problema. Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4.5 y la prueba es (+). Un color amarillo se reporta como prueba negativa.

Prueba de Vogues-Proskauer.

Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.

Reactivo. Fórmula.

Alfa Naftol 5 g

Alcohol Etílico absoluto 100 mL

Añadir 0.6 mL de la solución de Alfa Naftol y 0.2 mL de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 mL de cultivo. Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción positiva.


75

Prueba de Oxidasa.

Reactivo

FÓRMULA.

N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 1.0 g


Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 7 d. Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 h a 35°C. Agregar 0.3 mL de reactivo. Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto.

Agar modificado de celobiosa, Polimixina, B- colistina (mCPC).

SOLUCIÓN 1.

FÓRMULA.

Peptona 10 g

Extracto de carne 5 g


Solución Stock de colorante 1 000 1 mL

Agar 15 g


Ajustar el pH a 7,6. Hierva hasta que se disuelva el agar. Esterilizar por autoclave 15 minutos a 121°C. Enfríe de 48-55°C.

Nota: Este medio debe ser almacenado por 2 semanas en refrigeración.

SOLUCIÓN STOCK DE COLORANTES 1 000 X:

FÓRMULA.

Azul de Bromotimol 4 g

Rojo de cresol 4 g

Etanol al 95% 100 mL

Para obtener un color firme del medio usar una solución colorante stock en lugar de estar pesando repetidamente los colores en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al 4% (p/v). Agregue 1 mL de esta solución a cada litro de agar mCPC, la cual tendrá al final 40 mg de Azul de Bromotimol y 40 mg de Rojo cresol / L.


76

SOLUCIÓN 2.

FÓRMULA.

Celobiosa 10 g

Colistina 400 000 Ul

Polimixina B 100 000 UI


Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua destilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterilice por filtración, agregue la solución 2 a la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri.

Solución Salina 0.85% en agua destilada.

NaCl 8.5g

Agua 1L

Disolver 8.5 g de NaCl en agua y esterilizar a 121°C/15min, y enfríe a temperatura ambiente.

Reactivo de desoxicolato de sodio (0.5%) para la prueba del hilo1 La prueba del hilo se utiliza para ayudar en la identificación de V. cholerae. FÓRMULA.

Desoxicolato de sodio 5 g

Agua destilada estéril 1000 mL

Añada el agua destilada estéril al desoxicolato de sodio y mezcle perfectamente, y guarde a temperatura ambiente esta puede ser útil hasta por 6 meses. Control de calidad: Antes de utilizar cada nuevo lote de desoxicolato de sodio, debe hacerse un control de calidad. • Use una cepa de V. cholerae O1 como un control positivo. • E. coli puede utilizarse como un control negativo.


77

ANEXOS IV. DIAGRAMA GENERAL PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V. cholerae A PARTIR DE MUESTRAS DE

ALIMENTOS.

Siembra en placa con medio TCBS e incubación de 18 a 24h/35 ± 2°C

Morfología colonial en medio TCBS muestra colonias

amarillas brillantes de 2 a 4 mm de

diámetro que pueden ser redondas, planas

lisas, con centro elevado,

seleccione 3 o más colonias.

Se preparan dos series de diluciones en APA (10-2, 10-3) y se incuba a 35 ± 2°C

durante 6 a 8 h y a 42°C por 6 a 8h

Inocule agar T1N1 o agar soya tripticasa con NaCl al 2%

Pruebas bioquímicas preliminares para detección:

Tinción de Gram: (-) bacilos cortos curvos

Prueba de Oxidasa: +

Prueba del hilo: +

KIA (agar hierro kligler): K/A, no gas, no H2S (cuña roja /extremo

amarillo)

TSI (agar hierro triple azúcar): A/A, no gas, no H2S (cuña

amarilla/extremo amarillo)

LIA (Agar hierro lisina): K/K, no gas, no H2S (cuña morada/extremo

morado)

Sistema bioquímica miniaturizadas API20E o Vitek 2

Salina control y antisuero O1

polivalente.

Identificación de serogrupo

aglutinación en lámina

(+)

(-)


Envíe el aislamiento a Laboratorio Nacional de

Referencia para confirmación y prueba de

toxinas

V. cholerae O139

(+)

(+)

Muestra de alimento: 25 g en 225 mL de APA

(10-1)

Mariscos: 50 g en 225 mL de APA (10-1)

Toxigenicidad (PCR y RPLA).

Salina control y antisuero

Inaba y Ogawa

(+)

Incubar 18h a 35 ± 2°C


78

En TCBS se observan colonias amarillas

brillantes de 2 a 4 mm de diámetro que

pueden ser redondas, planas


seleccione 3 o más colonias

Transferir 250mL del

homogeneizado a un

2do contenedor.

2 series.

Inocule agares no selectivos Agar T1N1 o agar soya

tripticasa al 2% NaCl (Agar soya triptona o tripticasa-

AST-, agar infusión de corazón -BHI-) y use el

crecimiento para serología y pruebas bioquímicas.




