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PRUEBA DE VIABILIDAD POR TETRAZOLIO EN SEMILLAS DE FRIJOL Y MAIZ

M. Aquino Hernandez, M. Beltrán Navarro, P. Corona Muñoz , J. Sandoval Miranda

Instituto Politécnico Nacional-Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, Av. Acueducto s/n, Barrio La Laguna, Ticomán, Del Gustavo A. Madero, C.P. 07340, México, Distrito Federal.

Resumen

Los objetivos de este trabajo fueron evidenciar el tiempo y la forma de tinción de la solución de tetrazolio para evaluar lotes de maíz (Zea mays L. Var Rugosa), y frijol de la variedad Pinto Saltillo (Phaseolus vulgaris) con el fin de determinar su viabilidad germinativa mediante la prueba de tetrazolio, Asi mismo mostrar evidencias de la forma en que el tetrazolio es capaz de teñir aquellos tejidos vivos de las semilla, dejando a los muertos con su color original, para ello una parte del lote de semillas fue sometido a cocción, con el fin de eliminar la viabilidad de esa parte del lote de semillas estudiadas.Tan solo el 20% de las semillas de frijol estudiadas, resultaron ser viables mientras en en la semillas de maíz, no se logró determinar viabilidad.

Palabras clave: viabilidad, semilla, Zea mays, Phaseolus vulgaris

Introducción

El análisis de viabilidad por tetrazolio se presenta como una herramienta útil para estimar rápidamente la capacidad germinativa de las gramíneas forrajeras de lenta germinación y con dormición pos cosecha (Leme de Lima Días y Rego Barros, 1995). En los programas de control de calidad su uso contribuye permitiendo agilizar decisiones de compra, venta, beneficio,

almacenamiento o descarte de semillas (Leme de Lima Días y Rego Barros, 1995). La velocidad de reducción del tetrazolio es afectada por diversos factores, entre ellos: la concentración de la solución, la temperatura, la duración del pre acondicionamiento y la tinción, la presión atmosférica y el nivel de deterioro de las semillas (Da Costa y Marcos-Filho, 1994; Das y Sen-

Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología UPIBI

Laboratorio de Biotecnologia MolecularNoviembre 2014

Ingeniería Molecular

www.upibi.ipn.mx/

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Mandi, 1992; Leme de Lima Dias y Rego Barros, 1995; Kruse, 1996).

La industria de la semilla requiere métodos de análisis rápidos; determinar la viabilidad de las semillas -lo cual indica la capacidad

potencial de germinación-, es en este aspecto el método ideal. TZ posiblemente haya sidouno de los más grandes descubrimientos en análisis de semillas en la últimacenturia, y aún es poco aprovechado.

Materiales y Métodos

La tinción se realizó con una solución al 1% de 2,3,5-trifeniltetrazolio al interior de un horno a 25°C durante 40 minutos. Se realizaron tinciones con semillas tanto de Maiz, como de Frijol, las cuales con la finalidad de evidenciar el funcionamiento de la técnica, se dividieron en 2 grupos, al primero se le dio un tratamiento previo, remojando las semillas tanto de maíz como de frijol en agua durante 24 hrs previas a la tinción, mientras que a segundo grupo, se les dio cocción hasta el hervor 24 hrs antes de la tinción

Procedimiento de análisis:

1. PreacondicionamientoLas semillas se colocaron en agua por un lapso de 24 horas.Durante ese tiempo, las semillas se mantuvieron a temperatura ambiente.

2. Corte y tinciónLas semillas se cortaron longitudinalmente a lo largo del embrión y 3/4partes del endosperma, y se sumergieron en la solución de tetrazolio, colocándolas en 4 cajas Petri (2 de frijol y 2 de maíz). Cada caja contenia 10 semillas y se realizaron 1 caja de cada semilla, es decir, 1 caja de maíz normal y 1 caja de maíz cocido, lo mismo sucedió con el frijol. La temperatura para la reacción fue de 25 ºC.

3. EvaluaciónSe procedió a evaluar la superficie de corte, verificando el teñido en aquellas semillas viables, cabe señalar que las semillas cocidas, obviamente no se tiñeron.

