MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Mycobacterium tuberculosisAgente etiolgico de la tuberculosis

HISTORIAEl hallazgo de tuberculosis evidente en los huesos de algunas momias egipcias indica que es una enfermedad antigua.

1484-1553 Francostorius lleg a algunas conclusiones sobre la naturaleza de la infeccin y su mecanismo de transmisin.

HISTORIA1865 Willemin es cuando transmiti la enfermedad del hombre a los conejos.1878 Baumgarten vi el bacilo en los tejidos infectados1882 Roberto Koch es quien aisl el bacilo tuberculoso

HISTORIA

Encontr el bacilo asociado constantemente a la enfermedadAislo en cultivo puroReprodujo la enfemedad en conejos y cobayos con el cultivoRecuper el bacilo en cultivo puro de los animales infectadosPOSTULADO DE KOCH

La tuberculosisEs una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis y, excepcionalmente, por M. bovis, Se caracteriza por la formacin de granulomas en los tejidos, Tambin puede afectar a otros rganos. El curso de la enfermedad es crnico y puede conducir a la muerte si el paciente no recibe tratamiento.

EpidemiologaExisten evidencias paleolgicas de tb en restos neolticos precolombinos y egipcios. Se convirti en un problema grave en el momento del hacinamiento en los medios urbanos asociado con la Revolucin Industrial y gener circunstancias epidemiolgicas que favorecieron su propagacin. En los siglos XVII y XVIII la Tb fue responsable de una cuarta parte de todas las muertes en adultos en Europa.

EpidemiologaLa aparicin del SIDA ha supuesto un resurgimiento excepcional de esta enfermedad en todo el mundo.

Se estima que la mitad de la poblacin mundial est infectada por M. tuberculosis, que hay 30 millones de enfermos en el mundo y que se producen al menos 10 millones de nuevos casos al ao.

Las MicobacteriasSon microorganismos de forma bacilar, que se caracteriza por: La propiedad cido alcohol resistente,La lentitud con que se desarrolla en los medios de cultivoLa exigencia de que estos medios sean altamente nutritivos para desarrollarse.Se conocen mas de 100 especies Viven en el medio ambiente

Caractersticas de la micobacterias no patgenasHan sido identificadas ms de 50 especies

Interfieren con la interpretacin en la rx de tuberculina

Interfieren con la evaluacin de la eficacia de los programas de vacunacin BCG

Pueden aparecer ocasionalmente en la expectoracin, en orina o en otras muestras orgnicas

Propiedades Biolgicas de Mycobacterium tuberculosisEs un parsito estricto, por lo cual su transmisin generalmente es directa, de persona a persona.No tiene toxinas conocidas, ---capacidad de bacteriostasis por largos perodos en el interior de las clulas.Es aerobio, lo que determina que tenga una capacidad de metabolizacin y de crecimiento muy diferentes segn la tencin parcial del oxigeno del rgano o lesin en que anida.

Es de multiplicacin lenta, factor que condiciona su tendencia a la cronicidad.Tiene una virulencia variable, que podra explicar algunas de sus caractersticas epidemiolgicas.Tiene numerosos antgenos, capaces de despertar una gran variedad de respuestas inmunolgicas en el husped, algunas de las cuales determina el caracterstico dao tisular que es capaz de producir.

Morfologia

Forma bacilarLongitud de 2-4 micras y diametro 0.2-0.5 mPared celular-lpidos (>60%) glicolpidos y protenasPresencia de ac. Miclicos tpicos, ( 78 a 90 tomos de carbono )Estos son el 50% del peso de la pared.Son muy hidrofobicos, que las hace mas virulentasPrevienen los ataques por lisozima, fagocitosis y el Complemento.

