USO DE MARCADORES MICROSATELITES EN

CARACTERIZACIÓN ZOOGENÉTICA Y SELECCIÓN

DE REPRODUCTORES

O. Roberto Martínez López,

Centro Multidisciplinario de Investigaciones Tecnológicas – CEMIT

Dirección General de Investigación Científica y Tecnológica – DGICT

Universidad Nacional de Asunción – UNA

RED CONBIAND - Paraguay

CARACTERIZACIÓN ZOOGENÉTICA

SELECCIÓN DE REPRODUCTORES

MARCADORES MICROSATELITES

Circuito de la información

La historia comienza así: ¿¿¿Son genéticamente iguales...???

Raza Hereford Raza Pampa Chaqueño

¿¿¿Son genéticamente iguales...???

Raza Serpentina

Centro y sur de Portugal

Raza Moxotó

Semi-árido Pernambuco, Brasil

¿¿¿Son genéticamente iguales...???

Raza Nelore Raza Brahman

Como se determina una raza bovina???

Antes y Ahora : Patrón Racial (m)

Ahora y después¿? : Caracterización genética

con marcadores moleculares

¿¿¿Marcadores Moleculares???

Caracterización Animal

Caracterización

Animal

C. Etnozoológica C. Fenotípica

C. Productiva

C. Reproductiva

C. Carcasa

Morfológica y

Zoométrica

C. Genética

Nivel Protéico Marcadores

Moleculares

Microsatélites

Cromosoma Y

C. Geográfica

Fonte: FAO

¿¿¿Qué hacer...???

Marcadores tipo: Microsatelites ?????

SSR fragmentos cortos ADN, 1 a 6 pb, que se repiten en el tándem, de forma aleatoria

en el genoma de los seres vivos

Comparando SSR con otros ventajas:

Alto grado de polimorfismo,

Herencia mendeliana simple,

Co-dominantes

Fáciles de medir y analizar,

Fiabilidad 100%,

Repetitivos y automatizables.

Se encuentran generalmente en regiones no codificadas del genoma y distribuidos

uniformemente

Fonte: Goldstein e Schlotterer, (1999); Prosdocimi, (2001); Graça, (2002).

Marcadores Microsatélites – SSR

- Permite que el ADN de una región seleccionada, sea

amplificada un billón de veces Primers

Con la técnica de la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR),

luego de sus 3 etapas………….

A= ADENINA T = TIMINA C = CITOSINA G = GUANINA

•Donde encontrar un microsatelite?? •En una región polimórfica dentro del genoma POLIMORFISMO: Una variación existente en el genoma, caracteristico en cada individuo, o población, o raza, o especie…

C R O M O S O M A S

G E N E S

A L E L O S

F R E C U E N C I A S

B A S E S

P R O T E I N A S

M O L E C U L A S

E T C

REGIÓN POLIMÓRFICA

MICROSATELITES OTROS MARCADORES

INRA 18

TGLA 22

BM 1824

SPS 115

BM 2113

CRSM 60

ILSTS 6

HEL 9

AFLP

RAPD

VNTR

RFLP

Etc.

ETH 22

HAUT 24

HAUT 27

INRA 35

TGLAA 12

HEL 13

ETH 185

CSSM 66

-INDIVIDUO 1 = INDIVIDUO 3 EN EL MICROSATELITE “X” ESTUDIADO -INDIVIDUO 1 Y 3 SON DIFERENTES AL INDIVIDUO 2 EN EL MICROSALITE

“x” ESTUDIADO.

Caracterización Zoogenética

Caracterizar = Identificar genotípicamente y

establecer un rango típico

Nuevas poblaciones zoogenéticas, o sea,

razas locales, criollas o autóctonas.

Caracterización Animal

Caracterización

Animal

C. Etnozoológica C. Fenotípica

C. Productiva

C. Reproductiva

C. Carcasa

Morfológica y

Zoométrica

C. Genética

Nivel Protéico Marcadores

Moleculares

Microsatélites

Cromosoma Y

C. Geográfica

Fonte: FAO

Animales Domésticos = Especies sufrieron Intervención del Hombre

c/ objeto utilizarlos para producción u otro fin. Histórico y Actual

+ Contemporánea = Compañía

Ejm: Mamíferos, aves, etc.

Animales Silvestres = Especies condición de vida sin intervención

DIRECTA del hombre o, cuyo procesos reproductivos, morfológicos,

genéticos o de comportamiento no han sido alterados con fines

específicos Hombre

-Valor productivo/económico

Valor comercial

-Valor recreativo y estético

-Valor científico

-Valor ecológico

-Valor cultural

Porqué caracterizar la zoogenética local?

