UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASCENTRO DE BIOTECNOLOGIA

BIOLOGIA CELULAR

MORTE CELULAR

LEIDI D. PREICHARDTLIANA MACIEL

MARTA E. DOUMERVANESSA GALLI

MORTE CELULAR

Interesse científico últimos anos;

Classicamente 2 processos

Morte celular programada

Apoptose

Necrose

MORTE CELULAR

ApoptoseParapoptose,

Autofagia, Mitose catastrófica

Necrose

Estímulos e tipo de morte celularFonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

Mais recentemente ...

MORTE CELULAR

A morte celular pode acontecer:

Em situações fisiológicas (Relógio Genético)Embriogênese;Processos de metamorfose;Regulação do desenvolvimento e renovação celular

Em situações patológicasInjúria severa como Hipóxia.

MORTE CELULAR

Sydney Brenner Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia (2002)

Estudos com Caenorhabtis elegans para entendimento do controle da morte celular

Caenorhabtis elegans modelo para estudo de morte celular

MORTE CELULAR

ApoptoseRemoção de células ou tecidos alterados,

exercendo importante papel na manutenção da estrutura do órgão ou dos tecidos impedindo que suas funções fossem

alteradas por fatores externos.

Oposto de Mitose.

Induçãoradiações;drogas;choque térmico;metais pesados;agentes oxidantes;

alcoóis;hipóxia;jejum;inibidores metabólicos;infecções víricas.

MORTE CELULAR

Apoptose

Clivagem do DNA por endonucleases

O mecanismo bioquímico fundamental da apoptose é conservado ao longo da escala

evolutiva, havendo genes homólogos regulando a morte celular em todos os

organismos estudados, embora, nos mamíferos, seja um processo mais complexo

MORTE CELULAR

NecroseFalha nas respostas adaptativas genéticas e

metabólicas (morte acidental).

Alguns autores denominam oncose (do grego ónkos: intumescimento) por considerarem o termo necrose seria melhor indicado para se

referir a alterações subsequentes à morte celular propriamente dita

Indução injúrias severashipertemia;privação de nutrientes;estresse oxidativo;sobrecarga intracelular de Ca2+

hipóxia;altas concentrações de substâncias tóxicas

MORTE CELULAR

Apoptose x Necrose

Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Parapoptose

Forma ativa e regulada de morte celular;Apresenta inchamento mitocondrial e formação de vacúolos citoplasmáticos.

AutofagiaMorte celular ativa e regulada, caracterizada

pela lenta degradação do citoplasma e organelas por autofagossomos, vacúolos originários do retículo endoplasmático.

É observada em privação crônica de nutrientes e em algumas doenças

neurodegenerativas

MORTE CELULAR

Distinção das diferentes alterações morfológicas nos processos de morte celular por apoptose versus necrose. A necrose (a) é caracterizada pela perda de integridade de membrana plasmática, floculação da cromatina, inchaço seguido de lise celular com extravasamento do conteúdo intracelular e desintegração de organelas. O processo apoptótico (b) envolve alteração de permeabilidade de membranas, condensação cromatínica, encolhimento celular, formação de corpos apoptóticos sem desintegração de organelas.

MORTE CELULAR

Formação de vacúolos citoplasmáticos

Encolhimento ediminuição doContato

FragmentaçãoM. nuclear

Fragmentação Do DNA

DespolarizaçãoM. mitocondrial

Colapso citoesqueleto

Superfície celularalterada

Fagocitose por célulavizinha e macrófago

Permite reciclagem doscomponentes orgânicos

Apoptose

MORTE CELULAR

Maquinaria intracelular responsável pela apoptose

• É aparentemente semelhante em todas as células animais

• Dependente de uma família de proteases que apresenta uma cisteína

no sítio ativo clivando proteínas-alvo em ácido aspártico específico.

CASPASES

MORTE CELULAR

• As caspases são sintetizadas na célula com um precursor inativo, ou

procaspases, que são ativados pela clivagem do ácido aspártico por

outras caspases.

• Uma vez ativadas as caspases clivam e ativam outras procaspases,

formando uma cascata de amplificação proteolítica.

