Mecanismos de retenciónLas dimensiones de la columna y el hard afectan : La vida útil, capacidad,...
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Cromatografía Líquida
Adsorción Partición Int. Iónico Exclusión
de tamaño
Mecanismos de retención
Sílica Alúmina
Permite gran carga de muestra
Menor poder catalítico de reacciones
Buena disponibilidad
Buena cantidad de referencias
Buena con isómeros de aromáticos
Levemente alcalina
Menos empleo que sílica
Líquido-
Sólido
Líquido-
Líquido
Grupos iónicos
fijos en F. Estac.
Retención de
acuerdo tamaño
Muy utilizada para: Clean-up y separación previa a CG,FTIR, etc.
Fases sólidas más utilizadas: Sílica-Gel, Alúmina, Sílica-Alúmina, Florisil.
Acidos Carboxílicos
Amidas
Sulfóxidos
Sulfonas
Alcoholes, Aminas
Aldehidos, cetonas y
esteres
Nitrocompuestos
Eteres
Sulfuros
HCs Aromáticos,
Halocompuestos
HCs Saturados k
-0,2
0
0,2
4
0,2
8
0,2
0,2
6
0,3
2 0,4
4
0,5
0,7
-0,2
5
0
0,2
6
0,3
2
0,4
0,4
2 0
,57
0,6
5
0,9
5
0,2
9
-0,3
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
F-a
lc
nC
5
Xil
Tol
Ben
c
HC
Cl3
H2C
Cl2
TH
F
Ace
t.N
itri
lo
Met
anol
Sílica
Alúmina
Permite separar compuestos de polaridad moderada e intermedia
Se emplean mezclas de dos o mas solventes con frecuencia para controlar FS
El contenido de H2O debe controlarse y la fase en equilibrio (activac. y conserv.)
Separaciones isocráticas (la fase demora en reequilibrarse después de cambio FM)
Fuerza del solvente (FS)
50 c
m
1 cm 1/3
Alú
min
a B
ási
ca
Bro
ckm
an
Gra
do 1
700 o
C, 2h
2/3
Síl
ica 7
0-2
30
400 o
C, 4h
MeOH 20 mL
F4
Polares
Cloroformo 20 mL
F3
Arom. 3 y + anillos
parte pol.
Eter 20 mL
F2
Arom. 1,2 anillos
parte 3 a.
nC6 20 ml
F1
HCs Sat
14 mL UV,CGEM
DCM
4 mL
Arom. Sup.
nC5:DCM(7:3)
4 mL
Arom.
Pentano
4mL
Pentano 4 mL
saturados
LV
LV
Al2
O3, 5 c
m (
1.1
5 g
)
Pipeta de Pasteur
Separación Clean-Up
Síl
ica 1
20
-230, 0.5
g
nC5
12 mL
Suministro
del solvente
Acondicionador
Bomba
Manipulación
de la muestra
Inyector Aut.
Inyector manual
Separación de
la muestra
Horno
Columna
Control del
Cromatógrafo
Detección
UV l fija
UV l variable
Arreglo de diodo
Electroquímico
Ind. Refracción
Colector
de fracciones
HPLC
Instrumentación
La columna
Cuidado de la columna: Filtre la muestra y los solventes; Use una columna
guardian; Consérvelas cubiertas; Guarde en condiciones adecuadas
Frita Cartucho
Los sistemas metálicos tienen problemas por la corrosión del metal (colas en los
picos, problemas con recobrado, por adsorción en lugares activos del metal).
Hoy: vidrios especiales y fluoropolímeros. Cartuchos listos para cambiar.
Las dimensiones de la columna y el hard afectan : La vida útil, capacidad,
eficiencia y velocidad del análisis.
El relleno determina la eficiencia por el tamaño de partícula. La resolución y
selectividad de la columna tienen que ver con la química de su superficie.
La fase móvil influye también en l;a selectividad y eficiencia.
Consiste en el relleno y el hardware (uniones, fritas, etc.)
La columna guardian: Protege a la columna analítica de material particulado que
puede estar en la fase móvil; Retiene solutos que pueden enlazarse de manera
irreversible con la fase; Previene el envejecimiento, suministrando a la fase móvil
con iones silicato a través de su hidrólisis constante. Bien seleccionada no afecta w.
