Métodos de detección rápida de resistencias en M. … · Versatrek® Secuenciación genes de...
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Taller UITB-201128 de Noviembre de 2011
Fernando AlcaideFernando Alcaide
Servei de Microbiologia. Hospital Universitari de Bellvitge-IDIBELLDepartament de Patología i Terapéutica Experimental. Universitat de
Barcelona (UB)
MMéétodos de deteccitodos de deteccióón rn ráápida de pida de resistencias en resistencias en M. tuberculosisM. tuberculosis
DetecciDeteccióón de las resistenciasn de las resistencias
Método de las concentraciones absolutasMMéétodo de las concentraciones absolutastodo de las concentraciones absolutas
Método de la relación de resistenciasMMéétodo de la relacitodo de la relacióón de resistenciasn de resistencias
Método de las proporciones múltiplesMMéétodo de las proporciones mtodo de las proporciones múúltiplesltiples
•• ClCláásico de Canetti, sico de Canetti, RistRist y y GrossetGrosset (Rev Tuberc Pneumol 1963;27:263-72)
•• RadiomRadioméétricotrico ((BactecBactec 460TB)460TB)• Métodos automatizados NO radiométricos (MGIT960 y VersatreK)
MMéétodos Convencionales (Fenottodos Convencionales (Fenotíípicos)picos)
1. MTBC: Crecimiento MUY LENTOMUY LENTO– Tiempo de duplicación: 1515--20 h20 h
– Colonias visibles: 33--4 s4 s
2. MTBC: Crecimiento NO UNIFORMENO UNIFORME en los medios de cultivo
3. Métodos laboriosos
MMéétodos convencionales (fenottodos convencionales (fenotíípicos)picos)
LIMITACIONESLIMITACIONESLIMITACIONES
Resultados 2 - 5 semanas
Importante“manejo” de MDR -
XDRTto precoz
Optimización del ttoPrevenir Transmisión
DetecciDeteccióón de las resistenciasn de las resistencias
Fagos
TLA (Microcolonias Agar-capa fina)
Anyplex plus MDR-TB Detection®Colorimétrico tipo Redox
GenoFlow DR-MTB Array Test®Nitrato Reductasa (NRA)
Otros: MODS
Secuenciación genes de resistenciaVersatrek®
GeneXpert MTB/RIF®MIGT960®
GenoType MTDDRplus y MTDDRsl®Radiométrico (Bactec 460TB®)
INNO-LiPA Rif. TB®Proporciones LJ y 7H10 o 7H11
Pruebas genotípicasPruebas fenotípicas
MMéétodos fenottodos fenotíípicos sencillos y econpicos sencillos y econóómicosmicos
Indicadores Colorimétricos RedoxIndicadores Indicadores ColorimColoriméétricostricos RedoxRedox
Observación Microscópica de Sensibilidad a Fármacos (MODS)ObservaciObservacióón Microscn Microscóópica de Sensibilidad a Fpica de Sensibilidad a Fáármacos (MODS)rmacos (MODS)
Detectan R a INH y RMP en cultivo mediante Resazurina.No comercial, requiere cierto entrenamiento pero poco equipo.
Detectan R a INH y RMP en cultivo líquido mediante microscopio de luz invertida (formación de cuerdas).No comercial, requiere entrenamiento importante y un cierto equipo.
Método de la Nitrato reductasa (NRA)MMéétodo de la Nitrato reductasa (NRA)todo de la Nitrato reductasa (NRA)Detectan R a INH y RMP en cultivo sólido (ensayos en M. líquido).No comercial, requiere cierto entrenamiento y poco equipo.
Detección de Microcolonias en Agar (TLA)DetecciDeteccióón de n de MicrocoloniasMicrocolonias en Agar (TLA)en Agar (TLA)Detectan cultivo positivo y R a INH y RMP en cultivo sólido (capa fina Middlebrook 7H11) mediante microscopía.No comercial, requiere entrenamiento importante y cierto equipo.
