Instituto Politécnico NacionalEscuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de MicrobiologíaLaboratorio de Genética Microbiana

Práctica 2:Inducción de Mutantes en Escherichia coli

Hidroxilamina como agente mutagénico para Neurospora crassa

Mutagénesis

Mutación.• Se define como el cambio de estructura primaria en el

material genético, heredable a la trascendencia y no se debe a fenómenos de recombinación.

Características de las mutaciones

1. Especificidad: cada mutación afecta a uno carácter determinado.

2. Adaptación. Capacitan al microorganismo para adaptarse a cambios en el medio.

3. Mecanismos de reparación. Producen cambios complementarios a la 1era mutación.

4. Taza de mutación: Frecuencia de orden de 10-7-10-10 𝐹𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑑𝑒𝑀𝑢𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛=

𝑁 ú𝑚𝑒𝑟𝑜𝑑𝑒𝑚𝑢𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑝𝑜𝑏𝑙𝑎𝑐𝑖 ó𝑛

Clasificación de los diferentes tipos de Mutación.

Clasificación

Grado de Lesión MacrolesionesMicrolesiones

Origen EspontáneasInducidas

Efecto sobre el fenotipo

Silenciosas Sentido Equivocado

Sin sentido

Mutación por grado de lesiónEn función de su magnitud, longitud o grado de lesión, permite clasificarlas en:

Macrolesiones

• Alteraciones graves en la molécula del DNA o en un segmento grande.

Microlesiones

• Alteración producida en una o pocas bases del DNA.

Microlesiones (puntuales)

Sustituciones • Transversiones• Transiciones

InsercionesDeleciones • Alteran el marco de lectura

SustituciónEs aquella mutación en la que donde debería haber una base se encuentra otra del mismo tipo.

Inserciones y delecionesEste tipo de mutación produce un corrimiento en el orden de lectura. Pueden ser:

- Adiciones génicas: Es la inserción de nucleótidos en la secuencia del gen.

- Deleciones génicas: Es la pérdida de nucleótidos.

Marcos de lectura ORF: Secuencia nucleotídica organizada en tripletes que codifica una secuencia aminoacídica de un polipéptido, incluyendo un codón de inicio y un codón de terminación.

Corrimiento del marco de lectura.

Origen Mutaciones Espontáneas• Fuente continua de alteraciones aleatorias de la

información contenida en el material genético, se producen de forma natural.

• Su frecuencia es de 10-7 a10-10 (1 en 10 millones)

Se da por:• Errores por tautomerismo.• Daño oxidativo.

Tautomerismo Los cambios tautoméricos pueden resultar en cambios en el

emparejamiento de bases, o mutaciones.

Tautomerismo en las replicaciones

El cambio de la forma normal cetónica a la forma enólica produce transiciones

Daño oxidativoRadicales libres

Las formas activas de los radicales del oxigeno, como el peróxido de hidrógeno (H2O2) y los superóxidos (O2) generan rupturas en el enlace glicosídico por la oxidación del azúcar generando sitios apurínicos o apirimidínicos .

Glicol de timidina 8-Oxo-hidrodesoxiguanisina(8-Oxo-G)

Mutación inducida Mutágeno: cualquier agente físico o químico aumenta

la frecuencia de mutación Mutagénesis: Proceso de formación de un organismo

mutante.

Agentes mutagénicos.

Físicos.

Rayos X, UV.

Temperaturas extremas.

Químicos.

Análogo de bases.

Agente desaminación.

Hidroxilamina

Alquilantes.

Intercalantes

Mutación inducida

Agentes MutagénicosFísicos

Rayos Xo Poseen un poder de penetración mas alto que los rayos UV.o Producen radicales libres de –OH hiperreactivos, responsables de la

abertura de un anillo de una base, o fracturas monocatenarias o bicatenarias en el ADN, esto puede ocasionar mutaciones por deleción.

LUZ UV Causa la unión o dimerización

de pirimidinas adyacentes en el DNA.

Hidroxilación de citosina y uracilo

Entrecruzamientos entre DNA y proteínas

Rotura de la cadena y desnaturalización del DNA

Físicos

↑ T° (37ºC) produce mutaciones puntuales en el ADN, como son: Despurinización: Pérdida de bases púricas Desaminación. Pérdida de grupos aminos de las

bases.

TEMPERATURAFísicos

DespurinizaciónSe produce la pérdida de purina en una molécula de doble cadena de DNA, se produce por rompimiento del enlace glucosídico que une al carbono 1 de la desoxirribosa a la posición 9 del anillo de purina.

Existe una ruptura del enlace glicosídico entre la base nitrogenada y el azúcar al que esta unida con pérdida de una A o una G.

Desaminación• Pérdida de grupos amino. • El U no forma parte del ADN, la glucosidasa de uracilo  se encarga de

detectar U en el DNA y retirarlo produciéndose una base apirimidínica.

Desaminantes: HNO2

GC→AT

T es una base normal en el ADN y no se retira, por tanto estos errores no se reparan.