Factor Cordon forma las serpentinas, este es toxico para las clulas infectadas. Bacilos con capacidad de acidorresistencia

No esporulados , no mvilesAerobiosForman filamentos ramificadosCrecen lentamentemuy exigente en nutricin Resistencia a detergentesResistencias a los antibiticos

De importancia medica :

Mycobacterium tuberculosis: Tuberculum, Pequea tumefaccin o tubrculo, en referencia a la formacin de tubrculos en los pulmones de los pacientes infectadosMycobacterium leprae : lepra, relativo a la lepra

Mycobacterium tuberculosis

No es Gram Positivo ni Gram Negativo, es ACIDORRESISTENTE por la composicin de su pared celular.Resistente al fro, congelacinResistente a la desecacinSensible al calor, luz solar, luz UV.

Muchas micobacterias pueden formar parte de nuestra flora normal (en varias partes del cuerpo).

Mycobacterium tuberculosis

Lpidos Mycobacterium tuberculosis asociados a:Impermeabilidad a colorantes.Resistencia a los antibiticos.Resistencia a cidos y lcalis.Resistencia a lisis ( Complemento).Resistencia a oxidacin y sobrevivencia dentro de Macrfagos.

Tuberculosis Reservorios son los humanos.

Ovinos=reservorios de M. bovis

Monos, perros gatos, reservorios de M. tuberculosis complex.

Mecanismo de transmisinVa aergena.El enfermo elimina microgotas (aerosoles), al Rer, cantar, toser etc.. Bacilos llegan al alveolo en condiciones ideales: con una elevada tensin de O2

Transmisin area

Tuberculosis La dosis infectante es de 10 clulas bacterianas.Despus de 4 semanas el sistema inmune monta una respuesta celularLa gran cantidad de clulas mononucleares en pulmones forman los tubrculos caractersticos

Patogenia Las bacterias son pulsadas en gotitas de saliva, las gotitas se evaporan y por su pequeez despus de inhalados pueden ser depositados en los alveolos. El SI del husped reacciona con liberacin de citosinas y linfocinas que estimulan a monocitos y macrfagos

Las micobacterias comienzan a multiplicarse dentro de macrfagos Despus de uno a dos meses de la exposicin aparecen en los pulmones las lesiones patgenas propias de la infeccin

Lesin Tipo exudativo: Es una reaccin inflamatoria aguda, con liquido, edema, presencia de PMN y monocitos alrededor de los bacilos , la lesin en tej. Pulmonar se asemeja a un cuadro de neumona. Esta lesin puede desaparecer porque el exudado es absorbido , pero puede originar necrosis masiva de tej y transformarse en una lesin productiva

Lesin Tipo productivo: Es un granuloma crnico , comprende tres zonas: 1. una zona central de grandes clulas gigantes multinucleadas que contienen bacilos.2. una zona media de clulas epiteliodes dispuestas en forma radiada 3. una zona perifrica de fibroblastos, linfocitos y monocitos

La zona central presenta necrosis caseosa y recibe el nombre de tubrculo , este puede romperse y vaciar su contenido en un bronquio y formar una cavidad, que puede curar por fibrosis o calcificacin

Los tubrculos son granulomasQue contienen a las bacterias en el centro, grandes macrfagos y rodeados de fibroblastos, linfocitos, y neutrfilos.Puede quedarse as o hacerse necrtico caseoso y curar lentamente calcificndoseLa respuesta celular es la que se mide con la tuberculina.

*

Tuberculosis secundariaEl bacilo puede despertarse mucho tiempo despus de latencia. Aqu el bacilo se multiplica y llena los bronquios, el paciente presenta variedad de sntomas.Con mal tratamiento o sin tratamiento tiene 60% mortalidad.

Tuberculosis extrapulmonarEn la TB secundaria el bacilo puede invadir :ndulos linfticos, riones, huesos, tracto genital, cerebro, meninges y otros.