VALOR

….realmente todo terminó ahí??

Especie Raza País Rasgo

Bovina N’dama Senegal Resistencia a la Tripanosomiasis.

Bovina Blanco

Orejinegro Colombia

-Resistencia a la infestación con la mosca Dermatobia hominis

(Nuche/Ura/Berne) y a la Brucella abortus

-Animales de trabajo para zonas de ladera, mansedumbre

Bovina San Martinero Colombia Tolerancia al clima cálido y húmedo, alta fertilidad, alta longevidad,

excelente habilidad materna, mansedumbre

Porcina Taihu China -Aprovecha productos forrajeros en su alimentación,

-Producen camadas medias de 16 cochinillos, su carne es jugosa y sabrosa

Porcina Casco de mula Colombia -Resistente a la fiebre aftosa

Equina Pantaneiro Brasil -Resistencia a la anemia infecciosa equina

Caprina Jamunapari India -Raza lechera que puede sobrevivir en climas áridos y estériles

Bovina Pantaneira Brasil -Buenísima reproducción en el pantanal

-Resistencia a parásitos

Bovina Patágónica Argentina -Longevidad Reproduc. = 8-10 crías/vida

Ovina Patagónica Argentina -Rusticidad y prolificidad =Paatagonia

San Martinero Blanco Ojinegro

Cerdo Mula Criolla Colombiana

Criollo Lageano

Criollo Alto Andino Perú Criollo Yacumeño Boliviano

Figura 6: toro NOA (NM) Figura 5: vaca NOA (NH)

Figura 7: vaca patagónica (PH) Figura 8: toro patagónico (NH)

2 Caracterizar

3 Conservar

4 Mejorar

5 Producir

comercialmente

A (1), B(2), C(3), D(4), E(5), de la gestión de los RGA

Procedimientos para la gestión de RGA

Informe país 2004 Comisión nacional consultiva (CNC = FCV/UNA, ARP, VMG/MAG, otras instituciones)

Bovinos con Características Criollas (4)

Pampa Chaqueño = Amenazada-Mantenida

Criollo Pilcomayo (General Diaz) = Amenzada-Mantenida

Criollo Ñeembucú = Critica

Criollo Arroyense = Crítica

BOBINOS PARAGUAYOS CON CARACTERÍSTICAS CRIOLLAS

Pampa Chaqueño

Región Occidental .

Asociación de Criadores

Resistencia y adaptación

Criollo Pilcomayo:

Chaco (Tte. E. Martínez, Gral.

Díaz y el rió Pilcomayo).

Adaptación campos bajos

Criollo Arroyense:

• Zona de Arroyos y Esteros y 25 Diciembre

• Cruzamiento con Cebuíno

Criollo Ñeembucú:

• Zona pantanosa de los esteros del Ñeembucú

•Capacidad de habitar el humedal “barrera”

Dócil,

Rústico,

Precoz,

Alta tasa reproductiva

Calidad de la carcasa

•FELIUS (Cattle breeds of the world, USA, 1985), Cruzas de Criollo con R. Europeas = Criollo-

Hereford / Pampa Características interesantes de productividad en el semi-árido chaqueño

Asociación de Criadores del Pampa Chaqueño = 90’s

Identificación y colecta

Centrales de Pruebas

Formación de rebaños élites

Pruebas de comportamiento reproductores

Multiplicación de vientres

Determinación de Padrón racial

1994 Solicitación de Reconocimiento = Raza Bovina Py

Fuente: ANALES, 2002

Comisión Técnica P. F. da A. R. P. RECHAZÓ

ARGUMENTO: Después de una Inspección Visual (1994):

1 Predominio de genes aportados x R. Británicas Hereford

2 Terneros Bien alimentados = Resurgen las cualidades del Hereford. “O sea, las

cualidades de la raza Hereford se encuentran latentes”

3 Terneros productos PCh. X Cebú y H. x Cebú = Similares

Fuente: Resolución Técnica de la ARP (1994).

¿¿¿Son genéticamente iguales...???

ENTONCES... ¿A qué denominamos raza?

En Paraguay, Como está regido esto ???

Las razas bovinas deben ser fenotipicamente y/o exteriormente diferentes???

En España, Francia, Portugal, Italia, EUA caracterización genética para

diferenciar grupos, además de uma revisión de historia y geografia.

