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Director de Área
“Nuevas estrategias para el control y
prevención de las enfermedades transmitidas por vector (ETVs)”
Dr. Cuauhtémoc Juan Humberto Lanz
Mendoza
Políticas e intervenciones en salud pública
CISEI
Instituto Nacional de Salud PúblicaNuevas estrategias para la prevención y Control de las
Enfermedades Transmitidas por Vectores
Dr. Humberto Lanz Mendoza
IMMPRESS Magazine.
Department of immunology. University of Toronto
1. Generalidades de la línea de
ETVs.
2. Mosquitos transgénicos.
3. El uso de Wolbachia para
interrumpir la trnasmisión.
4. ¿Vacunación en mosquitos?
5. Conclusión
Problema eje– Dificultades para la prevención y control de las ETVs en áreas endémicas y
y residuales de transmisión.
– Desconocimiento de los factores determinantes de la persistencia de la
transmisión.
– Necesidad de nuevas estrategias para la prevención de las ETVs que sean
amigables con el medio ambiente y costo-efectivas.
– Necesidad de adecuar las intervenciones de prevención y control a la
estructura eco-social y cultural de las comunidades afectadas
– Se requieren actividades dirigidas para inducir la participación comunitaria
en las actividades de control
– Necesidad de establecer mecanismos de vigilancia epidemiológica eficaces
– Ausencia a múltiples niveles gubernamentales y científicos de una visión
estratégica a largo plazo para fomentar la generación de conocimientos
sobre la ETVs.
• Justificación (relevancia)• Existen áreas en donde las medidas tienen efecto limitado.
• El decremento del control ocasiona un repunte de la
endemia y son fuente de brotes epidémicos
• Los factores condicionantes de esta situación no han sido
identificados.
• La percepción sobre estas enfermedades y su control y los
determinantes socioculturales de la interacción con el
personal operativo del Programa de Control requieren de
mejores estrategias.
Objetivo general
• Proporcionar nuevas estrategias de control de
las ETVs en base a:
– Desarrollo de nuevas estrategias de vigilancia
epidemiológica
– Desarrollo de nuevos métodos de control
– Desarrollo de nuevas estrategias de prevención
Obtener
información sobre
el parásito, el vector, el humano
y sus interacciones
Desarrollar
y evaluar
estrategias
comunitarias
Re-evaluar los
métodos de control
y establecer
alternativas
Interacción
vector-agente
causal
Obtener
información sobre
el parásito, el vector,
el humano y sus
interacciones
Desarrollo de vacunas
bloqueadoras de la
transmisión.
Identificación de las
moléculas que permiten
la transmisión de los
parásitos en sus vectores
Determinantes
moleculares y
ecológicos para la
transmisión las
ETVs
Evaluación del
diagnóstico y
tratamiento de
ETVs.
Análisis de las regiones
reguladoras de los genes
involucrados en la respuesta
inmune del los vectores
Desarrollo,
Implementación y
evaluación de pruebas
de diagnóstico
(humanos e insectos
vectores) para ETVs
Re-evaluar métodos
de control y
establecer alternativas
Obtener
información sobre
el parásito, el vector,
el humano y sus
interacciones
Desarrollar y
evaluar
estrategias
comunitarias
Re-evaluar los
métodos de control
y establecer las
alternativas
Bionomia de
mosquitos e
incriminación de
vectores
Evaluación
y manejo de
insecticidas
y agentes
alternativos de
control
Participación
comunitaria y
promoción
social
Interacción
vector-agente
causal
META A LARGO PLAZO
Sistemas de vigilancia y
control en áreas con
transmisión recurrente y
evaluación de nuevas
estrategias comunitarias
para la prevención de las
ETV’s.
META A MEDIANO PLAZOConocimiento actualizado
sobre la interacción parásito-
vector-humano y el ambiente
en áreas con transmisión
recurrente para recomendar
cambios y optimizar los
métodos de control.
Estrategias de vigilancia y control de
transmisión no-vectoriales.
Aspectos económicos de la enfermedad
IMMPRESS Magazine.
Department of immunology. University of Toronto
1. Generalidades de la línea de
ETVs.
2. Mosquitos transgénicos.
3. El uso de Wolbachia para
interrumpir la trnasmisión.
4. ¿Vacunación en mosquitos?
5. Conclusión
Desarrollo de mosquitos transgénicos
Dr. Humberto Lanz Mendoza CISEI
Dr. Raúl Noguez Moreno CISEI
Dr. Enrique Merino Pérez. IBT UNAM
Dr. Ildefonso Fernández Salas CRISP
Desarrollar una vacuna que evite la invasión del
patógeno en el intestino del mosquito.
