Nuevas técnicas de detección de poblaciones minoritarias en

infección por VIH: posibles usos y limitaciones

Rafael Delgado

Laboratorio de Microbiología Molecular

Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid

VIH: Mutaciones de Resistencia

• VIH evoluciona rápidamente: – Alta replicación– Alta tasa de mutación

• Reversión a WT en ausencia de ARV: – Frecuencia de mutaciones disminuye– Pueden no ser detectadas por Secuenciación

convencional

• Mutaciones minoritarias pueden rápidamente conducir a fallo terapéutico?

Información insuficiente sobre:

• Transmisión e inicio de la infección • Relación entre resistencia y transmisión

• Consecuencias de mutaciones de resistencia de bajo nivel

• Transmisión de resistencias por naïve?

377

Secuenciación poblacional solo detecta frecuencias > 20%

Nuevas técnicas de genotipado

• PASS: Parallel Allele-Specific Sequencing

• SGS: Secuenciación de genomas individuales

• AS-PCR: PCR alelo-específica

• Pirosecuenciación: Ultra-deep sequencing

SGS/SGA:SGS/SGA: Secuenciación de Genomas ÚnicosSecuenciación de Genomas Únicos

• ConcentraciónConcentración

• RT-PCR ultrasensibleRT-PCR ultrasensible

• Dilución límiteDilución límite

• Secuenciación individual de clones Secuenciación individual de clones

• Análisis filogenéticoAnálisis filogenético

377

1/3

1/9

1/27

~ 30%+

++

++

+-

-+

++

--

--

+

SGS/SGA

AS-PCR

Mutación Frecuencia convencional vs AS-PCR

Incremento

L90M 8% → 11% +25%

M41L 9% → 17% +70%

K70R 9% → 14% +60%

K103N 19% → 20% +5%

Y181C 3% → 8% +260%

M184V 8% → 10% +23%

T215Y 17% → 20% +20%

T215F 2% → 7% +340%

Mutaciones añadidas utilizando AS-PCR

Johnson J. 14th CROI, Los Angeles 2007, #61

N=155 nuevos diagnósticos

% Total con mutaciones

% con mutaciones a NNRTI

Mutaciones primarias por Genotipado convencional

10,4 3,9

+ AS-PCR (K103N) 13,6 7,1

Mutaciones añadidas utilizando AS-PCR

Marin L at al. Reunión SEIMC 2007

13

Importancia clínica de las mutantes resistentes minoritarias de VIH-1

• Clinicamente relevantes: Johnson J. 14th CROI, Los Angeles 2007, #61

– CNA 30021/30024: EFV/3TC + ABC or ZDV

– AS-PCR para K103N , Y181C and M184V

– Fracaso Virológico en 7/9 con variantes minoritarias

– Riesgo de fracaso con variantes minoritarias x 11 (p=0.004)

• Clínicamente NO relevantes: Peuchant et al. 14th CROI, Los Angeles 2007, #666

– AS-PCR: Las mutaciones mayoritarias pero no las minoritarias modifican la respuesta a ART

Kozal et al 16th Intl HIV Drug Resistance Workshop, Barbados 2007

Respuesta al tratamiento y mutaciones minoritarias

Estudio FIRST: NRTI + (PI)/(NNRTI)/(PI+NNRTI)

Mutaciones NNRTITrat: + NNRTI:Fallo virológico a los 12 meses:

72,7% con muts28,0% sin muts

Mutaciones RTTrat: + NNRTI:Fallo virológico a los 12 meses:

59,1% con muts24,8% sin mut

Nuevas técnicas de genotipado

Experiencia Sensibilidad Coste Linkage y Filogenia

PASS ? +++ $$$ +

PiroSeq + ++ $$$ ++

SGS +++ ++ $$ +++

AS-PCR ++ +++ $ +