InfeccinEnfermo TB Infeccin

M.TB. PresenteTuberculina- test positivo

Rayos-X- normal

Baciloscopia y cultivo=negativo

No infecciosoTB pulmonar

M.TB. Presente Tuberculina test positivo

Rayos-X= lesion

Baciloscopia y cultivo positivos

Sntomas: tos, fiebre, perdida de peso

Infeccioso antes de tratamiento

Diagnstico de laboratorio Muestra Esputo

Microscopia

Cultivo

Sensibilidad a frmacos

Coloracin Ziehl NeelsenLas pared celular micobacteriana, tienen un alto contenido lipdico, la cual tienen la capacidad de combinarse con el colorante carbolfuscina resistiendo la decoloracin con alcohol cido.

Fucsina fenicada (CARBOLFUCSINA)Alcohol cido (HCL + ETANOL)Azul de metilenoReactivos:

Coloracin Ziehl Neelsen

Sensibilidad 50 a 80 %Es necesario 5,000 a 10,000 bacilos / ml de esputoNecesita de personal entrenadoControl de calidad

BACILOSCOPIA Informe de resultadosSe recomienda la siguiente escala semicuantitativa:

NEGATIVANo se observan BAAR en 100 camposPOSITIVO 1+ 1 BAAR / campo en 100 campos observados.POSITIVO 2+De 1 a 10 BAAR / campo en 50 campos observados.POSITIVO 3+Ms de 10 BAAR / campo en 20 campos observados.

CULTIVO DE MYCOBCTERIUM TUBERCULOSIS

Medios de cultivoMedios a base de huevo :Lowestein JensenStonebrinkOgawa Kudoh

Medios semisintticos:7H107H97H11

Se puede aislar en al menos dos medios de cultivo: -Middlebrook's medium

-Lowenstein-Jensen medium las colonias se observan a las 4-6 semanas

Mycobacterium tuberculosisCrecimiento aerobio a 37 C, 6 semanas.

LECTURA E INFORMEEl desarrollo de M. Tuberculosis generalmente aparece luego de 2 a 3 semanas. Las colonias tpicas son de color crema, secas, rugosas de aspecto de coliflor y de borde irregular

La Pared celular posee peptidoglicanos pero en su mayora compuesta por lpidos ( especial entre Procariotas)

El 60% son lpidos

cidos Miclicos (nicos de micobacterias y corinebacterias)

Lpidos Mycobacterium tuberculosis asociados a:Impermeabilidad a colorantes.Resistencia a los antibiticos.Resistencia a cidos y lcalis.Resistencia a lisis ( Complemento).Resistencia a oxidacin y sobrevivencia dentro de Macrfagos.

IMPORTANCIA DEL CULTIVOLa importancia radica en aislar a M. tuberculosis a partir de muestras de escasa cantidad de bacilos en pte con sospecha de tuberculosis y radiografa anormal, a fin de identificar la cepa y realizar las pruebas de sensibilidad a los medicamentos antituberculosos.

Aspectos generales e indicaciones del cultivoEn el dx diferencial de tubeculosis pulmonar de sintomticos respiratorios con dos baciloscopas negativas y cuadro clnico radiolgico sospechoso.Dx de TBC infantil baciloscopas negativaDX de tuberculosis extrapulmonar.Para estudios de sensibilidadEn pacientes HIV positivas/SIDA

Aspectos generales e indicaciones del cultivoPacientes multitratados con persistencia de baciloscopa positiva.En muestras de escasos bacilos (1-9 BAAR en ms de 100 campos observados)Para estudios epidemiolgicos de resistencia primaria y secundaria a M. tuberculosis

LECTURA E INFORME

- (negativo) No se observan coloniasNo...Nmero total de colonias si < de 20+De 20 a 100 colonias++Colonias separadas ms de 100+++Colonias confluentes (desarrollo en toda la superficie del medio)CC Cultivo contaminado

OTRAS TECNICAS DIAGNOSTICAS DE TUBERCULOSIS

OTRAS TECNICAS DIAGNOSTICAS DE TUBERCULOSISMtodos de cultivo radiomtrico (BACTEC)Mtodos qumicosDeteccin de anticuerposDeterminacin de antgenos bacterianosMtodos de recombinacin de los c nucleicos.