Análogos de bases Son compuestos químicos que

pueden remplazar a una base determinada.

5-Bromouracilo (5BU) Es análogo de la Timina (T) y

puede remplazarla. Puede provocar un error tras la

replicación del DNA, es inestable y provoca transiciones .

2-Aminopurina• La 2-Aminopurina (2AP) es análogo de la Adenina (A). • La 2AP aparea con la Timina (T) pero en su forma imíno (2AP*)

empareja con la Citosina (C). • Esta alteración produce transiciones.

Hidroxilamina (HA).

(NH₂OH): Reacciona con la citosina donde el grupo amino es reemplazado por un grupo hidroxiamino. Este derivado de la citosina se aparea con adenina produciéndose transiciones GC AT.

AlquilantesEtilmetanosulfonato (EMS): produce las sustituciones: transiciones y transversiones.Nitrosoguanidina (NTG/N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina): produce transiciones y transversiones GC→TA

Intercalantes

Moléculas planas, inician la mutación insertándose en la doble hélice del DNA, provocando su deformación; provocando adiciones y deleciones en la replicación.

Colorantes de acridina

Clasificación de mutágenos por su daño, dirección y efecto

Mutágeno Clasificación Daño Dirección Efecto

Luz UV Físico Dímeros de pirimídinas Unidireccional Inserción, deleción,

sustitución

Hidroxilamina Químico Hidroxilante Unidireccional Transiciones de GC-AT

Ácido nitroso Químico Desaminante BidireccionalTransiciones de GC-AT y

trasversionesAT-CG

EMS Químico Alquilante Bidireccional Transiciones de GC-AT, AT-GC

5-Bromouracilo Químico Análogo de base Bidireccional Transiciones de GC-AT, AT-GC

Nitrosoguanidina Químico Alquilante Unidireccional Transiciones de GC-AT

ICR-170 Químico Intercalante Bidireccional Inserción o deleción

9-Aminoacridina Quimico Intercalante Bidirecccional Inserción o deleción

Mutación Silenciosa: Son cambios sutiles en las secuencias de DNA, irrelevantes en un comienzo en cuanto a la codificación proteínica.

Efecto sobre el fenotipo

Mutación sin sentido:Tiene lugar una sustitución de bases en un codón dado, en donde en vez de formar otro aminoácido distinto, se crea uno de los tres codones “stop” (UAA, UAG, UGA)

Mutación En sentido erróneoMutaciones que cambian la secuencia de un codón dado, sustituyendo una base por otra, lo que puede producir que el aminoácido codificado no sea el que se había especificado antes.

.

Mutación en sentido erróneo:Cambian la secuencia de un codón dado, sustituyendo una base por otra, lo que puede producir que el aminoácido codificado no sea el que se había especificado antes.

Mutaciones no reversibles (unidirecionales)y reversibles

(bidireccionales).

Si se trata de una mutación unidireccional no reversible, puede reemplazar al alelo del que se originó. (A1 A2) pero muy a largo plazo.

Si se trata de una mutación bidireccional reversible, se puede establecer una situación de equilibrio que depende solo de las tasas de mutación (u) y retromutación (v) (A1   A2).

Es una segunda mutación, se restaura total o parcialmente el genotipo y/o fenotipo dañado por la primera mutación.

Reversión

Verdadera: mutante que a revertido a su genotipo anterior, restauración del genotipo (ADN) silvestre. No verdadera (por supresión): reversión del fenotipo mutante al silvestre a causa de una mutación en otro lugar que suprima o compense la deficiencia de la primera

• Supresión intragénica: se produce cuando la segunda mutación se da dentro del mismo gen en que se dio la primer mutación.

• Supresión intergénica: las segunda mutación se da en un gen diferente a donde se dio la primer mutación.

Artículo:

“Hydroxilamine as a mutagenic agent por Neurospora crassa”

H. V. MALLINGBiology 3' Division,

Oak Ridge National Laboratory), Oak Ridge, Tenn. (U.S.A.)(Received June 21st, I966)

Hidroxilamina como agente mutagénico de Neurospora crassa

Neurospora crassa

o Es un hongo perteneciente a la división Ascomycota

o Es utilizado como organismo modelo por su haploidía, su ciclo de vida rápido y sencillo, y por la facilidad con la que se puede cultivar.

o Un sistema preferido para estudiar el mecanismo de la mutación es el gen ad-3, porque los mutantes ad-3 son morados y se detectan fácilmente.

La mutagenicidad de la Hidroxilamina en Neurospora crassa se probo en 8 mutantes diferentes que requieren adenina (ad-3B)

La reacción entre DNA y HA es con citocina y con RNA con uracilo

A un pH de 6.1 la reacción es mas rápida con citocina que con uracilo

HA ha sido usada para inducir daño cromosómico en células de mamíferos

No se ha podido identificar la alteración por HA en eucariotes a nivel molecular

INTRODUCCIÓN

Objetivos

Determinar la especificidad de HA para producir reversiones en mutantes dependientes de adenina.

Obtener información más detallada sobre los efectos de HA en Neurospora