BacteriBacterióófagosfagosLUCIFERASALLUCIFERASAUCIFERASA
LRPLRPLuciferaseReporter
Phage assay(FASTPlaque-TB®)
PhaBPhaBPhage
AmplifiedBiollogically
Assay
MABMABMycobacteriophage-based assay
MICOBACTERIÓFAGOMMICOBACTERIICOBACTERIÓÓFAGOFAGO
• Resolver:– Falsos Pos no explicados (algunos estudios)– Contaminación potencial– Detección de bajo nivel de R a la INH – Resultados indeterminados
Alteraciones genéticas puntuales en los genes del cromosoma que codifican la diana del
fármaco o enzimas implicadas en su activación
Resistencia ADQUIRIDA en MTBC
•• NONO existen elementos genéticos MMÓÓVILESVILES (No
transmisión horizontal de genes de R)
•• MDRMDR--XDRXDR: acumulación secuencial de mutaciones en
diferentes genes
MDR-TB Distribución Mecanismos de resistencia
INH
RMPrpoB
KatG
inhA
0102030405060708090
100
INH RMP PZA SM EMB FQ
gyrAgyrA
embBembB
pcnApcnA
ahpCahpC
inhAinhA
katGkatGrpsLrpsL
rrsrrs
Frecuencia de las Frecuencia de las MutacionesMutaciones
rpoBrpoB
DNA
PCR
Hibridación
DetecciDeteccióón Molecularn Molecular
ElectroforésisPCR-SSCP
Secuenciación G A T C
Referencia
1. Hibridación en TirasTiras
2. Hibridación en Microplacas
(ELISA - RMP)
3.3. PCR Tiempo RealPCR Tiempo Real (TaqMan,
Beacons, FRET, SybrGreen)
4.4. ChipsChips de DNA – Microarrays
Basadas en Basadas en HibridaciHibridacióónnBasadas en Basadas en HibridaciHibridacióónn
HibridaciHibridacióón en n en Tiras Tiras InnoLiPA®HibridaciHibridacióón en n en Tiras Tiras InnoLiPA®HibridaciHibridacióón en n en Tiras Tiras INNO-LiPA Rif.TB®
rpoB
HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRplusplus 2.0
HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRslsl 2.0
HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRplusplus
HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRplusplus
HibridaciHibridacióón en n en TirasTirasMétodo GenoType® MTBDRMTBDRplusplus (rpoB, KatG, InhA)
Buena correlación (Seq-Fenotípico): 2 - 4 % discrepantes
Aislamientos clAislamientos clíínicosnicos
(Johansen et al. JCM 2003)SENSIBILIDADSENSIBILIDAD
BAAR positivas : 77,7%BAAR negativas: 41,6%
Muestras clMuestras clíínicasnicas
HibridaciHibridacióón n -- INNOLiPAINNOLiPA RifRif. TB . TB
Ling et al. ERRM 2008 – Sensibilidad 80%
FQ: sensibilidad 89% - especificidad 100%AMK: sensibilidad 75% - especificidad 100%CP: sensibilidad 87,5% - especificidad 99,1%EMB: sensibilidad 38,5% - especificidad 100%
MTBDRMTBDRslsl -- Muestras clínicas (Hillemann et al. JCM 2009)
HibridaciHibridacióón n –– GenoTypeGenoType
RMP: sensibilidad 98,9%INH: sensibilidad 94,7%
MTBDRMTBDRplusplus –– Muestras clínicas (Barnard et al. AJRCCM 2008)
Especificidad 100%
• La aprobación de la utilización de estas pruebas de hibridación en tiras (Line probe) para la detección rápida de la MDR-TB debería ser decidida por los ministerios de salud de cada país en el contexto de los planes nacionales para el manejo adecuado de los pacientes con TB-MDR.
• Estas pruebas han sido adecuadamente validados para su utilización en esputos con esputos con baciloscopiabaciloscopia positivapositiva y en cepascepas del complejo M. tuberculosis.
• Se recomienda la utilización de mméétodos comercialestodos comerciales.• Usar en centros con experienciacentros con experiencia y dotacidotacióón adecuadan adecuada. •• No sustituyenNo sustituyen las pruebas de sensibilidad fenotpruebas de sensibilidad fenotíípicaspicas.
Molecular Beacon
TaqMan
FRET
PCR Tiempo RealPCR Tiempo Real
PCR Tiempo Real:PCR Tiempo Real: Muestras clínicas
Ruiz et al (JCM 2004), Marín et al (AAC 2004) Espasa et al (JAC 2005)
Muestras BAAR Positivas:Muestras BAAR Positivas:• Mutaciones incluidas en el ensayo:
– S: 95-99% E: 100%• Resistencia a la INH:
– S: 52-53% E: 100%• Resistencia a la RMP:
– S: 100% E: 100%Muestras BAAR Negativas:Muestras BAAR Negativas:• Mutaciones incluidas en el ensayo:
– S: 30-35% E: 100%
Estudios Métodos Caseros RMP - INH: rpoB, KatG e inhA
1) inactivación de la muestra (15 min)
2) Dispensación de la muestra en el cartucho
3) Carga del cartuchoen el modulo
Detección de MTBC y mutaciones en rpoB (MDR)
PCR a Tiempo Real PCR a Tiempo Real -- XpertXpert MTB/RIFMTB/RIF
≈ total 2 h(2-3 min
“manipulación técnica”)
1) Extracción DNA
2) AAN (Heminested PCR)
3) Hibridación del amplificado con 5 sondas complementarias de la región core del rpoB
XpertXpert MTB/RIF MTB/RIF –– Evidencia Evidencia (selección OMS 2011)
Xpert MTB/RIF(Trabajos relevantes)
SENSIBILIDAD (MTBC cultivo +)
ESPEC. (Cultivo MTBC -)
RESPIRATORiO EXTRARRESPIRAT.