Prueba del hilo: +

KIA (agar hierro kligler): K/A, no gas, no H2S (cuña roja /extremo amarillo)

TSI (agar hierro triple azúcar): A/A, no gas, no H2S (cuña amarilla/extremo

amarillo)


morado)



polivalente.



(+) (-)


Envíe el aislamiento al Laboratorio

Nacional de Referencia para confirmación y

prueba de toxinas

V. cholerae O139 (+)

(+)

50g de muestra (dil 1:2) en 200mL

APA por duplicado o 100g muestra

(dil 1:2) en 400mL APA homogeneizar

2 min. Dilución 1:10

Toxigenicidad (PCR y RPLA)


Inaba y Ogawa

1 serie+ 1 frasco

1 serie+ 1 frasco

Incubar todas las diluciones

(10-1 a 10-6) a 35 ±2°C por

6-8h y por 24 h

Incubar todas las diluciones

(10-1 a 10-6) a 42°C±0.2°C por

6-8h o toda la noche Agar TCBS 35 ±2°C

toda la noche

(+)

ANEXO V.

DIAGRAMA GENERAL PARA EL AISLAMIENTO DE V. cholerae EN MOLUSCOS BIVALVOS.


79

Morfología colonial en medio

TCBS. Colonias amarillas brillantes de 2 a 4 mm de




Dividir la membrana en 2 y colocar una mitad de la membrana (utilice guantes de látex

estériles) en un tubo con 10 mL de APA y se incuba a 35±2°C por 18 a 24h y la mitad

a 42±0.2°C °C/18-24h. Posteriormente tomar de la parte superior del caldo y

sembrar por estría en agar TCBS. Incubar a 35±2°C/ 18-24h (evite agitar y mezclar el

tubo antes de sembrar).








Prueba del hilo: +


amarillo)




morado)



polivalente.



(+)

(-)


Envíe el aislamiento al Laboratorio Nacional de


toxinas

V. cholerae O139

(+)

(+)

Este procedimiento puede aplicarse a muestras de

agua para consumo humano para lo cual se filtran

3000 mL de la muestra de agua a través de un filtro

de membrana 0,45 μm.

Toxigenicidad (PCR y RPLA).


Inaba y Ogawa

(+)

ANEXO VI.

DIAGRAMA GENERAL PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V. cholerae A PARTIR DE AGUA Y HIELO PARA

CONSUMO HUMANO.


80

ANEXO VII.

DIAGRAMA GENERAL DE ANÁLISIS DE HISOPO DE MOORE PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V.

cholerae A PARTIR DE AGUAS RESIDUALES.

Directo las muestras se siembran en placa en medio TCBS se incuban

a 35°C±2 por 18 a 24h

Morfología colonial en medio TCBS muestra colonias

amarillas brillantes de 2 a 4 mm de




Introducir hisopo de Moore en 300-500mL de medio de Enriquecimiento APA 6-8 h,

35°±2°C. Si al cabo de 6 a 8 h de incubación el (APA) no se puede sembrar por

estría, se resiembra a las 18 h en otro recipiente con APA, se incuba durante 6 a 8 h

y se siembra en TCBS por estría.








Prueba del hilo: +


amarillo)




morado)



polivalente.



(+)

(-) Salina control y antisuero O139



toxinas

V. cholerae O139

(+)

(+)

Colocación del hisopo de Moore en sitio de

análisis durante 24-48h



Inaba y Ogawa

(+)


81

Morfología colonial en medio TCBS. Colonias amarillas brillantes de 2 a 4 mm de




La gasa se coloca en un matraz o frasco con 100 mL de APA 10x y se agrega suficiente

agua de la fuente para obtener un volumen final de 1L, registrar el sitio de toma de la

muestra, fecha, hora y responsable, se traslada al laboratorio a temperatura ambiente y

enseguida se procede a incubar a 35±2°C/6 a 8h (Afloje tapas de frasco ) y se siembra

en agar TCBS a 35±2°C °C/18 a 24h, mientras que se re incuba el frasco con APA por

18h mas a 35±2°C y se siembra nuevamente en TCBS e incuba a 35±2°C /18 a 24h








Prueba del hilo: +


amarillo)




morado)



polivalente.



(+)

(-)




toxinas

V. cholerae O139 (+)

(+)

Hisopo de Spira en sitio de análisis este comienza

por verter por la boca del frasco el agua que se va a

muestrear y se deja escurrir por el fondo,

posteriormente la gasa se retira bajo condiciones

asépticas del frasco Spira.



Inaba y Ogawa

(+)

ANEXO VIII.

DIAGRAMA GENERAL DEL USO DE HISOPO DE SPIRA PARA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE V. cholerae A PARTIR

AGUAS AMBIENTALES.

Manual de Técnicas y procedimientos para la detección de Vibrio ...

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