• Algumas clivam a lâmina nuclear, outras uma proteína que mantém a

enzima degradadora do DNA ( DNAse) inativa, liberando-a para digerir o

DNA.

A célula se desmancha de forma rápida e ordenada, sendo

rapidamente digerida por outras células

MORTE CELULAR

Procaspases são ativadas por ligações a Proteínas Adaptadoras

• Todas as células animais nucleadas contém as procaspases inativas,

que ficam aguardando sinais para iniciar a destruição da célula.

• A atividade das caspases é especificamente regulada na célula para

garantir que a morte celular esteja controlada até que seja necessária

Como são ativadas as procaspases para iniciar a cascata da

caspase??

MORTE CELULAR

• A ativação é feita por proteínas adaptadoras;

• Múltiplas cópias de procaspases iniciadoras se unen em um

complexo;

• Quando forçadas a entrar no complexo, sua proximidade faz

com que uma clive a outra.

MÚTUA ATIVAÇÃO

MORTE CELULAR

• Há casos em que a agregação gera uma mudança conformacional,

ativando as procaspases.

A caspase ativada no topo da cascata cliva a

próxima procaspase para estimular o sinal de

morte que estende-se para toda célula

MORTE CELULAR

Ativação da Apoptose por via extrínseca

• Ocorre pela ativação de “receptores da morte” na superfície da célula.

• Linfócitos “assassinos” podem induzir apoptose produzindo a proteína

ligante Fas.

Ligante Fas Receptor da morte

Superfície Célula-alvo

MORTE CELULAR

Agrupamento proteína Fas

Recruta adaptadores prot. intracelulares

Ligam e agregam procaspases-8

Clivam e ativam uma à outra

Caspase-8 ativada

Ativam as próximas procaspases

Apoptose

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

• Quando as células estão estressadas ou danificadas podem matar a

si próprias desencadeando a agregação das procaspases e a ativação

dentro da célula.

Via intrínseca

MORTE CELULAR

Mitocôndrias

Liberam Citocromo c

Citosol

Liga e ativa Apaf-1

Apaf-1 liga e agrega

Procaspase 9

Cliva e desencadeia a cascata

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

Principais Reguladoras Intracelulares do Programa de Morte Celular

Proteínas da Família Bcl-2

Proteínas IAP

MORTE CELULAR

Família Bcl-2

• São proteínas intracelulares que regulam a ativação das

procaspases.

• Bcl-2 ou a Bcl-XL inibem a apoptose, bloqueando a liberação do

Citocromo c da mitocôndria.

• Alguns membros da Bcl-2 não são inibidores da morte, mas sim

ativadores das procaspases e a consequente morte celular.

MORTE CELULAR

• Algumas proteínas da família, promotoras da apoptose como a Bad

funcionam por ligação e inativação dos inibidores da morte.

• Bax e a Bak estimulam a liberação do citocromo c.

• Se os genes que codificam Bax e Bak são inativados as células são

resistentes a estímulos indutores da apoptose.

• Bax e Bak podem ser ativadas por outros promotores da família Bcl-

2 como a Bid

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

Família IAP

• São proteínas inibidoras da apoptose.

• Inibem a apoptose por duas vias:

se ligam a algumas procaspases para evitar sua ativação

ligam-se as caspases inibindo sua atividade

MORTE CELULAR

• O programa de morte celular intracelular é regulado por sinais

extracelulares que podem ativar ou inibir a apoptose.

• Estes sinais moleculares atuam regulando os níveis ou atividade dos

membros das famílias Bcl-2 e IAP.

