EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL “Rosmarinus officinalis” SOBRE EL “Streptococcus Viridans, Actinomyces sp. y Lactobacillus spp.”

Tacca Q. Janet E.1

Macedo V. Sonia.2

Aquino A. Luz M.3

La cavidad bucal esta colonizada por más de 400 especies de bacterias aerobias y anaerobias,

estas bacterias habitan en los dientes, surco gingival, las mucosas, el dorso de la lengua y la

saliva; y también pueden actuar como patógenos involucrados en las principales afecciones de

la cavidad bucal.1

La placa bacteriana dental es una biopelícula formada por microorganismos adheridos entre sí

y a una superficie dentaria, embebidos entrelazados y rodeados de un material extracelular de

triple origen: bacteriano, saliva y dieta.2, 3

Los principales microorganismos relacionados con la caries dental son aquellos que participan

en el desarrollo inicial de la enfermedad s.mutans, s. sobrinus (streptococcus viridans) y el la

progresión de las lesiones producidas lactobacilos spp, actinomices spp. Los lactobacillus son

los primeros relacionados con la caries de dentina.4

Se ha determinado que la placa bacteriana es el factor fundamental en la presencia de caries y

enfermedad periodontal.4, 2, 5

Por eso la importancia de su control. La eliminación mecánica de la placa es todavía la técnica

básica para evitar las enfermedades dentarias y conservar la salud bucal (el cepillado).5, 6

Sin embargo una mejor comprensión de la naturaleza infectante de los padecimientos dentales

revitaliza de modo notable el interés por los métodos químicos de control de placa (los

enjuagues o colutorios).7, 8

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1 Cirujano Dentista Graduada de la Universidad Nacional del Altiplano2Magister en Estomatología, Docente asociada de la Universidad Nacional del Altiplano3Estudiante de la Escuela profesional de Odontología de la Universidad Nacional del Altiplano

La clorhexidina es un antiséptico, catiónico potente no irritante, que rompe la membrana de la

célula bacteriana.7, 9 Es relativamente más activa contra bacteria gram positivas.7 Antiséptico

más utilizado en la odontología, sobre todo para enjuagues bucales (0.12 – 0.2 %) o dentifricos

(0.5 – 1 %). Es uno de los agentes más eficaces contra la placa y la gingivitis.5, 7

Las plantas medicinales han acompañado la evolución del hombre, y forman parte del curar

ancestral. La OMS estima que más del 80% de todos los habitantes de la tierra confían en

medicinas tradicionales para resolver sus principales necesidades de salud. 10 El empleo de

plantas medicinales como tratamiento de diversos males, se registra desde tiempos muy

remotos, basándose en creencias populares y conocimientos tradicionales, trasmitidos de

generación en generación. Hoy en día muchas propiedades terapéuticas de diversas plantas

han sido demostradas científicamente, en base a la extracción de sus principios activos.11

El rosmarinus officinalis nombre científico del romero, es una planta tradicional usada de

diversas maneras para el cuidado de los dientes por pobladores rurales de Puno, sin embargo

no es bien conocido su mecanismo de acción. Los beneficios de la medicina tradicional son

mejores tanto en el aspecto terapéutico como económico.12, 13

Es considerada como un antioxidante y codimentaria el extracto de desaromatizado se vente

como antioxidantes naturales y el aceite esencial se usa como saborizante para licores.14

El aceite esencial de rosmarinus officinalis se emplea por sus propiedades estimulantes,

presumiblemente debido a su alto contenido de alcanfor, mientras que, en las industrias

cosmeticas, farmaceuticas y de alimentos, se utiliza como fragancia en sopas, cremas, lociones

y perfumes, así mismo como preservante de alimentos por sus propiedades antioxidantes.15

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio fue de tipo experimental “in vitro” con 2 grupos de control; un control positivo

representado por los discos de papel filtro con antibacteriano (clorhexidina) y un grupo control

negativo representado por discos de papel filtro con agua destilada estéril; y un grupo

experimental representado por discos de papel filtro con aceite esencial de Rosmarinus

Officinalis.

La muestra corresponde al cultivos de colonias de Streptococcus viridans, Actinomyces sp,

Lactobacillus spp. El método utilizado fue la observación estructurada y se utilizó una ficha de

recolección de datos diseñada para la investigación.

La investigación consistió en el análisis de una base de datos recolectada. La obtención del

aceite esencial del Rosamarinus officinalis, se efectuó con el método por arrastre de vapor de

agua. La toma de muestras de placa bacteriana para aislar Streptococcus viridans y

Lactobacillus spp fue la placa bacteriana supragingival de lasa superficies vestibular y lingual o

palatina de los dientes; y del Actinomyces sp fue de placa bacteriana de las superficies oclusal

y proximales de los dientes.

Se realizó una prueba piloto, para verificar si el instrumento valida la metodología, donde

tuvimos algunos cambios, que fueron reportados a su debido tiempo.

Así fue donde se determinó que se trabajaría con 5ul de aceite esencial y la misma cantidad de

Clorhexidina al 2%.

