Aislamiento de plásmido

ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

Transformación

Transducción

Conjugación

Transferencia de material genético intercelular

Transformación

Transformación

Transducción

Conjugación

¿Existe algún mecanismo preferencial de intercambio genético?

El principal mecanismo de transferencia intercelular, que ocurre en bacterias, es la conjugación

Función codificada por plásmidos

Naturalmente:

Transformación Transducción Conjugación

• Solo determinadas cepas o especies son competentes.

• Función muy regulada: ocurre por un período breve durante el crecimiento.

• Pocos genes pueden transferirse.

• Recombinación necesaria

• No todos los fagos pueden transducir, ni todas las bacterias son transducibles.

• Los genes donadores no pueden replicarse independientemente.

• Se requiere una relación fagos entrantes:bacteriasreceptoras baja.

• Recombinación necesaria

• Transferencia eficiente y rápida.

• Expansión rápida de plásmidos conjugativos (F): generación de nuevas cepas donadoras.

• Elementos genéticos que no pueden transferirse, pueden movilizarse durante la conjugación.

• Puede no ser necesaria la recombinación.

Transformación

Transducción

Conjugación

¿Existe algún mecanismo preferencial de intercambio genético?

La transformación bacteriana es el mecanismo de elección.

Es muy útil en biología molecular. Por este mecanismo es posible la introducción de plásmidos

modificados para la expresión de genes de interés biotecnológico.

Ingeniería genética

Artificialmente:

Los plásmidos como vectores de clonación

Los plásmidos poseen diversas propiedades que los hacen útiles como vectores de clonación:

• Tamaño pequeño

• Replicación independiente del cromosoma del hospedador

• Pueden multiplicarse en gran número de copias

• Cuentan con la presencia de marcadores seleccionables

Vector clonación

Vector expresión

Entonces…. Un plásmido modificado (vector clonación) debe poseer:

1) Origen de replicación 2) Marcador de selección

3) Sitio de clonación

Clonación molecular

En la clonación molecular se aísla y se replica un fragmento de DNA.

Etapas:

• Aislamiento del gen o secuencia de interés

• Inserción del fragmento de DNA en un vector de clonación (plásmido)

• Introducción del DNA clonado en un organismo hospedador

Vector de clonación

Gen β-lactamasa

+

Clonación de la secuencia génica de la enzima β-lactamasa

Sitio múltiple de clonación

Vector recombinante

Transformación en células DH5α para mantenimiento y

replicación.

Purificación de DNA plasmidico

¿Cómo aseguramos la presencia de la secuencia de interés en el vector?

Debemos asegurar que las bacterias transformadas poseen el vector recombinante, con la secuencia de interés.

Análisis de restricción de DNA

Secuenciación de DNA

Se requiere la purificación del plásmido

Propiedad: cada método toma ventaja del tamaño pequeño, la conformación y, la propiedad de desnaturalización/re-naturalización de los plásmidos

Método de lisis alcalino

Purificación por CsCl-BrEt

Separación de ácidos nucleicos, en un gradiente de CsCl, en presencia de BrEt.Aprovecha la propiedad intercalante del

BrEt y la compactación del plásmido.

Separación de ácidos nucleicos a partir de la desnaturalización de las cadenas

de DNA en medio alcalino y, su precipitación en concentraciones altas

de sal. Aprovecha el estado de compactación del plásmido.

Métodos de aislamiento de plásmidos

Conformación de un plásmido

Una de las conformaciones principales de un plásmido es que este se encuentre superenrrollado, que es la forma más compacta que existe del DNA.

Sin embargo, también puede encontrarse en otros estados (por ejemplo linealizado) o, en otras conformaciones en estado superenrrollado.

Conformaciones:

• Linealizado: es decir, cuando se han cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez

• Parcialmente linealizado: cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas

• DNA relajado circular: DNA que no se ha empacado

• Superenrrollado: covalentemente cerrado y muy empacado

• Superenrrollado relajado: parecido al anterior pero un poco menos empacado

Dependiendo de la conformación del plásmido, este puede migrar de manera diferente en un campo eléctrico, a pesar de tener el mismo peso molecular.

El DNA se puede desnaturalizar

• El calor, pH, la concentración de iones, influyen en la estabilidad de la doble hélice.