MORTE CELULAR

MorfologiaApoptose

Mudança no aspecto morfológico célula

Perda da integridade celular:

Condensação e segregação da cromatina

Identificação da morte celular

MORTE CELULAR

Invaginação das membranas celular e nuclear

Ruptura do núcleo

Corpos apoptóticos_circundados por envoltório nuclear

MORTE CELULAR

Necrose

Aumento do volume total da célula e organelas Autólise:

Dissolução das membranasRuptura da célulaLiberação de seus subprodutos

MORTE CELULAR

Estímulo a uma inflamação

O núcleo sofre desorganização da cromatina, intumescimento e exibe estruturas vacuolizadas

MORTE CELULAR

Aspectos morfológicos

Quadro esquemático das alterações morfológicas com a apoptose (a) e a necrose (b)

Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Citoquímica e imunocitoquímica

Reação de Feulgen: corante reativo de Schiff

Quantificação do DNA

Exibe morfologia de compactações e descompactações cromatínicas

MORTE CELULAR

Células em apoptose coradas podem ser estudadas em vídeo analisador

Contracoradas com “Fast Green” indica presença e quantificação de micronúcleos

MORTE CELULAR

Aspectos genéticos e bioquímicos

Células gigantes com núcleos de diferentes tamanhos originados por processo de mitose catastrófica (MC), presentes em culturas de células MCF-10. a)Reação de Feulgen e contracoloração com fast green. b) Método de impregnação por prata.

Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Citoquímica e imunocitoquímica Reação de Felgen

Imagens de apoptose (A) em células epiteliais mamárias humanas e em culturas submetidas àreação de Feulgen e contracoradas com fast green

Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Citoquímica e imunocitoquímica Reação de Felgen

Aspectos morfológicos e citoquímicos de núcleos de células em apoptose (A) e necrose (N), cujo DNA é identificado pela reaçao de Feulgen.a) Células epiteliais de hemíptero triatomíneo em que se detectam imagens de células em necrose, além de núcleos com aspecto normal usual (U);b) Células epiteliais mamárias humanas in vitro. Imagem de perfil absorciométrico ao longo de um eixo traçado sobre núcleo apoptótico estudado em vídeo-analisador de imagem. Regiões de cromatina condensada aparecem pseudcolonizadas em vermelho.

Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Concentração crítica de eletrólitos (CEC)

Identificação de nucléolos

Células são coradas com azul de toluidina a pH 4,0

Tratamento com MgCl2 em baixa molaridade

MORTE CELULAR

DNA perde sua metacromasia:Cor violeta verde

Concentração Mg 2+ em molaridade

Ponto ou valor de CEC

MORTE CELULAR

RNA permanece em metacromasia

CEC ocorre numa concentração superior à do DNA

DNA com cromatina compactada

verde intenso

MORTE CELULAR

Identificação imunocitoquímica

Kits

Identificam-se:

fragmentação do DNA internucleossomal

núcleos vesículas

MORTE CELULAR

Princípio

Resíduos de nucleotídeos, ligados àdigoxigenitina, serão ligados ao DNA da célula apoptótica por uma enzima, a TdT( terminal deoxynucleotidyl transferase)

Heteropolissacarídeo, reconhecido pelo anticorpo anti-digoxigenina

MORTE CELULAR

O anticorpo traz ligado a si uma peroxidase, revelado pelo procedimento citoquímico

MORTE CELULAR

Citoquímica e imunocitoquímica Concentração crítica de eletrólitos (CEC)

Aspectos citoquímicos e imunocitoquimicos de apoptose e morte celular programada. a,b. Apoptose em células V79, submetidas ao método CEC. (a) e a um método imunocitoquímico para apoptose (b) (setas). c, d. Células epiteliais mamárias humanas in vitro em apoptose (setas), identificadas pelo método CEC. e. Morte celular programada (setas) identificada em eritrócitos nucleados de tartaruga por método imunoquímico.Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

Teste TUNEL

Nucleotídeos irão se ligar as extremidades3’-OH do DNA fragmentado pela ação daTdT.Acham-se marcados com fluoresceína:

Microscópio de fluorescência

MORTE CELULAR

Tratado com anticorpos anti-fluoresceína conjugados com peroxidase

Microscópio de luz comum

MORTE CELULAR

Teste “Annexin V”