Desarrollar mosquitos transgénicos con genes tóxicos
que confieran resistencia a la infección con Plasmodium
y dengue.
Nuevas estrategias para bloquear el desarrollo del
patógeno en el mosquito.
Aumentar el conocimiento de la biología de los
patógenos en el mosquito.
Identificar moléculas clave en el desarrollo de los
patógenos.
Identificar componentes clave de la respuesta inmune
del mosquito que elimine a los patógenos de la malaria
y el dengue.
Generar tecnología para prevenir la transmisión de
enfermedades por mosquitos.
PARA CUMPLIR ESTOS OBJETIVOS NECESITAMOS:
Vector del Dengue.
• Mosquito Ae. aegyptise asocia muy estrechamente con los humanos.
• Recipientes artificiales en gran medida sus más importantes lugares de cría.
• Distribuida en el mundo, generalmente dentro de los límites de los 45° de latitud Norte y de los 30° de latitud Sur.
ano
sistema
circulatorio
oviducto
glándula
s
salivales
intestino
Intestino
posterior
probosis
cerebro
tubos de
Malpighi
tráqueas
corazón
Dibujo: Raúl Noguez Moreno
Aedes aegypti
Virus dengue
Intestino
medio
• Siguiendo la ingestión de una alimentación sanguínea (A) todos los patógenos entran en el intestino medio (B). Los virus entran a las células epiteliales del intestino (D), se replican, salen de las células, y viajan a través de la hemolinfa que se encuentra en el hemocele (E) a las glándulas salivales (H), donde se vuelven a replicar y permanecen hasta ser introducidos a un hospedero vertebrado .
TRANSMISION BIOLÓGICA DE
ARBOVIRUS.
The origin of the bacterial immune response. Martínez-Borra et al 2012.
En : Self and nonself ed López-larrea C.
CAS9-gRNA COMO HERRAMIENTA PARA LA INTEGRACIÓN DE LOS
ELEMENTOS DE TRANSFORMACIÓN EN LA GENERACIÓN DE MOSQUITOS
TRANSGENICOS
P RDL tTAVP2
rel EtetO
RNA2CAS9
gfp
PROMOTOR
ESTADIO
ENBIONARI
O
PL/a
Expresión n el
cuerpo
PROMOTOR
ESTADIO
ORGANO
ESPECÍFICO
Suicida = disminución
del vector
Recombinación
sitio específica de
la construcción
CAS9-gRNA como estrategias de generación de mosquitos transgénicos de
Aedes aegypti
Construcción genéticaCAS9SECUENC
IA SEÑAL
NÚCLEOPnosCAS9nos pgRNA
gRNA
Cromosoma
de A.
aegypti
PURPOSE
Expresses Cas9 under control of
nanos promoter and 3'UTR. For germ
line restricted genome engineering in
Drosophila melanogaster.
DEPOSITING LAB Simon Bullock
PUBLICATION
Port et al Proc Natl Acad Sci U S A.
2014 Jul 7. pii: 201405500.
SEQUENCE INFORMATION
Depositor Sequences: Full (1)
Addgene Sequences: Partial (4)
El plásmido pnos-CAS9-nos expresa la proteína CAS9 en sistema de insectos
En general se pueden hablar de dos modelos
El modelo de sustitución de población
(resistente).Supresión poblacional
Desarrollo modelo de Aedes aegypti
transgénicos para reducir las poblaciones.
Suicida = Supresión
poblacional
P SyR a tTAVP2
Letal tetO gfp
tTA Promotos
Sry AlfaP-M
RNApol II
relE PL7a GFP
PAS-TER PAS-TER PAS-TER
Promotor de
Fase
embrionaria
OP
TC
Estrategia Molecular para el control poblacional de Insectos.
(Dominante letal de dos componentes
MuerteSobrevivencia
Selección del Mosco
transgénico verdes
fluorescentes
Modulo efector Marcador genético
Fase
embrionaria
sin tetraciclina
Fase
embrionaria
con tetraciclina
Desarrollo de Aedes aegypti transgénicos
para reducir bloquear la replicación del
DENV, en Chiapas, sur de México.
