PRUEBAS BIOQUIMICAS

MESA:4

INTEGRANTES:•CASTILLO AVILA BERENICE•CHARGOY CRUZ ARIE GABRIEL•ESPINOSA CANO RENE MISAEL•GARCIA ARROYO ALEJA GUADALUPE•PINEDA MURILLO JONATHAN YAHIR•ROMERO ESTRADA MARCO ANTONIO•TORRES MUNGUIA RICARDO

INTRODUCCIÒN

Nuestro propósito es que conozcan las pruebas bioquímicas que se utilizan en el área de bacteriología y de igual forma conocer sus características de cada una de ella en cada medio de cultivo según la prueba.

DEFINICION DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

Consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permite identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo.

PRUEBAS BIOQUIMICAS

GRAM + GRAM -

Coagulasa Ornitina. Movilidad, lisina

Oxidasa Fermentación de carbohidratos

Catalasa Producción de acido sulfhídrico

Citrato

Urea

Fermentación con producción de gas

Indol

RM( Rojo de metilo)

VP( Vogas Proskaver)

PRUEBA DE LA COAGULASA

Objetivo: Permite separar Staphilococcus aureus, que produce la enzima coagulasa, de las otras especies de estafilococos que se denominan coagulasa negativos.

Fundamento: Staphilococcus aureus posee dos tipos de coagulasa:* Una endocoagulasa o coagulasa ligada que está unida a la pared celular. Esta actúa directamente sobre el fibrinógeno provocando la formación de coágulos cuando se mezcla una suspensión bacteriana con plasma citratado u oxalatado, la velocidad de coagulación es directamente proporcional a la concentración enzimática.

Técnica: varía según la coagulasa investigada.

- coagulasa ligada y libre: (en tubo)colocar volúmenes iguales de plasma citratado y de cultivo de caldo de staphilococccus (o ansa, una buena cantidad de colonia pura) mezclar suavemente e incubar durante 4hs a 37ºC controlando cada 30min, si se produce la coagulación.

Resultados:EN TUBO. Positivo: coagulo total. o parcial, cualquier grado de coagulación.Negativo: suspensión homogénea (staphylococcus epidermidis) u otro organismo. 

PRUEBA DE LA CATALASA

Fundamento: la enzima catalasa se encuentra en la mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo (excepto el streptococcus) generalmente las bacterias que carecen de citocromo también carecen de catalasa, lo que les impide descomponer el peróxido de hidrogeno.La catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno bajo la fórmula 2 H2O2-->2 H2O + O2. De esta manera las bacterias se protegen del efecto tóxico del H2O2, que es un producto final del metabolismo aerobio de los azúcares.

 Técnica: Se coloca una gota de H2O2 al 30% sobreun portaobjetos y luego se transfiere una porción decolonia sobre el H2O2 realizándose una emulsión. En loposible debe tomarse la colonia a partir de un medio sinsangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasay pueden falsear los resultados.(falso positivo)Esta prueba también puede realizarse en un aislamientoen tubo, simplemente colocando unas gotas de H2O2dentro del mismo.

Resultados: Positivo: producción de burbujas (por liberación de oxigeno) Negativo: no se producen burbujas

PRUEBA DE OXIDASAEsta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo-oxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para:•Identificar todas las especies de Neisseria (+)•Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs).

Realización de la prueba:

1.-Método en placa directaAgregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla.Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

2.-Método indirecto sobre papelColocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina.Procedimiento:Inocular en picada las cepas de microorganismo en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

INTERPRETACION Y RESULTADOS:

REACCION INTERPRETACION

Enturbamiento del agar Hay movilidad

Agar transparente desarrollo solo en picada

No hay movilidad

Azul Descarboxila ornitina

Coloración amarilla (acido)

No descarboxila

Rojo Indol (+)

Amarillo Indol (-)

FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS

Las pruebas de fermentación de carbohidratos son útiles para complementar los resultados de las pruebas de utilización de los hidratos de carbono cuando existe alguna dificultad para la identificación definitiva de un organismo.Los medios de fermentación contienen peptona, extracto de ternera o de levadura, un indicador y fuentes de carbohidratos individuales. La fermentación se detecta únicamente por la producción de gas. La producción de ácidos, como indica el cambio de color del indicador, no es indicio de fermentación.

