Marcadores e Genômica

Engenheiro AgrônomoMestrando em Agronomia - Genética e Melhoramento de

Plantas

Thiago Martins Pinheiro

thiago_mpinheiro@yahoo.com.br

Marcadores moleculares

Homozigotos e heterozigotos não são diferenciados

Indivíduos homozigotos e heterozigotos são diferenciados

Marcadores moleculares

Importância• Melhoramento

– Marcadores moleculares ligados a diferentes características de importância econômica tem sido desenvolvidos, permitindo a seleção indireta de características desejáveis em gerações precoces, reduzindo tempo, fontes e energia necessários.

• Estudos genéticos– São ferramentas úteis para detectar variações

no genoma, o que aumenta o poder de análise genética das plantas.

Importância• Estudos de caracterização de populações• Avaliação de germoplasma e populações de

melhoramento: – Variabilidade– Diversidade genética– Classificação– Distância genética– Filogenia;

• Construção de coleções nucleares;

Importância• Estrutura de populações

– Fluxo de genes– Sistema de cruzamento– O tamanho efetivo

• Evolução• Construção de mapas genéticos;• Mapeamento de QTLs•Seleção assistida

Tipos de marcadores

• Marcadores isoenzimáticos• Marcadores RFLP• Marcadores baseados em PCR

– Marcadores RAPD– Marcadores microssatélites– Marcadores AFLP– Marcadores SNPs

Marcadores isoenzimáticos

• Termo introduzido por Market & Moller (1959)• Designa formas moleculares múltiplas de

enzimas que ocorrem em um mesmo organismo e membros da mesma espécie

• Detecção, isolamento, e distinção: métodos bioquímicos = cromatografia, filtração gélica, eletroforese, etc.

• Controle genético: monogenético, co-dominante = híbridos

Marcadores isoenzimáticos• Aplicações:

– Caracterização da variabilidade genética de populações naturais e espécies cultivadas;

– Estudos de evolução e dispersão de espécies e análises filogenéticas;

– Identificação de ligação gênica entre isoenzimas e caracteres de herança simples e complexa

– Identificação de acessos e cultivares;– Seleção indireta de caracteres de interesse

agronômico;– Aumento na resolução de mapas de ligação

Marcadores isoenzimáticos

• Vantagens– Herança mendeliana simples– Co-dominância– Técnica barata– Operacionalmente acessível– Determinação genotípica dos locos em qualquer

parte da planta– Análise simultânea de vários locos isoenzimáticos– Não-detecção de efeitos deletérios, epistáticos

ou pleinotrópicos

Marcadores isoenzimáticos

• Desvantagens– Cobertura reduzida do genoma (nº de locos

detectáveis)– Baixo nível de polimorfismo por loco– Especificidade de algumas isoenzimas em certas

partes da planta– Expressão de certas enzimas é influenciada pelo

ambiente e estádio de desenvolvimento da planta– Complexidade de alguns zimogramas

Marcadores RFLP

• Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism)

• Enzimas de restrição “tesouras” moleculares• Criação/eliminação de sítios de restrição

substituição ou modificação de par de bases, deleções, inserções, inversões ou translocações

Marcadores RFLP• Detecção

– Extração e purificação do DNA– Tratamento com enzimas de restrição– Separação por eletroforese em gel de agarose– Transferência para suporte sólido (membrana de

náilon ou nitrocelulose)– Fixação por alta temperatura ou luz UV– Hibridização com sonda radioativa ou

quimioluminescência– Autoradiografia (Raio X)

Marcadores RFLP• Vantagens

– Co-dominância– Não afetados por pleiotropia, epistasia ou

variações ambientais– DNA extraído de qualquer parte do organismo– Não depende do estádio de desenvolvimento do

organismo– Resultados altamente estáveis e reproduzíveis– Ampla cobertura do genoma– Disponibilidade de diversas enzimas de restrição

Marcadores RFLP

• Desvantagens– Desenvolvimento de marcadores RFLP é

caro e trabalhoso– Não permite automatização– Inexistência de biblioteca de sondas para

espécies “menos importantes”

O marcador RFLP usa a técnica do SOUTHERN BLOTTING

Marcadores SNPs

Vantagens• Alta densidade no genoma• Estáveis do ponto de vista

evolucionário• Genotipagem dos SNPs não

se baseia na medida de comprimento dos alelos

• Distinção dos alelos pode ser automatizada

• Taxa de mutação relativamente baixa

Desvantagens• Alto custo de

desenvolvimento e genotipagem

Marcadores RAPD

• DNA polimorfico amplificado ao acaso (Random amplified polymorphic DNA)