Identificação por fluorescência células nas fases iniciais da apoptose

Grupamentos de fosfatidilserina são translocados da parte interna para a parte externa da membrana plasmática

meio extracelular

MORTE CELULAR

Proteína anexina v tem alta afinidade pelas fosfatidilserinas

identifica externalização promovida por apoptose

MORTE CELULAR

Há testes imunocitoquímicos que identificam membros da família Bcl-2 e

caspases específicas

MORTE CELULAR

Identificação em nível bioquímico

Apoptose:DNA nuclear – células em apoptose

eletroforese em gel de agarose

Padrão típico de bandas com segmentos de 185 pares de bases e de seus múltiplos

MORTE CELULAR

Necrose

Fragmentação do DNA ao acaso

padrão eletroforético exibido: arrasto

MORTE CELULAR

Teste Cometa

Células em agarose e com proteínas removida campo elétrico

Padrão de habilidade de migração do DNA (cauda)

Identificação da necrose ou apoptose

MORTE CELULAR

Citoquímica e imunocitoquímica Identificação em nível bioquímico

Imagens de eritrócitos de serpentes submetidos ao teste cometa. a. Controle. b. Apoptose. c. Necrose (experimental)

Fonte: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

MORTE CELULAR

APOPTOSE

1- substrato específico

TNF (Fas)- Citocinas

- Estresse oxidativo

- Ca- pH- lesão do DNA (via gene p53)

Bcl-2 - mitocôndria

Citocromo – c

Estímulo interno

Caspase-8, 10

Caspase-3

1

Caspase-9

Estímulo externo

Apaf-1

Caspases executoras

Apoptose

Antagônicos

MORTE CELULAR

CaspasesCaspases executoras:

clivagem de quinases

proteínas do citoesqueleto

proteínas de reparo do DNA

subunidades inibidoras de endonucleases

destruição das funções celulares “housekeeping”

afetam regulação do ciclo celular e rotas de sinalização

manifestações morfológicas de apoptose – condensação e fragmentação do DNA e rompimento de membranas

MORTE CELULAR

Fagocitose das células apoptóticas

Phagocyte

ApoptoticCell

RAC-1DOCK 180

CRKII

ELMO

CytoskeletalReorganization for

Engulfment

C1q Receptor

BridgeC1q

C1qBindingSite

PS

Phosphatidyl-serineReceptors

ScavengerReceptors

? Oxidized LDL-like Site

MORTE CELULAR

Câncer X Apoptose

Câncer

Mutações Seleção Natural

Ciclo Celular Apoptose

Oncogenes Supressores de Tumor

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

Pró-apoptóticos

Anti-apoptóticos

MORTE CELULARCâncer e doença autoimune

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

c-Myc superexpresso + p53 ou ARF ou ganho de função de genes Bcl-2 = apoptose

CANCER X APOPTOSE

MORTE CELULAR

Câncer de mama: BRCA1 e BRCA2 – se ligam a Rad51 para reparar quebras na fita de DNA p53

E1B – codifica dois produtos, um que ativa Bcl-2e outro que inibe p53

Sistema Ubiquitin/Proteosome

P53 – ativa Bax inibição da apoptose

CANCER X APOPTOSE

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

NF-κB – induz processo inflamatório pró-tumorigênico

MORTE CELULAR

Autofagia

MORTE CELULAR

Terapêutica

ABT-737 - inibe Bcl-2, Bcl-XL e Bcl-w de células cancerígenas

Estratégias antisense e com moléculas antagonistas para inibir membros da Bcl-2

Adenovirus com p53

Aivadores de TNF (Fas)

MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

STAT3 β - Regula negativamente células T-helperAtivador de genes de imunossupresãoBcl-xl, p53, c-Myc

Terapêutica

miRNA

MORTE CELULAR

Moléculas que se ligam a proteínas oncogênicas

Terapêutica

MORTE CELULAR

Terapêutica

MORTE CELULAR

Terapêutica

MORTE CELULAR

Infecção viral

•Vírus – proteínas inibidoras de caspases

MORTE CELULAR

Sistema imunológico X Apoptose

Rejeição do enxerto - célula T citotóxica induzem a apoptose das células alvo

glicocorticóides, ciclosporina e tacrolimus - induzem a apoptose das células T

MORTE CELULAR

Apoptose no desenvolvimento

MORTE CELULAR

OBRIGADO!