Tcnicas inmunolgicas

Identificar Acs dirigidos contra antgenos especficos de la micobacterias (ELISA)Deteccin directa de Ags micobacterianos en suero o secreciones*Mtodos serolgicos

vacunaDisponible la vacuna contra la tuberculosis.La BCG bacilo de Calmette GuerinRecomendada a pases en desarrollo.BCG

Drogas para tratamiento de TB Isoniazida, rifampicina, pirazinamida, y ethambutol. Estreptomicina (no en foto) se inyecta segn el CDC.

Prevencin y controlHigieneBuenas condiciones de vivienda, alimentacin y seguridad social-econmica.

Gracias!

Coloracin Ziehl NeelsenCubrir el frotis con fucsina cida y calentar la lmina hasta obs. desprendimiento de vapores por tres veces.(tiempo min 5 minutos)Lavar con agua corrienteDecolorar con alcohol cido x 2 min.Cubrir con azul de metileno durante 1 min.Lavar con agua y dejar secar al aireObservar la microscopio 100x

Procedimiento:

TINCION DE KINYOUNNo utiliza el calor para favorecer la captacin de la fucsina fenicada.

Tincin fra, tcnica igual que ZN

TINCION CON FLUOROCROMOSSe basa en el mismo principio de coloracin de ZN, se observa fluorescencia amarilla naranja cuando se observa en campo oscuroEs una tcnica rpida,recomendable para laboratorios que tienen grandes cantidades de muestrasEl los casos en que la morfologa de los bacilos encontrados por es esta tecnica es cuestionable se debe repetir con ZN para disminuir falsos positivos.

Recoleccin de muestraExpectoracin (esputo) : proveniente del arbol bronquial, recogida despus de un esfuerzo de tos.Se solicitan tres muestras debido a que la elimacin del bacilo es variable.Orina: Se solicita la totalidad de la primera miccin de la maana. Se sugiere cultivar por lo menos tres muestras seriadas.

Recoleccin de muestraSecreciones: Las muestras se extraen con hisopos estriles, enviandose dentro de un tubo estril y con el otro se realiza un frotis para coloracin ZNBiopsias:La obtencin lo realiza el mdico.Se extrae fragmentos de tejido a estudiar se deposita en un vial estril sin conservadores. Conservar en refrigeracin.

Procesamiento de la muestraLas muestras obtenidas aspticamente, puede cultivarse prescindiendo de la descontaminacin:-Muestras obtenidas por puncin: LCR, pleural, peritoneal, articular. Se centrifuga y se siembra el sedimento. - Materiales de biopsia pleural, heptica y ganglionar: se fraccionar con instrumento quirrgico estril en una mortero de porcelana estril se agrega una suspensin de agua estril y se siembra en el medio de cultivo.

Procesamiento de la muestraLas muestras contaminadas: esputo, orina, contenido gstrico, entre otras, deben ser descontaminadas antes del cultivo.Se debern centrifugar al volumen total a 3000 3500 RPM durante 20 a 30 min.Eliminar el sobrenadante, descontaminar y sembrar.

Procesamiento de la muestraLa descontaminacin se realiza con hidrxido de sodio (NaOH) al 4%, soluc acuosa estril.

Objetivo: eliminar la flora asociada a M. Tuberculosis, cuyos grmenes se multiplican ms rpido que el bacilo. Tambin para homogenizar la muestra especialmente el esputo a fin de liberar al bacilo del mucus, material celular y tejidos.

Medios de cultivoMedios a base de huevos: Se obtiene medios ricos en lpidos por la que la micobacteria tiene especial preferencia.Estn constituidos por: -soluciones reguladoras a base de fosfatos, -cationes en muy bajas concentraciones -una fuente de carbono (glicerol) -otra fuente de nitrogeno (asparagina)-Lowestein Jeinsen -o una fuente de ambos elementos (piruvato) medio de Stonebrink -verde de malaquita como descontaminante

Medios de cultivoMedios semisintticos de aislamiento y subcultivoEl medio basal est constituido por elementos inorgnicos, glicerol o glucosa, aminocido (digerido anzimtico de casena) y asparagina.Acidos grasos de cadena larga (ac. Olico por ejemplo) Seroalbumina previene que el ac. Olico alcance concentraciones txicas.