• Primer curto (10 nucleotídeos), de sequência arbitrária

• Amplificações de fragmentos de DNA ao acaso• Detecção normalmente feita em gel de

agarose corado com brometo de etídio, visualizado sob luz ultravioleta

Marcadores RAPD• Vantagens

– Técnica simples, fácil e rápida de se obter resultados– Custo relativamente reduzido– Aplicável em qualquer organismo– Não emprega radioatividade– Não necessita mão-de-obra altamente especializada– Não exige sequenciamento de nucleotídeos nem

desenho de primers específicos– Necessidade mínima de DNA necessária

Marcadores RAPD• Desvantagens

– Baixo conteúdo de informação genética em cada loco (dominância)

– Baixa reprodutibilidade dos resultados (bastante sensível a pequenas modificações

– Requer certa experiência com procedimentos moleculares: preparo de soluções-estoque e componentes da reação; manipulação cuidadosa de micropipetas, reagentes e enzimas; programação de termocicladores; etc

Marcadores microssatélites - SSR• Sequência Simples Repetida (Simple Sequence Repeat)• 1 a 6 nucleotídeos repetidos em tandem (AACT

AACTAACTAACTAACTAACT) • Repetições

– Perfeitas não são interrompidas– Imperfeitas interrompidas por bases não

repetidas– Compostas duas ou mais repetições estão

dispostas adjacentes– Simples Apenas uma repetição

Marcadores microssatélites - SSR• Os produtos amplificados são observados em gel de

poliacrilamida desnaturante ou não-desnaturante, ou em gel de agarose de alta resolução, corados com brometo de etídio ou nitrato de prata

• Cada microssatélite constitui um loco genético altamente variável, multialélico e de grande conteúdo informativo

• Natureza altamente informativa + especificidade + rapidez = eficiente ferramenta para estudos de genes eucarióticos

• Microssatélites desenvolvidos para uma espécie podem ser utilizados com sucesso em outras espécies

Marcadores microssatélites - SSR• Uso

– Mapeamento genômico– Mapeamento comparativo– Estudos de ligação– Identificação de genótipos– Proteção de variedades– Avaliação de pureza de sementes– Utilização e conservação de germoplasma– Estudos de diversidade– Análise gênica e de QTLs– Análise de pedigree– Seleção assistida por marcadores– Análise de bibliotecas para clonagem de genes

Marcadores microssatélites - SSRVantagens

• Uso fácil e eficiente

Desvantagens• Necessidade de serem

isolados e desenvolvidos especificamente para cada espécie, não sendo possível desenho de “primers universais”

• Desenvolvimento processo demorado, trabalhoso e com alto custo

Exemplo de Microssatélites

Marcadores AFLP

• Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados (Amplified Fragment Lenght Polymorphism)

• Amplificação do DNA via PCR para detectar diferenças em um conjunto de fragmentos selecionados e digeridos com enzima de restrição

• Crucial utilização de DNA genômico altamente puro garantir completa digestão

Marcadores AFLP

• Utiliza duas enzimas de restrição, uma de corte raro e outra de corte frequente

• Os produtos da amplificação são separados em gel de poliacrilamida desnaturante (alto nível de resolução). Polimorfismo detectado por presença ou ausência de bandas

• Revelação feita com radioatividade, visualização por auto-radiografia; nitrato de prata ou fluorescência

Marcadores AFLP• Uso:– Mapas de ligação– Clonagem de genes– Acessar diferenças genéticas entre indivíduos,

populações e espécies– Estudos filogenéticos– Discriminação de variedades– Registro de variedades (testes de distinção,

homogeneidade e estabilidade)– Monitoramento da herança de características

agronômicas

• Uso– Diagnóstico de doenças– Análise de pedigree– Análise de diversidade genética– Análise de marcadores ligados a características

de interesse– Análise de erosão genética causada por

melhoramento– Estimativa de taxas de fecundação cruzada em

populações melhoradas

Marcadores AFLP

Marcadores AFLP• Vantagens

– Capacidade de analisar várias regiões diferentes do genoma

– Capacidade de analisar grande número de locos polimórficos simultaneamente

– Alta reprodutibilidade e robustez– Número de marcas geradas virtualmente

ilimitado– Alto valor informativo– Herança mendeliana

Marcadores AFLP

• Desvantagens– Nível de polimorfismo detectado é menor

quando comparado com outros marcadores

– Dificuldade de identificar variantes alélicos em um loco específico

Marcadores SNPs• Polimorfismo em único nucleotídeo (Single

Nucleotide Polymorphism)• Detectam polimorfismos de uma única base no

genoma• Deve ocorrer em pelo menos 1% da população para

ser considerada SNP• 90% do polimorfismo no genoma humano são SNPs• Sequenciamento em larga escala de espécies

vegetais tem permitido evidenciar presença de SNPs (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Glycine max, Cucumis melo, Zea mays, etc)