RMP - R
BAAR + BAAR - BAAR + BAAR -
ARTICULOS
Helb et al, JCM Ene 2010 100% 71,7% - - 9/9 (100%) 100%
Boehme et al, NEJM Sep 2010 98,2% 72,5% - - 200/205 (97,6%) 99,2%
Moure et al, JCM Mar 2011 - 78,2% - 42,8% 6/6 (100%) 100%
Hillemann et al, JCM Abr 2011 - - - 79,5% - 98,2%
Marlowe et al, JCM Abr 2011 98% 72% - - - 100%
Armand et al, JCM May 2011 100% 57% 100% 37% - -
Theron et al, AJRCCM Jul 2011 95% 55% - - 6 de 1
Boehme et al, Lancet Abr 2011 98.3% 76.9% - - 236/250(94,4%) 99%
POSTERS
Tórtola et al, ECCMID 2010 100% 66,7% - 98,1%
Ioannidis et al, ECCMID 2010 96,9% 85,7% 100% - - -
Baron et al, New Delhi 2010 -50-100%
(≠ sites and sampletypes)
66.6% -
Naidoo, Lancet, South Africa 100% 99,7% 93,4% 100% 99,5%
≈100% ≈75% ≈60% ≈100%
XpertXpert MTB/MTB/RIFRIF-- PolicyPolicy StatementStatement
XpertXpert MTB/MTB/RIFRIF-- PrerequisitesPrerequisites
• Polimorfismo en el codón 514 (rpoB) – Cepas: Alonso et al J Clin Microbiol 2011– Muestras clínicas: Moure et al J Clin Microbiol 2011
PCR a Tiempo Real PCR a Tiempo Real -- XpertXpert MTB/RIFMTB/RIF
Mutaciones silentes en rpoB en M. tuberculosis sensibles a la rifampicina
• Concepto: Sistemas miniatuarizados con oligonucleótidosadheridos a una placa de sílica
• Mecanismo: hibridación del segmento de DNA amplificado (diana) con las sondas específicas
Chips de DNA Chips de DNA -- MicroarraysMicroarrays
A B
C
Chips de DNA Chips de DNA –– MicroarraysMicroarraysRifampicina e Isoniazida
Aragón et al. JAC 2006
Montemayor et al. SEIMC 2010
Chip de ADN vs SecuenciaciónSensibilidad Especificidad VPP VPN
Isoniacida KatG 98,5% 99,3% 98,5% 99,3%
inhA 94% 99,4% 97,9% 98%
Rifampicina rpoB 98,4% 98,7% 96,4% 98,7%
Chip de ADN vs Antibiograma fenotípico
Sensibilidad Especificidad VPP VPN
Isoniacida 68,8% 100% 100% 47,4%
Rifampicina 91,4% 98,6% 96,4% 96,7%
205 cepas: 160 INH-R, 58 RMP-R, 50 MDR y 37 S
Chips de DNA Chips de DNA –– MicroarraysMicroarraysRifampicina e Isoniazida
201020102010
Colorimétrico tipo Redox Nitrato Reductasa (NRA) MODS
Pruebas fenotípicas
201020082008
GeneXpert MTB / RIF®GenoType MTDDRplus y MTDDRsl®INNO-LiPA Rif. TB®
Pruebas genotípicas
MMéétodos respaldados por la OMStodos respaldados por la OMS
DetecciDeteccióón rn ráápida de resistenciaspida de resistenciasMMéétodos de AAN e Hibridacitodos de AAN e Hibridacióónn
(Recomendaciones OMS)
Hibridación reversaINNOLiPA-Rif.TB
HibridaciHibridacióón reversan reversaINNOLiPAINNOLiPA--Rif.TBRif.TB
Hibridación reversaGenoType MTBDRplus/sl
HibridaciHibridacióón reversan reversaGenoTypeGenoType MTBDRMTBDRplusplus//slsl
PCR Tiempo real - GeneXpertPCR Tiempo real PCR Tiempo real -- GeneXpertGeneXpert
• RMP• PCR + Hibridación (semiautomatizada) • Buena relación coste-beneficio
• RMP• PCR + Hibridación (semiautomatizada) • Buena relación coste-beneficio
• RMP-INH y FQ-AG/PepCíclicos-EMB• PCR + Hibridación (manual) • Buena relación coste-beneficio
• RMP-INH y FQ-AG/PepCíclicos-EMB• PCR + Hibridación (manual) • Buena relación coste-beneficio
• RMP• PCR + Hibrid. simultánea (automatizada) • Rápida, poco laboriosa y muy Sencilla• Cara
• RMP• PCR + Hibrid. simultánea (automatizada) • Rápida, poco laboriosa y muy Sencilla• Cara
UITBUITB-- GEMB GEMB (Grupo de Estudio de (Grupo de Estudio de MicobacteriasMicobacterias de Barcelona)de Barcelona)
Hospital Clínic: Julià González, Griselda Tudó, Emma Rey
Hospital de Sant Pau: Pere Coll, Montserrat Español,
Hospital de la Vall d’Hebrón: Teresa Tórtola, Nuria Martín
Laboratori de Referencia de Catalunya: Margarita Salvadó, Eva Vicente
Hospital de Bellvitge: Raquel Moure, Miguel Santín, Laura Muñoz
AgradecimientosAgradecimientos