Microbiología IIMicrobiología IITemaTema

Prueba de ELISAPrueba de ELISA

OBJETIVOOBJETIVO

Conocer la técnica de ELISA, su Conocer la técnica de ELISA, su fundamento y algunas fundamento y algunas

aplicaciones en particular para la aplicaciones en particular para la detección del virus de sida por detección del virus de sida por

medio de esta técnica.medio de esta técnica.

Breve repaso de anticuerpos y antígenos.Breve repaso de anticuerpos y antígenos.• El sistema inmune de los mamíferos evoluciono El sistema inmune de los mamíferos evoluciono

para reconocer y destruir la variedad de patógenos para reconocer y destruir la variedad de patógenos (y sus variaciones antigénicas) a lo que los (y sus variaciones antigénicas) a lo que los organismos deben enfrentarse a lo largo de la vida.organismos deben enfrentarse a lo largo de la vida.

• Los elementos básicos de este reconocimiento lo Los elementos básicos de este reconocimiento lo constituyen los linfocitos B y T, y las células constituyen los linfocitos B y T, y las células presentadoras de antigéno: los dos primeros presentadoras de antigéno: los dos primeros evolucionaron de forma tal que sus receptores para evolucionaron de forma tal que sus receptores para antigenos pueden reconocer de manera específica antigenos pueden reconocer de manera específica virtualmente cualquier molécula biológica.virtualmente cualquier molécula biológica.

• Inmunización es un proceso, natural o artificial, Inmunización es un proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo competente mediante el cual un individuo competente desarrolla una respuesta inmune al entrar en desarrolla una respuesta inmune al entrar en contacto con un antígeno.contacto con un antígeno.

• Antecedentes de la técnicaAntecedentes de la técnica• La detección de la reacción antigéno- anticuerpo.La detección de la reacción antigéno- anticuerpo.

• Método sencillo, de alta sensibilidad y especifico, con Método sencillo, de alta sensibilidad y especifico, con posibilidad de ser automatizados y pueden ser realizados posibilidad de ser automatizados y pueden ser realizados en laboratorios sin grandes recursos técnicos. en laboratorios sin grandes recursos técnicos.

• Dentro de los factores que han propiciado la expansión Dentro de los factores que han propiciado la expansión de este método se encuentra:de este método se encuentra:

El desarrollo de la industria del plástico, que género El desarrollo de la industria del plástico, que género materiales con características de adsorción definidas y materiales con características de adsorción definidas y reproducibles.reproducibles.

• Las características y desarrollo de métodos de Las características y desarrollo de métodos de purificación de las enzimas que se emplean como purificación de las enzimas que se emplean como marcadores.marcadores.

• el desarrollo de métodos más sencillos y confiables de el desarrollo de métodos más sencillos y confiables de conjugación de anticuerpos a las enzimas marcadoresconjugación de anticuerpos a las enzimas marcadores

Principio de la técnicaPrincipio de la técnica• (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) (Enzyme Linked Immunosorbant Assay)

fue descrito en 1971 por Engvall y fue descrito en 1971 por Engvall y Perlman. Perlman.

• Método que utilizan los anticuerpos Método que utilizan los anticuerpos conjugados con una enzima, conserva su conjugados con una enzima, conserva su capacidad de unión especifica al capacidad de unión especifica al antígeno al antígeno.antígeno al antígeno.

• La enzima es capaz de una reacción de La enzima es capaz de una reacción de oxido- reducción.oxido- reducción.

• EL sustrato se transforma en un producto EL sustrato se transforma en un producto colorido. colorido.

Descripción de la técnica.Descripción de la técnica.

• El ensayo inmunoadsorbido ligado a enzima El ensayo inmunoadsorbido ligado a enzima (ELISA), técnicas serologías más utilizada. (ELISA), técnicas serologías más utilizada.

• Hay dos métodos básicos:Hay dos métodos básicos:

• La La técnica de sándwich de doble anticuerpo.técnica de sándwich de doble anticuerpo.

• Ensayo indirecto inmunoadsorbido ligado a Ensayo indirecto inmunoadsorbido ligado a enzimaenzima para la detección de anticuerpos. para la detección de anticuerpos.

Método del sándwich de doble anticuerpo.Método del sándwich de doble anticuerpo.

• Adsorciòn del antisuero a la superficie de los posillos de una placa Adsorciòn del antisuero a la superficie de los posillos de una placa de microtitulación. de microtitulación.