Marcadores SNPs• Natureza bi-alélica e abundantes no genoma• Estimativas

– Genoma humano: 1 SNP : 1000 bases ou menos– Milho: 1 SNP : 70 bases

• Visualização (técnicas): – Cromatografia líquida de alta pressão

desnaturante (DHPLC)– Polimorfismo conformacional fita única (SSCP)– Outros métodos de clivagem química ou

enzimática

Marcadores SNPs

• Indispensável validação experimental dos dados obtidos para se conhecer o potencial informativo de cada polimorfismo

• Métodos de validação e genotipagem disponíveis atualmente– Microarranjos– Cromatografia líquida de alta pressão

desnaturante (DHPLC)– Espectrometria de massa

Marcadores SNPs

– Ensaios com extensão de primers– PCR em tempo real– Minissequenciamento– Sequenciamento de única base– Digestão por enzimas de restrição (RFLP)

Marcadores SNPs• Uso:

– Mapas de resolução 100x maior que os existentes– Melhoramento assistido por marcadores

moleculares– Construção e integração de mapas genéticos e

físicos– Estudos de genética de populações– Estudos de filogenias

Marcadores SNPs

– Análise de genes– Descobertas da base genética molecular de

importantes características vegetais– Associação entre doses de alelos e expressão

fenotípica (poliploides)– Identificação de variedades

Características RFLP RAPD SSR AFLP

Ação gênica Co-dominante Dominante Co-dominante Dominante

Número de alelos/loco Multi-alélico 2 Multi-alélico 2

Disponibilidade de marcadores no

genomaIlimitada Ilimitada Ilimitada Ilimitada

Nível de polimorfismo Alto Alto Muito alto Muito alto

Necessidade de procedimentos

prévios

Construção bibliotecas

genômicas ou cDNAs

Não há Desenho de primers Não há

Concentração de DNA 10 mg 25 ng 50 ng 500 ng

Marcação radioativa Sim / não Não Não Sim / não

Reprodutibilidade Alta Média Alta Média

Investimento Alto Médio Alto Médio

Genômica• Genoma: Conjunto completo de cromossomos de uma espécie • Genômica: É o estudo da estrutura e função dos genomas inteiros• Genômica estrutural e funcional• Genômica estrutural: Estuda a estrutura dos genomas inteiros através do sequenciamento do DNA dos mesmos• Genômica funcional: Estuda a função das sequências obtidas na genômica estrutural

Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 10 de Junho de 2009 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome)

Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 24 de Novembro de 2009 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome)

Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 21 de Abril de 2010 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome)

Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 3 de Maio de 2010 Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome

Genômica: Exemplos de plantas sequenciadas

• O genoma da primeira planta a ser totalmente seqüenciado foi a da Arabidopsis thaliana em 2001. • Em seguida foi sequenciado o do Arroz (Oryza sativa) em 2002.• O Brasil vem se destacando nessa área e participou do sequenciamento de: A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum), o eucalipto (Eucalyptus ssp), o Café (Coffea ssp), o milho e a banana (único ainda em andamento).

Exemplos de alguns microrganismos fitopatogênicos sequenciados

•Xylella fastidiosa (Amarelinho dos citros),

•Xanthomonas campestris (cancro cítrico),

•Magnaphorte oryzae (brusone)

Xylella fastidiosa

Xanthomonas campestris

Magnaphorte oryzae

Exemplos de algumas espécies vegetais sequenciadas

• Eucalipto (Eucalyptus globulus subsp. globulus)

• Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum)

• Café (Coffea arabica)

• Milho (Zea mays)

Genômica no Brasil

• 1998: criação de uma rede de laboratórios para sequenciamento: rede ONSA• Instituto virtual.• Criado e financiado pela FAPESP

Estudos de genômica comparativa ou sintenia

• Uma análise comparativa entre monocotiledôneas mostrou que o genoma do cloroplasto da cana de açúcar é muito semelhante ao do milho mas não ao do arroz e do trigo.

Fonte: Zimmer et al. (2003)

Bioinformática• Análise da informação biológica utilizando a ciência da computação.• Envolve desenvolvimento de bancos de dados on-line e de algoritmos (programas) para comparação de dados genéticos.• Genômica Estrutural e Funcional• Proteômica e Metabolômica• Construção de mapas genéticos e mapeamento de QTLs

Diferentes abordagens para o estudo da Biotecnologia em plantas e suas interrelações

Desafios...

• Produzir mais alimentos em menor área, com menos água e menos insumos• O desenvolvimento de uma agricultura sustentável é a chave para a diminuição da pobreza, segurança alimentar e proteção ambiental

Considerações finais

A aplicação criteriosa e segura da biotecnologia na agricultura, juntamente com a utilização racional dos recursos genéticos, podem aumentar a lucratividade dos agricultores, produzir melhores alimentos, e menor dependência de agroquímicos.

thiago_mpinheiro@yahoo.com.br