El medio Hierro y Triple Azúcar permite diferenciar bacilos entéricos Gram-negativos basándose en su diferente capacidad de fermentación a los tres azúcares (glucosa, sacarosa y lactosa) y producción de sulfhídrico. La degradación del azúcar da lugar a la formación de ácido que se detecta por un cambio de color del rojo de fenol que pasa de anaranjado a amarillo, mientras que si el medio sufre una alcalinización pasa de anaranjado a rojo/púrpura. Los microorganismos que sólo fermentan la glucosa, como Salmonella y Shigella, (que se encuentra en una concentración 10 veces inferior a los otros azúcares), si bien producen el viraje al amarillo, éste sólo se mantiene en la columna vertical (base del tubo) mientras que la superficie inclinada restablece el color rojo por oxidación del ácido. El color amarillo obtenido en la acidificación del medio producida por la fermentación de la sacarosa o de la lactosa es persistente. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar Hierro(II) Sulfuro presentan el característico precipitado negro. La producción de gas se observa por la formación de burbujas e incluso por la rotura del propio gel.

Hierro de Kligler, AgarSe emplea en la diferenciación de bacilos entéricos Gram-negativos según la fermentación de dos azúcares (glucosa y lactosa) y la producción de Hidrógeno Sulfuro.FundamentoPor este medio se trata de diferenciar los bacilos entéricos Gram-negativos tanto por su capacidad de fermentar la lactosa y/o la glucosa como por la de producir Hidrógeno Sulfuro. La acidificación del medio a causa del proceso fermentativo se pone de manifiesto con un cambio de color del rojo de fenol que pasa de rojizo a amarillo. Los microorganismos que sólo fermentan glucosa, como Salmonella y Shigella, que se encuentra en una concentración 10 veces inferior a la lactosa, si bien, producen el viraje al amarillo, éste sólo se mantiene en la columna vertical (base del tubo) mientras que la superficie inclinada restablece el color rojo por oxidación del ácido. El color amarillo obtenido en la acidificación del medio, producida por la fermentación de la lactosa, es persistente, por lo que la superficie indicada se mantiene amarilla. Los cultivos que contienen microorganismos capaces de formar Hierro(II) Sulfuro presentan el característico precipitado negro. La producción de gas se observa por la formación de burbujas e incluso por la rotura del propio gel.

PRODUCCION DE ACIDO SUFHIDRICO EN LOS MEDIOS TSI, KLIGGER, SIM

TSI:El tiosulfato de Sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro de color negro.

 SIM:La sepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas sepas productoras de ácido sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Kligler: En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y  producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante.

CITRATOEsta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros:Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte gasificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

Resultados  

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

MICROORGANISMO

CITRATO PERMEASA

COLOR DEL MEDIO

Klebsiella pneumoniae

Positivo Azul

S. Typhimurium Positivo Azul

E. Coli Negativo Verde

S. flexneri Negativo Verde

Christensen Medio (Urea AgarBase). Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica.Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos. En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH.Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.

PRUEBA DE INDOL

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptófano.

Procedimiento:Inocular el caldo triptófano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.Resultados:(+) Escherichia coli( - ) Klebsiella pneumoniae

RM (ROJO DE METILO)El Medio MR-VP es utilizado para la diferenciación de organismos coliformes en base a las pruebas de Rojo de metilo y Voges-.Proskauer. Este medio también es conocido como Rojo de Metilo Voges- Proskauer.La prueba para detectar a los altos productores de ácido es conocida como Rojo de Metilo (MR). La prueba para detectar a los menos productores de ácido está basada en el procedimiento que describieron Voges y Proskauer en 1898 donde se presenta una reacción colorida cuando los cultivos se incuban en un medio conteniendo dextrosa y peptona y se les adiciona hidróxido de potasio exponiéndolos al aire. Esta reacción pone de manifiesto la formación de acetilmetilcarbinol y es conocida como la prueba de Voges-Proskauer (VP). En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el fosfato actúa como buffer.