Lowestein JensenSolucin de sales: --fosfato monopotsico -sulfato de magnesio -citrato de magnesio -L-asparagina -glicerina bidestilada Suspensin de huevos enterosSolucin acuosa de verde de malaquita al 2%

Medio ogawaSolucin de sales: -fosfato monopotsico -glutamato de sodio -glicerol -agua destilada -glicerina bidestilada Suspensin de huevos enterosSolucin acuosa de verde de malaquita al 2%

CULTIVO EN MEDIO OGAWA ACIDIFICADOColocar en un tubo 1 ml de muestra de esputo o todo el sedimento obtenido por centrifugacin. Agregar 4 ml de solucin estril de NaOH al 4%.Dejar a 37C x 20 min en estufa o BMNeutralizar Homogenizar la muestra con un pipeta e inocular 0.1 ml en 2 tubos de medio de ogawa, baando toda la superficie del medio.

CULTIVO EN MEDIO OGAWA ACIDIFICADOColocar los tubos en bandejas de fondo inclinado e incubar en estufa a 37CDespus de 48h revisar los tubos y ajustar las tapas.Verificar si algn tubo est contaminado:Alcalinizado (color blanco amarillento) o acidificado(color azul oscuro) por mala neutralizacin de la muestra.El desarrollo de colonias antes de las 48h es indicativo de contaminacin, aveces el medio se licua por accin de grmenes proteolticos.

LECTURA E INFORMELas lecturas se realizarn durante la incubacin a los 7, 30 y 60 dasLas colonias no tpicas se hace frotis y coloracin ZN , si es BAAR se envia el cultivo para su tipicacin.

TIPIFICACION DE MICOBACTERIASLa preclasificacin segn Runyon, en la que se investiga velocidad de desarrollo y la produccin de pigmentos.Se completa con las pruebas bioqumicas.

Clasificacin de micobacterias segn RUNYON

PRUEBAS BIOQUMICASSe fundamenta en la capacidad que tienen algunas especies de micobacerias de transformar un producto en otro diferente mediante la accin de enzimas.

Pruebas bioqumicas

PRUEBA DE LA NIACINAPermite identificar a las especies que carecen de la enzima que transfoma la niacina en niacina ribonucletide, acumulandose por tanto en el medio (positivas). Esta niacina es un producto metablico que forman las bacterias.Reactivos . -Bromuro de ciangeno 4-10% -solucin alcohlica de bencidina o anilina al 4%

PRUEBA DE LA NIACINAEn un cultivo abundante se agrega 1ml agua dest ,se deja en reposo minimo 15 min, luego se extrae el lquido con una pipeta a otro tubo donde se le agrega 0.5 ml de cada rvo.Reaccin positiva: aparece de inmediato una coloracin violcea (bencidina) o amarilla(anilina)

PRUEBA DE NITRATO REDUCCIONPermite identificar a especies que contienen la enzima nitroreductasa.Se realiza en cultivos que tengan menos de 1 mesReactivos:-sol.acuosa 0.01M de nitrato sodio 0.085% -reactivo de Griess

PRUEBA DE NITRATO REDUCCIONEn un tubo se mezcla 4 gotas de agua dest con 10 mg de masa bacilar,se agrega 10 ml de solucion de nitrato de sodio y se incuba 2 horas a 37C. Luego se agrega el reactivo de Gries 0.2 ml de A y B se agitar y leer inmediatamente.

PRUEBA DE NITRATO REDUCCIONLectura:reaccin positiva: coloracin rojaReaccin dudosa: coloracin rosadaReaccin negativa: sin coloracin o rosa plido.