Para realizar las pruebas de sensibilidad in vitro en dos grupos de estudio, fue necesario

emplear un inoculo reconstituido, con asa bacteriológica 3 colonias bacterianas fueron

transferidas a un tubo de ensayo con 5ml de agua destilada estéril en la que se cuidó que el

inoculo bacteriano este suspendido uniformemente.

Bajo condiciones estériles se procedió a sembrar con un hisopo la suspensión bacteriana en 3

placas que contienen agar sangre, contienen agar BHI y agar tomate para el S. viridans,

Actinomyces sp y Lactobacillus spp respectivamente.

Con pinzas estériles se procedió a coloca en cada placa de manera equidistante 1 disco

embebido con 5 ul de clorhexidina al 2%, 1 disco de papel embebido con 5 ul de agua destilada

y 1 disco de papel embebido con 5 ul de aceite esencial de Rosmarinus officinalis.

Las tres placas fueron llevadas a la incubadora a 37ºC por un periodo de 48 horas (S. viridans.

Y Lactobacillus spp) y las de Actinomyces sp fueron colocadas en una jarra de anaerobiosis,

bajo microaerofilia. La jarra de anaerobios fue llevada a la incubadora a 37ºC por un periodo

de 72 horas. Después de las cuales se procedió a medir el diámetro de los halos de inhibición,

con la ayuda de calibrador.

Se emplearon un análisis Estadístico descriptivo para obtener los promedios y desviaciones

estándar de las variables continuas. Se aplicó la prueba T – students entre el grupo en estudio

(aceite esencial de Rosmarinus officilis) y el grupo control positivo (digluconato de

clorhexidina). Para establecer si hay diferencias en los diámetros de los halos de inhibición por

bacteria respecto al uso de la clorhexidina y el aceite esencial, se utilizó la prueba de ANOVA.

Esta prueba estadística permitió evaluar el efecto de las variables independientes en relación a

una dependiente, y los efectos conjuntos de dos o más variables independientes y una

dependiente.

RESULTADOS

Al comparar los diámetros de los halos de inhibición formados por efecto del aceite esencial

del romero en la 3 cepas bacterianas estudiadas, se observó que los halos de inhibición de

mayor diámetro fueron formados sobre el Lactobacillus spp (11, 9, 10mm) con una media de

10mm mientras que los halos de inhibición de menor diámetro fueron formados sobre

Streptococcus viridans (8, 8, 9mm) con una media de 8.333mm. Aplicando la prueba de

ANOVA se obtuvo diferencia estadísticamente significativa del efecto antibacteriano del AE del

romero según especie bacteriana (p=0.012). Mientras que mediante la prueba de Kolmodorov-

Smirnov, se determinó que los diámetros de los halos de inhibición del romero (p=0.591),

tenían una distribución normal con un nivel de confianza del 95% (ver Tabla Nº 1 y gráfico Nº

1).

TABLA Nº 1

DIAMETRO DEL HALO INHIBITORIO DEL ACEITE ESENCIAL DEL ROMERO FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

GRÁFICO Nº 1

COMPARACION DE LOS DIAMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICION DEL ACEITE ESENCIAL DEL

ROMERO FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

Al comparar los diámetros de los halos de inhibición formados por efecto de control positivo

(clorhexidina 2%), en las 3 cepas bacterias estudiadas, se observó que los halos de inhibición

de mayor diámetro fueron formados sobre el Actinomices sp (20, 20, 19 mm) con una media

de 19.667, mientras que los halos de inhibición de menor diámetro fueron formados sobre el

Lactobacillus spp (12, 12, 13 mm) con una media de 12.333 mm. Aplicado la prueba ANOVA

se obtuvo diferencia estadísticamente significativa del efecto antibacteriano de la clorhexidina

2% según especie bacteriana (p=0.000), mientras que mediante la prueba de Koldorov-

Smirnov, se determinó los diámetros de los halos de inhibición de la clorhexidina al 2%

(p=0.888), tenían una distribución normas, con un nivel de confianza del 95%(ver Tabla Nº 2 y

gráfico Nº 2).

TABLA Nº 2

DIAMETRO DEL HALO INHIBITORIO DE LA CLORHEXIDINA 2% FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

GRÁFICO Nº 2

COMPARACION DE LOS DIAMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICION DE LA CLORHEXIDINA 2%

FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

Cuando se analizó los 3 ensayos con Streptococcus viridans, se obtuvo un valor p=0.015 que

corrobora la diferencia del promedio de los halos de inhibición del romero y la clorhexidina

2%. Del análisis de los 3 ensayos con Actinomyces sp la diferencia tuvo una significancia de

p=0.001, lo que corrobora también la diferencia del promedio de los halos de inhibición del

romero y la clorhexidina 2%. Al analizar los 3 ensayos con Lactobacillus spp, la diferencia tuvo

una significancia de p=0.118, lo que indica que estadísticamente no hay diferencia en el

promedio de los halos de inhibición del romero y la clorhexidina frente a este tipo bacteriano

(ver Tabla Nº 3 y gráfico Nº 3).