• El antigéno se añade y reacciona específicamente con los El antigéno se añade y reacciona específicamente con los anticuerpos adsorbidos a los posillos, el antigéno será retenido a anticuerpos adsorbidos a los posillos, el antigéno será retenido a pesar de los lavados que se realicen para eliminar el antigéno pesar de los lavados que se realicen para eliminar el antigéno libre.libre.

• Anticuerpo específico para el antigéno, el segundo anticuerpo, Anticuerpo específico para el antigéno, el segundo anticuerpo, para el antigéno.para el antigéno.

• Sándwich.Sándwich.

• Con el antigéno entre las dos moléculas del anticuerpo.Con el antigéno entre las dos moléculas del anticuerpo.

• Es visible el segundo anticuerpo añadido está unido a una enzima.Es visible el segundo anticuerpo añadido está unido a una enzima.

• Peroxidasa de rábano Peroxidasa de rábano

• Fosfatasa alcalina.Fosfatasa alcalina.

• La actividad enzimática se pone de manifiesto por un cambio de La actividad enzimática se pone de manifiesto por un cambio de color, negativo ya que todo el antígeno no unido se elimina al color, negativo ya que todo el antígeno no unido se elimina al lavar. lavar.

Ensayo indirecto inmunoadsorbido.Ensayo indirecto inmunoadsorbido.

• En el primer paso de este método se adsorbe el En el primer paso de este método se adsorbe el antígeno, antígeno,

• Anticuerpos, a las paredes de la placa. Anticuerpos, a las paredes de la placa.

• Muestra de un suero contiene anticuerpos frente a Muestra de un suero contiene anticuerpos frente a este antigéno se añade el antisuero a los posillos. se este antigéno se añade el antisuero a los posillos. se lava y se añade entonces anti-Ig humana (un lava y se añade entonces anti-Ig humana (un anticuerpo que reacciona con cualquier anticuerpo que reacciona con cualquier inmunoglobulina humana), que se unirá al complejo inmunoglobulina humana), que se unirá al complejo antígeno-anticuerpo.antígeno-anticuerpo.

• La antiIg humanan. que no se ha fijado es lavada y se La antiIg humanan. que no se ha fijado es lavada y se añade entonces el sustrato adecuado para la enzima.añade entonces el sustrato adecuado para la enzima.

Algunas aplicaciones de la técnica.Algunas aplicaciones de la técnica.

• Determinación de la tirosina.Determinación de la tirosina.

• Digoxina, B- metildigoxina, alfa acetilcolina; B –Digoxina, B- metildigoxina, alfa acetilcolina; B –acetildigoxina.acetildigoxina.

• Insulina.Insulina.

• Alfa -1-fetoproteina.Alfa -1-fetoproteina.

• Tiroxina serica.Tiroxina serica.

• Tridoyotironina.Tridoyotironina.

• El desarrollo de anticuerpos El desarrollo de anticuerpos monoclonales ha hecho posible por monoclonales ha hecho posible por primera vez el diagnostico de primera vez el diagnostico de enfermedades de transmisión sexual enfermedades de transmisión sexual producidas por clamidias.producidas por clamidias.

• El uso de sondas de DNA, aunque no El uso de sondas de DNA, aunque no sean pruebas serológicas, resultará sean pruebas serológicas, resultará cada vez más útil para la detección cada vez más útil para la detección de patógenos en tejidos o alimentos.de patógenos en tejidos o alimentos.

Introducción hacia el SIDAIntroducción hacia el SIDA

• Bacterias, hongos y virus muy comunes que ordinariamente Bacterias, hongos y virus muy comunes que ordinariamente no ocasionan enfermedad.no ocasionan enfermedad.

• VIH.VIH.

• Sangre, esperma, saliva, lágrimas, tejido nervioso, leche Sangre, esperma, saliva, lágrimas, tejido nervioso, leche materna, y secreciones del tracto genital. materna, y secreciones del tracto genital.

• La transmisión: contacto sexual incluyendo el sexo anal, La transmisión: contacto sexual incluyendo el sexo anal, vaginal y oral; por medio de la sangre mediante transfusiones vaginal y oral; por medio de la sangre mediante transfusiones o aguja infectada; y en mujeres embarazadas al feto, o al dar o aguja infectada; y en mujeres embarazadas al feto, o al dar de mamar al bebé.de mamar al bebé.