RESULTADOS

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Se tiñeron 4 lotes de semillas de frijol y maíz, dos de estos lotes fueron tratados previamente (hervidos) y los otros dos no sufrieron ninguna alteración. En la Figura 1 y 2 se pueden observar los primeros dos lotes de semillas hervidas, después de haber sido colocadas en la solución de tetrazolio al 1% e introducidas al horno a 25°C por 40min.

En las Figuras 3 y 4 se pueden observar las semillas que no sufrieron ningún pretratamiento, obteniendo una tinción de color rojizo en distintas intensidades.

Figura 1. Semillas de frijol tratadas.

Figura 2. Semillas de maíz tratadas.

Figura 3. Semillas de frijol teñidas.

Figura 4. Semillas de maíz teñidas.

Las semillas teñidas se clasificaron conforme a las siguientes escalas, obteniendo así el conteo de semillas viables y no viables.

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Figura 5. Patrón de tinción después de la prueba con tetrazolio en semillas dicotiledóneas. Las ilustraciones representan ambos lados de la semilla. Los números del 1 al 6 son semillas germinables y del 7 al

15 son semillas no germinables.

Figura 6. Patrón de tinción después de la prueba de tetrazolio en semillas monocotiledóneas. Los números del 1 al 4 son semillas

germinables y del 5 al 9 son semillas no germinables.

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Figura 7. Semillas de frijol después de la prueba con tetrazolio, cada una con su par.

Una vez realizado el conteo y clasificación se obtuvo la siguiente tabla.

Tabla 1. Clasificación de las semillas de frijol dependiendo

su grado de tinción.Par de

semillasClasificaci

óna) 15b) 9c) 13d) 11e) 14f) 15g) 13h) 3i) 1j) 15

Se observó que existen 2 semillas viables y las restantes 8 son no viables, lo que quiere decir que tan solo el 20% son germinables.

Análisis de resultados

Como se puede apreciar, al realizar el análisis de las figura 7, en función de la figura 5, podemos apreciar que la viabilidad de la semilla depende de la intensidad con que esta se tiñe, sin embargo, La interpretación visual de la tinción es subjetiva y requiere experiencia, especialmente en semillas pequeñas (Howarth y Stanwood, 1993). Es por ello que el analista debería estar familiarizado con el método y la semilla que evalua para lograr una correcta

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c) d)

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apreciación respecto a la viabilidad que la semilla presenta.

El test de tetrazolio se basa en la actividad de las enzimas deshidrogenasas(AOSA, 1983; Bulat, 1961; Copeland et al, 1959; Moore, 1973; Smith, 1952;Smith y Throneberry, 1951) las cuales catalizan las reacciones respiratorias enLas mitocondrias, durante la glicólisis y el ciclo de Krebs. Estas enzimas, particularmente las deshidrogenasas del ácido málico, reducen la sal de tetrazolio(2,3,5-trifenil cloruro de tetrazolio o TCT) en los tejidos vivos. Cuando la semilla de es inmersa en la solución incolora de tetrazolio, esta se difunde a través de los tejidos, produciéndose en las células vivas la reacción de reducción que da como resultado la formación de un compuesto rojo, estable y que no se difunde, conocido por trifenilformazán:

Cuando el TCT se reduce, formando el trifenilformazán, indica que existe actividad respiratoria en las mitocondrias, esto significa que hay viabilidad celular y del tejido. El color resultante de la reacción es un indicador positivo de la viabilidad a través de la detección de la respiración a nivel celular. Tejidos no viables no reaccionan y consecuentemente no se tiñen. Cuando el tejido es vigoroso, se formará el color rojo carmín claro; si el tejido está en proceso de deterioro, un rojo mas intenso será formado, en virtud de la mayor intensidad de difusión de la

solución de tetrazolio por las membranas celulares comprometidas de tales tejidos. Si el mismo no es viable, la reducción de la sal no ocurrirá, y el tejido muerto contrastará, blanco (no teñido) con el tejido teñido, viable. La observación de tales diferencias de color, juntamente con el conocimiento de diversas características de las semillas, permiten la determinación de la presencia, localización y naturaleza de los disturbios que pueden ocurrir en los tejidos embrionarios (Moore, 1973).