HPLCParámetro C.Columna
Analítica A.Vel. Microcol. Prep.
dP, m 100 5 3 5 3
L, cm 100 25 5 15 25d.i., mm 20 4.6 4.6 1.0 21.2
N 1000 15000 6000 6000 15000
Vpico,mL,k=1 40 0.1 0.04 0.006 3Vpico,mL,k=10 220 0.7 0.23 0.034 16
SP,ent.col.,atm 0.01-0.1 50-200 100-200 50-150 50-200T anal., k=5 1000 10 1.2 6 15
Características de algunos tipos de columnas
Cromatografía normal:Se utiliza la sílica base. Se pasa la sustancia, disuelta
en un solvente organic, y se ve sometida a la acción de los grupos silanol. Más
polar, más retención.
Fase reversa: Unidades no polares orgánicas enlazadas. Se crea superficie
hidrofóbica. La fase móvil es polar (mezcla agua-solvente orgánico generalm.
Es la más difundida pues: muchas de las sust. De interés son solubles en agua;
De acuerdo al grado de modificación, se puede hacer un análisis a la medida;
Se pueden lograr efectos modificando pH, adicionando solventes orgánicos, etc.
La fase estacionaria.
La sílica: Ideal para HPLC, pues resiste bien a diferentes fases móviles y sus
cambios; Se puede derivatizar con facilidad; es rígida lo que permite altos
flujos y presiones. Se emplean generalmente las esféricas. Cuidado con pH;<8
> 2-3.5 de acuerdo a la fase enlazada.
Tamaño de partícula: Mientras menor más eficiencia debido a más S y mejor
Def. Normalmente 5 m, hay 3 mm. Atención menor dP mayor DP.
Tamaño de poro:De él depende As. A menor, mayor As. Tener en cuenta que
poro muy pequeño impide acceso de analitos. Normalmente 100 A, para biom.
300 A.
Fases enlazadas
Si-
OH
+C
l-S
i(R
)3
Si-
O-S
i(R
)3
R
CH3(C1)- En FR para comp. de alta MM
C8 - Intermedio entre C1 y C18. Sep. Orientat.
C18(ODS)- Amplio uso, muy selectiva a homol. Si
mucha ret. Bajar a C8. No polares FR.
Fenil- Menos selectiva a homól. Buena para Ar
(CH2)3NH2-En FR, para ácidos. No C=O ald. Cet.
(CH2)3CN -Polares y no polares en FN
Sílica - Moderadamente polares en Adsorción.
El solvente Requisitos:
•Disolver la muestra
•Compatible con el detector
•No reaccionar
•Pureza (grado HPLC)
•Baja viscosidad
•Seguro
•Miscible
•Dar la K y a de interés
Débil nC6
isoC8
Tolueno
Cloroformo
DCM
THF
Eter
Ac.Etilo
Acetona
Acetonitrilo
Isopropanol
Metanol
Agua
Metanol
Isopropanol
Acetonitrilo
Acetona
Ac.Etilo
Eter
THF
DCM
Cloroformo
Tolueno
isoC8
nC6 FN
FR
Elución con gradiente:
Una resolución general óptima
Tiempos de análisis más cortos
Anchos de los picos iguales
S = F1S1+F2S2
Requisitos del sistema del solvente:
V0 pequeño
Fácil de usar y arreglar
Flujos adecuados:
en rangos amplios
A alta P
Repetible y suavemente
Con muchos solventes diferentes
Detectores
Mide propiedad de la solución: (D en prop. físicas del soluto y el solv.):
Indice de refracción ; Conductividad
Mide propiedades del soluto:
Opticos: UV-VIS, IR, Fluorescencia; Electroquímicos; Radiométricos
Absorb. I.Ref. Fluoresc. Electroq. Conduct.
Gradiente Si No Si No No
Selectividad Alta Baja Muy alta Muy Alta Baja
Sensibilidad 10-10
10-7
10-11
10-12
10-8g/mL
Derivatización
Se utiliza cuando no se tiene un detector suficientemente sensible y selectivo.
La reacción postcolumna tiene la ventaja de ganar en sensibilidad sin afectar
las propiedades cromatográficas de los compuestos separados.
Aplicaciones
Clorofenoles - octil, 254 nm
metanol, agua, acético, grad.
Nitro y clorofenoles - metil, 254 nm
Metanol, agua, ac. Acético, grad.
Ftalatos - Sílica, 254 nm, CC6+DCM
isocrático.
Aminas aromáticas - Ciano, 254 nm
Isopropanol-C6, isocrático.
Herbicidas fenoxi- Metil, 254 nm
CH3CN,agua,ac. Acético, isocrático
Carbamatos - Amino, UV 254,
Isopropanol C6, isocrático
Derivados del petróleo:
Separación por tipos de HCs