• Métodos mas raros de transmisión incluyen el pinchazo Métodos mas raros de transmisión incluyen el pinchazo accidental con una aguja, la inseminación artificial, en la que accidental con una aguja, la inseminación artificial, en la que la transmisión ocurre a través del esperma donado, y el la transmisión ocurre a través del esperma donado, y el transplante de riñón, en el que el transmisor es el riñón transplante de riñón, en el que el transmisor es el riñón donado.donado.

El virus (VIH) es un El virus (VIH) es un retrovirus, que retrovirus, que presenta hebras de presenta hebras de ARN y una enzima, la ARN y una enzima, la transcriptasa reversa. transcriptasa reversa. Posee, además, una Posee, además, una proteína específica, la proteína específica, la GP120, GP120, membranolítica en su membranolítica en su capa externa, que le capa externa, que le ayuda a perforar la ayuda a perforar la membrana de la célula membrana de la célula atacada y penetrar en atacada y penetrar en ella. En el caso del VIH ella. En el caso del VIH la célula parasitada es la célula parasitada es el linfocito T4. el linfocito T4.

• Retrovirus del Sida por Retrovirus del Sida por el linfocito T4 se debe a el linfocito T4 se debe a que éste presenta en su que éste presenta en su superficie un marcador superficie un marcador específico que le específico que le permite al virus permite al virus reconocerlo. reconocerlo.

• El proceso posterior a la El proceso posterior a la invasión es el típico de invasión es el típico de infección por virus: infección por virus: transcripción de su transcripción de su genoma al ADN del genoma al ADN del huésped, obligando a huésped, obligando a éste a réplicas éste a réplicas sucesivas hasta sucesivas hasta destruirlo, saliendo destruirlo, saliendo luego un gran número luego un gran número de individuos a parasitar de individuos a parasitar a otros linfocitos T4. a otros linfocitos T4.

• Copia la información Copia la información genética de él genética de él mismo, de modo mismo, de modo que pueda que pueda integrarse en el integrarse en el propio código propio código genético de la genético de la célula huésped, lo célula huésped, lo que hace que cada que hace que cada vez que se divida, vez que se divida, una célula huésped, una célula huésped, se reproducirán se reproducirán copias virales, cada copias virales, cada una de ellas con el una de ellas con el código viral.código viral.

Aplicación de la técnica de ELISA, para Aplicación de la técnica de ELISA, para la diagnosticación del SIDAla diagnosticación del SIDA

Elaboro: Cruz Cruz Ma. Candelaria.Elaboro: Cruz Cruz Ma. Candelaria.

Bibliografía Bibliografía

• Albert L. Lehninger, PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA, 2 ed., ediciones Omega, Albert L. Lehninger, PRINCIPIOS DE BIOQUIMICA, 2 ed., ediciones Omega, España, 1995 (pag 145).España, 1995 (pag 145).

• Gerard J. Tortora, INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÌA, editorial Arribia, S.A , Gerard J. Tortora, INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÌA, editorial Arribia, S.A , España , 1993 (pag. 448-449).España , 1993 (pag. 448-449).

• Aldo A. Guerci, LABORATORIO METODOS DE ANALISIS, 4 ed, editorial Librería Aldo A. Guerci, LABORATORIO METODOS DE ANALISIS, 4 ed, editorial Librería el Ateneo , Argentina, 1988 (pag. 457- 475).el Ateneo , Argentina, 1988 (pag. 457- 475).

• Jorge V. Gavilondo Cowley, ANTICUERPOS MONOCLONALES, editorial Elfos, Jorge V. Gavilondo Cowley, ANTICUERPOS MONOCLONALES, editorial Elfos, México, 1995 (pag 71-76, 148-151).México, 1995 (pag 71-76, 148-151).

• Vicente T. Devita, SIDA, 2ª , editorial Salvat editores, S.A España , 1990 (pag Vicente T. Devita, SIDA, 2ª , editorial Salvat editores, S.A España , 1990 (pag 123-133).123-133).

• http://www.tuotromedico.com/temas/sida_diagnostico.htmhttp://www.tuotromedico.com/temas/sida_diagnostico.htm

• http://www.utem.cl/trilogia/Volumen_16_n_25_26/p_16_1.htmhttp://www.utem.cl/trilogia/Volumen_16_n_25_26/p_16_1.htm