TABLA Nº 3

DIAMETRO DEL HALO INHIBITORIO DEL ACEITE ESENCIAL DEL ROMERO, CLORHEXIDINA 2% Y AGUA DESTILADA FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

GRÁFICO Nº 3

COMPARACION DE LOS DIAMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICION DEL ACEITE ESENCIAL DEL

ROMERO, CLORHEXIDINA 2% Y AGUA DESTILADA FRENTE AL: Streptococcus viridans,

Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

DISCUSIÓN

Los resultados demostraron que existen diferencias significativas respecto al diámetro de los

halos de inhibición formados ante la presencia de clorhexidina 2% y aceite esencial del romero

frente al Strepcoccus viridans y Atinomyces sp, mas no existe diferencia significativa en los

diámetros de los halos de inhibición formados en presencia de clorhexidina 2% y aceite

esencial del romero frente al Lactobacillus spp.

Para la investigación usamos como control negativo al agua destilada, lo cual no fue halo

inhibitorio en ninguno de las pruebas, manteniéndose como constante en 0 mm. Lo cual nos

sirve a manera de control de calidad, garantizando la siembra bacteriana y que la formación de

los halos de inhibición alrededor de los discos de la clorhexidina 2% y romero fueron formadas

por estas sustancias.

En esta investigación no se siguieron las pautas dadas por el NCCLS (National Committee for

Clinical Laboratory) las que fueron dadas para estandarizar el procedimiento de la realización

de antibiogramas mediante el método de disco difusión (Kirby-Bauer) y así determinar la

susceptibilidad antimicrobiana 16 , debido a la falta de materiales y presupuesto que implicaría,

sin embargo el método seguido que se asemeja y es válido por contar con un control positivo y

otro negativo, además de que nos ayudó a cumplir nuestro objetivo.

En esta investigación no se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI) porque para

que tenga un realce científico tuvo que seguirse el método de Kirby Bauer, además de no ser

este nuestro objetivo, pues este trabajo es el inicio para empezar un estudio más minucioso

acerca del efecto antibacteriano del aceite esencial del romero tiene o no efecto

antibacteriano frente a las bacterias de la placa bacteriana dental, pues no se contaba con

antecedentes de investigación que respondieran esta pregunta, este fue más un trabajo

exploratorio.

Con este trabajo podemos corrobora que el medio de cultivo más eficaz para el aislamiento de

Actinomyces sp es el agar BHI y para la formación de colonias debe ser incubado a 37º por 5

días en microaerofilia, para el aislamiento Lactobacillus spp no se tuvo problemas el agar

Tomate fue un medio de cultivo selectivo adecuado.

Segun Flores Q. y Col. 17 1mg/ml del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (romero) que

inhibió el crecimiento de la bacteria Staphylococcus áureos, no se pueden hacer

comparaciones entre este resultado y los de esta investigación pues trabajamos con distintos

especies y diferentes métodos.

Diaz L.18 determino que el diámetro del halo inhibitorio del aceite esencial del Minthostachys

mollis Griseb (muña) frente al Lactobacillus spp y Actinimyces sp, tuvieron una medida de

14.38mm y 11.00mm respectivamente. En esta investigación el diámetro de halo inhibitorio

del aceite esencial del romero frente al Lactobacillus spp y Actinomyces sp tuvieron una media

10.0mm y 9.333mm, resultados que se asemejan, las diferencias tal vez de deba a que se

trabajaron con aceites esenciales de diferentes plantas, además que la cantidad de aceite con

que se empaparon los discos de sensibilidad con 10ul de aceite esencial de muña, en esta

investigación los discos de sensibilidad empapamos con 5 ul de aceite esencial de romero.

Según los resultados en esta investigación el efecto antibacteriano del aceite esencial del

romero frente al Lactobacillus spp es estadísticamente igual al efecto antibacteriano de la

clorhexidina al 2% frente al lactobacillus spp, este se debería a que según Sanchez L. la

clorhexodina es estable a un PH entre 5 y 8, en medios ácidos pierde estabilidad, razón por la

que tal vez en esta investigación tubo menor efecto, ya que el medio de cultivo de agar tomate

tenía un pH aproximado de 3, entonces los aceites esenciales de las plantas podrían ser

eficaces en cuanto efecto antibacteriana en medios ácidos, medio en el que se desarrollan los

Lactobacillus spp.

CONCLUSIONES

El aceite esencial del Rosmarinus officinalis tiene efecto antibacteriano in vitro frente a

bacterias de la placa bacteriana: Streptococcus viridans, Actinomyces sp y Lactobacillus spp.

El aceite esencial del Rosmarinus officinalis es más efectivo frente al Lactobacillus spp y

menos efectivo frente al Streptococcus viridans.

El diglucinato de clorhexidina al 2% es más efectivo frente al Actinomyces sp y menos efectivo

frente al Lactobacillus spp.

La clorhexidina al 2% es más efectiva que el aceite esencial de Rosmarinus officinalis frente al

Streptococcus viridans y Actinomyces sp e igual de efectivo frente al Lactobacillus spp.

Nota: Dra. No le incluí la bibliografía porque tal vez tenga que modificar la INTRODUCCION, Y CAMBIARE LAS TABLAS Y LOS GRÁFICOS.