En las semillas cocidas no hubo coloración alguna, esto debido a que al hervirlas estas pierden su capacidad de germinación y sufren muerte celular por lo tanto el tetrazolio no tiene efecto colorante en estas. Al colocar una semilla viable en contacto con una solución de tetrazolio, los electrones liberados en los tejidos del embrión reducirán las sales de tetrazolio con lo que estas adquirirán un color rojo intenso; si la semilla no es viable el embrión no cambiara de color. Al no haber coloración en la semilla significa que existen tejidos muertos en la esta.

A veces, los embriones se colorean parcialmente, lo que indica la existencia de áreas de tejidos muertos, debido al deterioro de la semilla. En estos casos, la posición y el tamaño de las áreas necróticas, y no necesariamente la intensidad del color, es el índice que se utiliza para clasificar a las semillas como viables o no viables. Para cada especie, la viabilidad de las semillas

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se evalúa mediante la comparación de las áreas coloreadas del embrión con los patrones de referencia establecidos por los organismos oficiales para el control de calidad de las semillas.

Como se puede observar, existen diferencias de intensidad de color en las porciones vivas de las semillas. A pesar de que la mayoría se encuentran teñidas, unas lo están más que otras. Estas mismas diferencias se encuentran en la propia semilla. Como se observa en la figura 7, la semilla i) es la más coloreada con un rojo muy intenso prácticamente uniforme; pero si se observa la semilla b), se identifican zonas más densas que otras.

La diferencia de intensidades de color en una semilla nos indica su viabilidad, dependiendo la zona que esté o no coloreada. Las partes fundamentales de la semilla, que deben estar teñidas para que ésta sea germinable, son: la radícula y plúmula para las dicotiledóneas, y el embrión para las monocotiledóneas. La figura 4 nos muestra que todos los embriones de las semillas de maíz fueron pintados intensamente, mientras que en las semillas de frijol se encontraron gran cantidad de variaciones, que al ser comparadas con los parámetros de la figura 5 dieron como resultado un único par de semillas viables.

Se sabe que los embriones de las monocotiledóneas están rodeados por un tejido llamado escutelo. En la figura 4 se observa como el embrión del maíz se encuentra teñido de un rojo muy intenso y alrededor se halla una zona pintada más tenue. Esta zona es el escutelo, que también se tiñe con la prueba de tetrazolio, pues aunque no es meramente una parte viva de la semilla, ayuda al desarrollo del embrión una vez que éste entra en el periodo de imbibición.

Conclusiones

La prueba de tetrazolio para la determinación de viabilidad de semillas, nos ofrece una serie de ventajas, como son: Rápida determinación de la viabilidad del lote de semillas, Adecuada evaluación de la capacidad germinativa potencial, Útil para estudiar la biología de las semillas y procesos de deterioro.

Sin embargo, también presenta serias desventajas, entre las cuales destacan: La interpretación visual de la tinción es subjetiva y requiere experiencia, Puede no detectar daños menores, presencia de infección fúngica.

Para nuestro caso de estudio se determinó que tan solo el 20% de semillas de Frijol en su variedad Pinto Saltillo son semillas viables, mientras que las semillas de maíz a pesar de sufrir el proceso de tinción no se terminaron por la nula

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experiencia con la que se contaba respecto al metodo

Referencias

Ruiz M., D.F. (2009). El análisis detetrazolio en el control de calidadde semillas. Caso de estudio: cebadilla chaqueña. E.E.A. INTA ANGUIL

Da Costa , N.P. and J. Marcos-Filho. 1994. Alternative methodology for theTetrazolium test soybean seeds. Seed Science and Technology

Franca Neto J., Kryzanowoski C., El test de tetrazolio en semillas de soja. Londrina: EMBRAPA-CNPSo, 1998. 72p

Felix Perez Garcia, Jose Manuel Pita Villamil, “Viabilidad, vigor, longevidad y consevacion de semillas”, Hojas Divulgadoras Num. 2112, Universidad Politecnica de Madrid.

N. Kameswara Rao, Jean Hanson, M. Ehsan Dullo. “Manual para el manejo de semillas en bancos de germoplasma”, Bioversity International, Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) Roma Italia, 2007