• En la desnaturalización se deshace su estructura nativa es decir, se rompen los puentes de hidrógeno (A-T, G-C).

• Dos hebras separadas que se pueden volver a unir.

DNA nativo

DNA desnaturalizado

Re-naturalización del DNA

• El DNA se puede volver a re-naturalizar

• Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea correcto

• De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables. Re-naturalización al azar

Correcto apareamiento. Se recupera la cadena de DNA nativa. Re-naturalización al azar.

La molécula de DNA no contiene los enlaces originales

Condiciones suaves

Extracción de plásmido por lisis alcalina

Fundamento:

• El tratamiento de un lisado celular con calentamiento o pH alcalino, resulta en la separación (desnaturalización) de las cadenas de DNA.

• Debido a que el plásmido está cerrado covalentemente, las cadenas de DNA no se separan completamente en las condiciones alcalinas.

• En contraste, el DNA cromosómico es grande y menos compactado. Además, en pasos iniciales de la purificación es usualmente degradado en fragmentos pequeños, así que las cadenas de DNA se separan completamente.

Extracción de plásmido por lisis alcalina

Finalmente…

• La re-naturalización de la doble hélice, ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro (incremento de concentración salina) causa la precipitación del DNA cromosómico.

• Debido al entrecruzamiento (superenrrollado) y desnaturalización parcial del plásmido, las dos cadenas de DNA encuentren rápidamente su secuencia complementaria y re-naturalizan, formando de nueva cuenta la doble cadena (nativa).

• En contraste, debido a que las cadenas del DNA cromosómico se encuentran completamente desnaturalizadas, la re-naturalización correcta toma tiempo. El cambio brusco de pH provoca entonces que se formen agregados que precipitan.

• El plásmido permanece en solución y puede ser precipitado después con alcohol, una vez removido el DNA cromosomal.

Protocolo purificación plásmido

1. Lisado celular: generalmente se hacen tratamientos con lisozima (para debilitar la pared) y con detergentes (SDS) para solubilizar la membrana.

2. Desnaturalización: la adición de NaOH y SDS permite desnaturalizar las cadenas de DNA.

3. Neutralización y precipitación: restauración de la doble hélice por adición de acetato de sodio o acetato de potasio = precipitación de DNA genómico

Pasos:

1. L

2. Ñ

3. L

4. Centrifugación: para separar el DNA cromosomal y otras biomoléculas (proteínas) del DNA plasmidico.

5. 2ª Precipitación: adición de etanol o isopropanol absoluto permite precipitar el DNA plasmidico.

6. Lavado: remanentes de biomoléculas y/o alcohol pueden ser lavados

7. Resuspensión: generalmente en buffer TE o agua libre de DNasas.

8. Cuantificación: estimar la concentración permite saber la pureza del plásmido extraído.

Pasos:

Kits de extracción de plásmidos

Existen diversos Kits comerciales que permiten la extracción y purificación de DNA plasmidico, en bajas o altas concentraciones, para distintos usos moleculares.

Se basan en empleo de columnas de intercambio iónico, de afinidad, de exclusión molecular.

Cuantificación por absorbancia a 260nm

Para determinar la concentración de DNA (plasmidico) o productos de PCR se realizan mediciones a 260 y 280 nm. En principio, una solución de dsDNA con una concentración

de 50 µg/mL (ε) debe tener una A260 igual a 1

El cociente de absorbancias a 260/280nm es usado para asegurar la pureza del DNA:

• Un cociente de 1.8 es generalmente aceptado como DNA puro (2.0 para RNA puro).

• Un cociente <1.8 indica presencia de proteínas, fenol u otros contaminantes.

• Un cociente >1.8 indica presencia de RNA como contaminante

En la práctica experimental…

En la práctica experimental…

GTE: Glucosa, Tris/HCl, EDTA

Solución lisis: SDS, NaOH

Neutralización y Precipitación

Desnaturalización

Lisis celular

(300 µL)

(300 µL)

CH3CO2K: 3M pH 4.8(300 µL)

En la práctica experimental…

Centrifugación

pp DNA plasmídico

LavadoLavado

Resuspensión

Volumen igual al sobrenadante

30 µL H2O

30 µL H2O

1 mL

Dejar a T.A. 5-10 min