Antiviral = Resistencia Sustitución poblacional
SCORPINACP/AAPP PL7a
Promotores de
glándulas de intestino
y salivales
Efector
Promotor
constitutivo
Marcador genético
SECUENCIA DE CONTROL PERFIL DE EXPRESIÓN TIPO DE
EXPRESIÓN
PROMOTOR SEXO TEJIDO TEMPORALID
AD
PL7a INDISTINTO METABOLICAMENTE
ACTIVOS
CONSTITUTIV
O
ACTINA5 (Citoesqueleto de
actina)
MACHOS/HEM
BRAS
TODOS LOS
TEJIDOS
CONSTITUTIV
O
AgCP (Carboxipeptidasa) HEMBRAS INTESTINO MEDIO ORGANO
ESPECÍFICO
AAPP Anopheles Anti-
Platelet Protein
(Proteína anticoagulante)
HEMBRAS GLANDULAS
SALIVALES
ORGANO
ESPECÍFICO
Syr a (Factor de
transcripción de fase
embrionaria)
MACHOS/HEM
BRAS
NO DETERMINADO EMBRIÓN
Marcado
r
genético
Expresión
específica de
péptidos
antimicrobianos
Moscos
suicidas
CLONACIÓN DE PROMOTORES PARA LA EXPRESIÓN DE GENES EN Aedes
Construcción de plásmidos para la generación de
moscos transgénicos resistentes a virus dengue
BamHI
oriscorpinaPAS-TER
p1Del-Scorpine
(Sin 6His)
BamHI
oriGFP PAS-TER
PL7a
scorpine
pRN218
PCp/AAPP
BamH I
PAS-TER
Corte y
empalme
PmeI
GFP PAS-TER
PVAC
Sal I
Sal I
pMIBV5HisBoriPAS-TER
XbaI
scorpina
NotI
BamH I
NotI
Xb
aI
NotI XbaI
BamHI
oriGFP TER
PL7a Promotor de
proteína ribosomal
scorpine
pRN218
BamH I
TER
NotIXbaI
PCp Promotor
de
Carboxipetidasa
AAPP Promotor
de Pirasa
Elemento de transformación para generar
mosquitos resistentes de A. aegypti a virus
dengue
Modulo efector Modulo marcador genético
Secuencia de fusión
péptido de secreción
BamHI
GFP TERscorpine
pRN218
BamH I
TER
NotIXbaI
Modulo efector Modulo marcador genético
20 bases locus A.
aegypti
(sitio de recombinación)
20 bases locus A.
aegypti
(sitio de recombinación)
CP AAPP
a) b)
c)
Figura 2. Expresión de EGFP en larvas de Aedes aegypti transformadas. GFP positivas (a) y no
transformadas (b) larvas de mosquito.
8 kDa
1 2 3
Figura. 3.- Ensayo de transferencia Western de larvas de mosquito
transformadas y no transformadas. Carril 1, escorpina nativa purificado
del veneno del escorpión africano; carril 2, extracto proteico de larvas
transformadas; carril 3, extracto proteico de larvas no transformadas.
P RDL tTAVP2
rel EtetO
RNA2CAS9
gfp
SCORPINA
P
CP/AAPP
PROMOTOR
ESTADIO
ENBIONARI
O
Pax6
EXPRESIÓN
EN OJOS
PROMOTOR
ESTADIO
ORGANO
ESPECÍFICO
1)
2)
Antiviral = resistencia
Suicida = disminución
del vector
Recombinación
sitio específica de
la construcción
CRISPR-CAS9 como estrategias de generación de mosquitos transgénicos de
Aedes aegypti
Construcción genética
CAS9SECUEN
CIA
SEÑAL
NÚCLEOPnosCAS9nos pgRNA
gRNA
Resumen
1) Se desarrollaron las herramientas para la generación de mosquitos
transgénicos para la expresión de diferentes efectores para
reducir las poblaciones de mosquitos o para evitar las transmisión
de virus.
2) Se requiere establecer las condiciones más adecuadas de
transformación.
3) Se caracterizarán diferentes líneas transgénicas donde se evaluarán
la inserción eficiente y la expresión de los efectores.
4) Es posible transferir esta tecnología al sector salud.
IMMPRESS Magazine.
Department of immunology. University of Toronto
1. Generalidades de la línea de
ETVs.
2. Mosquitos transgénicos.
3. El uso de Wolbachia para
interrumpir la transmisión.
4. ¿Vacunación en mosquitos?
5. Conclusión
Wolbachia
• Wolbachia es α-proteobacteria– Decendiente del grupo de bacterias gam negativas
• Relacionada a mitocondria– Que se fusiono a los ancestros eucariotas hace aproximadamente 2 mil millones de años
• Es una bacteria endosimbionte obligada de artrópodos y nemátodos (no se puedecultivar)– Forma parte del dominio de eubacterias
• Se encuentra en tejidos reproductivos y se hereda verticamente a través del citoplasma unicamente de la madre.