Realizar dos controles uno en un tubo con el sustrato solamente (negativo) y otro con cultivo joven de M. Tuberculosis (positivo)

PRUEBA DE HIDRLISIS DE TWEEN 80Permite diferenciar a micobacterias que hidrolizan el Tween80 mediante la enzima lipasa en cido olico y sorbitol polioxietilado sorbitan.

Reactivos:tween 80, rojo neutro y solucin reguladora de fosfato Ph 7

Tween 80, nombre comercial del detergente monoeleato de polioxietilen sorbitan

PRUEBA DE HIDRLISIS DE TWEEN 80Se suspende en el sustrato colonias de cultivo joven en medio slido. Incubar a 37C, sin contacto con la luz, no ms de 2 semanas.Leer a los 5 y alos 10 dasEs positivo si hay un cambio de color de ambar a rosa salmn, el color puede intensificarse a rosado ms intenso y hasta rojo neutro.Informar positivo a los 5 das o positivo a los 10 das.

PRUEBA DE LA CATALASA 68CLa catalasa es una enzima producida en cantidades variables, descompone el H2O2 en agua y oxgeno libre. La semicuantificacin y la suceptibilidad al calentamiento son tiles para identificar a las micobacterias.

PRUEBA DE LA CATALASA 68CReactivos:- agua oxigenada 110 vol (H2O2 al 30%) -Solucin reguladora de fosfto pH 7 -Tween 80Distribuir la sol reguladora 0.5 ml en tubos y agregar una asadita cargada de colonias tomadas de un cultivo joven. Colocar el tubo en bao de agua termoregulado a 68C x 20 min. Agregar al tubo o.5 ml de mezcla de sol. Tween y agua oxigenada.

PRUEBA DE LA CATALASA 68CLectura: observar formacin de burbujas en a superficie. Obs 20 min antes de informar resultados negativo.

Tcnica de cultivo radiomtrica (bactec)Tiene alta sensibilidad y especificidad que los mtodo tradicionalesPermite el dx de tuberculosis en menos de 1 sem en el 95% de los casos tambin util para realizar sensibilidad de la cepa y obtener resultados en pocos dasAyuda en la diferenciacin de otras especies de micobacterias.

Tcnica de cultivo radiomtrica (bactec)Medio de cultivo Middlebrook enriquecido. Medio rico en ac. Palmtico con carbono 14 (istopo radioactivo)Las micobacterias vivas metabolizan los ac. graso con C14,libran el isotopo en forma de CO2 marcado con C14 al medio ambiente , de donde es aspirado y llevado a una cmara ionizante y transformado en una corriente elctrica proporcional a la cantidad de bacilos.

Tcnicas Qumicas*determinacin de constituyentes micobacterianos:Acidos miclicos en LCR.Acido esterico en secreciones. Actualmente se utiliza HPLC,la cual detecta cantidades infimas de sust quimicas, capaz de aumentar la seal a 1 millon de veces. medicin en pocas horas..

Tcnicas Qumicas

Medicin de la actividad de la enzima adenosina deaminasa (ADA) Enzima proveniente del metabolimo de las purinas que se encuentra en exudados proveniente de pleuresia, pericarditis, peritonitis y meningitis tuberculosas.*Determinacin de derivados del metabolismo de la enfermedad tuberculosa:

Tcnicas inmunolgicas

Identificar Acs dirigidos contra antgenos especficos de la micobacterias (ELISA)Deteccin directa de Ags micobacterianos en suero o secreciones*Mtodos serolgicos

Tcnicas inmunolgicas

Deteccin de secuencias especiales de ADN o ARN micobacteriano en expectoracin u otras muestras orgnicas.

Se busca nuevos marcadores de la aciv. Tuberculosa. Es prometedor la medicin de interluquina 2 en cual se encuentra elevado en granulomatosis y otra enf que activan los linfocitos T*Mtodos de recombinacin gentica de acidos nucleicos-clonacin-hibridacin

LOCALIZACION

TRANSMISIN