• Estudios con marcadores moleculares indican que hay transferencia vertical intra e inter especie.
• Genoma secuenciado (1,060,850 bp) con 961 genes que codifican
para proteinas.
• No se pueden cultivar.
• No hay herramientas genéticas para su manipulación
• Baja infectividad de insecto a insecto, pero se transmite a través de
procesos sexuales a la descendencia
• Poco estudiados.
Wolbachia como modelo de estudio.
Wolbachia se hereda como un organélo (herencia citoplásmica o materna)
Virtualmente
solo hereda el
núcleo
Hereda además del núcleo
todo lo se encuentra el
citosol (mitocondria, pe
Wolbachia).
El uso de Wolbachia como programa para el control de moquitos
Liberación contínua de
mosquitos machos con
Wolbachia.
Aún no no se conoce el mecanismo
genético que controla la IC Por lo
cual no se ha desarrollado esta
tecnología.
a) La transferencia horizontal puede
afectar otros organismo benéficos.
b) Hay reportes La refractavilidad contra
un virus (dengue, pero se ha encontrado
que genera una mayor factibilidad de
infección contra otro (fiebre amarilla).
Desventajas
IMMPRESS Magazine.
Department of immunology. University of Toronto
1. Generalidades de la línea de
ETVs.
2. Mosquitos transgénicos.
3. El uso de Wolbachia para
interrumpir la trnasmisión.
4. ¿Vacunación en mosquitos?
5. Conclusión
Memora inmunitaria en
mosquitosObjetivo:
• Estudiar una posible inducción anticipatoria de la respuesta
inmunitaria de Anopheles albimanus contra Plasmodium berghei y
de Aedes aegypti contra virus dengue
Infección de Anopheles albimanus con
Plasmodium berghei
Infección de Aedes aegypti con
Virus dengue y bacterias.
Isabel Salazar y cols. BMC Microbiology
2007. 7: 1.-13
Resultados
Oo
cy
sts
nu
mb
er
Short time period Long time period
0
5
10
15
20
25
30
35
Control Priming Control Priming
Prevalencia Periodo corto: Priming 32.66% Testigo 76%
Prevalencia periodo largo: Priming 37.03% Testigo 91.3%
χ2 = 483.6, d.f. = 1, P < 0.0001
(Log-Rank test, χ2 = 32.8, P < 0.0001.
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
0 5 10 15 20 25 30 35
Control
Priming
Mosquitoesage (d)
Cu
mu
lative
su
rvia
l
Secondchallenge
Supervivencia de mosquitos con “priming”.
Expresión de péptidos antimicrobianos durante el priming
a
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 6 12 18 24 48 8 d 0 6 12 18 24
Re
lati
ve
Ex
pre
ss
ion
(X P
.b./
Xn
.i.)
Attacin
Cecropin
Gambicin
b
-10
0
10
20
30
40
50
60
0 6 12 18 24 48 8d 0 6 12 18 24
Re
lati
ve
Ex
pre
ss
ion
(X
P.b
/X n
.i.)
First challenge Second challenge
Intestino
Tejido abdominal
Costo del priming en la oviposición
Parasites number
Control Priming Control Priming
With eggs Withouteggs
Para
sit
es n
um
ber
Parasites number
Control Priming Control Priming
With eggs Withouteggs
Para
sit
es n
um
ber
Métodos de control
de Insectos
Ventajas Desventajas
Químico 1) Efectividad alta
2) Baratos
3) Fácil aplicación
1) Generación de resistencia
2) No hay especificidad (dañan insectos benéficos).
3) Contamínate en el ambiente,
4) Potencialmente teratógenos y carcinógenos.
Wolbachia 3) Podría ser relativamente baratos. 1) Son obligadamente intracelulares, por lo que no se pueden cultivar fuera de las
células del huésped.
2) No hay herramientas genéticas para manipular este organismo.
4) Baja Infectividad de insecto a insecto; pero se trasmiten a través de los procesos
sexuales a la descendencia
Se requiere la liberación de mosquitos infectados.
5) No son específicos (pudiendo perjudicar especies importantes y generar un
desequilibrio ecológico).
2) Poco estudiados.
3) La protección contra un tipo de virus o patógeno no protege contra otro, o puede dar
mayor susceptibilidad.
Genética Clásica Programas de este tipo han funcionado para el
control de población de insectos.
1) Requiere de infraestructura para la generación de esterilidad de mosquitos.
2) Se requieren estudios de optimización del proceso de esterilización de mosquitos.
3) Genera residuos radioactivos contaminantes.
4) Se requiere de personal altamente especializado en la producción de mosquitos
estériles.
5) Impacto negativo en la salud del personal expuesto a la radiación.
6) Altamente costoso.
Mosquitos transgénicos 1) Puede evitar la diseminación del patógeno o
disminuir o del mosquito.
2) Podría ser la estrategia para exterminar una especie
de mosquito peligrosa para la humanidad.
1) Se debe de comprar o desarrollar la tecnología propia.
2) Se deben de liberar constantemente para generara la refractabilidad a patógenos o
para disminuir la población de insectos,; por que la población transgénica tiende a
desaparecer.
3) Muchos de los modelos transgénicos no han sido probados en campo y muchos de
ellos están en alguna etapa previa de desarrollo.
Dr. Rául Noguez Moreno
Tipos de Control Biológico (Ventajas y desventajas).
TIPO DE
CONTROL
GENÉTICO
SUBTIPO DEFINICIÓN REQUERIMIENTOS VENTAJA DESVENTAJA
I) Control
Genético clásico
de insectos
Tecnología del Insecto
Estéril (SIT Steril Insect
Techology)
La genética clásica utiliza
mutaciones inducidas para generar
esterilidad o disminuir su
capacidad reproductiva
Instalaciones especiales para el uso
de radioactividad
Ha sido probada su
efectividad en diversos
insectos.
1) Es muy costoso respecto a
otras tecnología genéticas
Se generan desechos
radioactivo.
2) Se exponen los seres
humanos involucrados en el
proceso.
3) Se debe de liberar
constantemente mosquitos
irradiados.
4) Se debe de optimizar la dosis
de radiación para tener el
óptimo de esterilidad/viabilidad
y competitividad sexual.
II) Mosquitos
transgénicos
a) Mosquitos refractarios Mosquitos que expresan un
péptido o proteína que evita la
infección del mosquito por el virus
o patógeno.
1) Efector antiparasitario y viral
2) Expresión órgano o tejido
específico
1) Evita la diseminación del
patógeno
2) No extermina a una
especie.
No presenta ventaja
reproductiva.
b) Dominante Letal de
Uno y Dos Componentes
Mosquito que en el que porta un
gen que en el contexto herocigoto
despliega el fenotipo letal.
1) Requieren de un gen letal.
2) El gen letal debe ser fuertemente y
específicamente regulado para
expresarse durante el desarrollo del
mosquito y en el medio ambiente.
1) Disminuye la población
del insecto.
2) Teniendo Líneas
transgénicas se pueden
reproducir en el laboratorio a
un coste mas bajo que la
estrategia SIT, y menos
elaborado.
1) Se debe de comprar o
desarrollar la tecnología propia.
2) Se deben de liberar
constantemente para disminuir
la población de insectos, por
que la población transgénica
tiene a desaparecer.
c) Fenotipo Sin vuelo Insectos incapaces de volar por un
defecto en la musculatura de las
alas.
1)Expresión de una versión del gen
de actina mutante órgano o tejido
específico.
1) Evita la diseminación del
mosquito.
Disminuye la población del
insecto.
1) Se debe de comprar o
desarrollar la tecnología propia.
2) Se deben de liberar
constantemente para disminuir
la población de insectos, por
que la población transgénica
tiene a desaparecer.
d) Gene Drive
(Genéticamente Dirigido;
GD).
Es la práctica de "estimular una
herencia predispuesta o sesgada de
genes particulares para alterar
poblaciones enteras”.
Se requiere de usar un gen egoísta o
el sistema de CRISPR-CAS9 para
favorecer el sesgo genético.
Requiere de un gen efector o blanco
para el control del patógeno o
favorecer incremento de su frecuencia
genética.
1) Favorece su permanencia y
sustitución de poblaciones.
2) Requiere de mucho menos
insectos liberados para
disminuir una población.
3) Podría ser la estrategia
para exterminar una especie
de mosquito peligrosa para la
humanidad
No han sido probados en
campo y muchos modelos de
GD están en alguna etapa
previa de desarrollo.
Tipos de Control Genético (Requerimientos, Ventajas y desventajas).
Dr. Rául Noguez Moreno
Para la elaboración de constancias,
favor de enviar lista de
participantes presenciales con:
Lic. Reina Norma Espíritu Bolaños
Videos y presentaciones anteriores en:
http://www.espm.mx
-Videoconferencias
https://www.facebook.com/espm.insp