En España es exigencia presentar “Caracterización Genética” para solicitar el

reconocimiento (catalogado) de una raza de un animal doméstico.

Esto es regido por el Comite Español de Razas de Ganado

Analizar las distancias genéticas entre el Pampa Chaqueño, el Criollo

Pilcomayo y razas importadas como la raza inglesa Hereford, por

medio de marcadores microsatélites.

Trabajo-Objetivos

Caracterizar genéticamente los bovinos Pampa Chaqueño y Criollo

Pilcomayo, estudiando su variabilidad genética

BOVINOS

Materias e Métodos

Pampa Chaqueño: 4 Rebaños/95 animales (M/F)

Hereford: 2 criadores/ 30 animales (M/F) y 15 Hereford de Mexico

Criollo Pilcomayo: 1 rebaño/ 36 animales (M/F)

- Obtención de las muestras

-Bovinos colectados en el Paraguay: Material biológico Pelos de la cola

-4 haciendas criadoras de PCH, 1 hacienda de C. Pilcomayo e, 2 de Hereford

-Aproximadamente 50 pelos/animal --Siempre: Pelos con raíces (bulbos)

-Método: Extraídos manualmente (metodología Linkgen, São Paulo)

-Guardados en sobres

debidamente identificados

-Conservadas a temperatura

ambiente hasta su llegada al

laboratório

LAVADO y CENTRIFUGADO

EXTRACCIÓN de ADN

PURIFICACIÓN

Pelo y tejido

DISOLUCIÓN

-Localización Laboratório de Genética Molecular da UCO Córdoba/España

-Extracción ADN Realizada x medio de una Resina comercial (Kit

BLOODCLEAN)

-Metodología BIOTOOLS – Biotechnological & Medical Laboratories

ANÁLISIS DE LABORATORIO

- Permite que el ADN de una región seleccionada, sea

amplificada un billón de veces Primers

ANÁLISES DE LABORATORIO

Eletroforese Géis de policrilamida a 8%.

Seqüenciador automático ABI Prism 377XL

ANÁLISES DE LABORATORIO

Bandas de DNA obtidas nos géis a partir da eletroforese, observados com o programa GENESCAN

Número de Alélos (Genepop® 3.1)

Frecuencias Genotípicas (Genepop® 3.1)

Heterozigosis (Genetix® 4.05.02)

Contenido de Información Polimórfica (Excel® MS Toolkit)

Equilíbrio H-W (Genepop®)

Distancias Genéticas entre Poblaciones (Populations®1.2.28)

Árboles genéticos (Treeview®)

Análisis Multivariado (Genetix® 4.05.02)

Asignación de Indivíduos (Structure® 2.1)

Análisis Estadistico

Resultados

A. Caracterización de los Bovinos Criollos.

Estudio de 3 poblaciones bovinas del Paraguay

Resultados

PCH CNE HER

PCH 0 0.12199 0.140441

CNE 0.12199 0 0.281642

HER 0.140441 0.281642 0

Tabla 7. Distância Genética DA de Nei, entre o Pampa Chaqueño (PCH), Crioulo Ñeembucú (CNE)

e Hereford (HER). POPULATIONS

HER

0.1

PCH

CNE

Figura 4. Distâncias genéticas DA de Nei, obtidas pelo

método de Neigh Joining. TREEVIEW, Radial.

Limousine Charolaise

Resultados

HER PCH CNE

Figura 3. Analise Fatorial de Correspondência para Diferenciação genética individual dos bovinos, Pampa Chaqueño (PCH), Crioulo Pilcomayo (CNE) e Hereford (HER), Versão 3D.

Resultados

Figura 10: Dendrograma de distâncias genéticas individuais entre todos os bovinos Pampa Chaqueño, Crioulo de Pilcomayo e Hereford. Referências:

(95) Pampa Chaqueño (36) Crioulo Pilcomayo (45) Hereford (Paraguay y Mexico)

PCH

CNE HER

K2

K3

K4

K5

K6

Resultados

K 6 P

PCH

CNE HER

: Estrutura genéticas de las poblaciones

paraguayas, primero individualmente de K2 a

K6

Y despues por poblaciones. STRUCTURE.

Resultados

Figura 8. Determinação da amplitude do valor de K com ótimo obtido a partir do

logaritmo de probabilidade de asignaçao de indivíduos.

B. RELACIÓN GENETICA ENTRE LOS CRIOLLOS PARAGUAYOS Y OTRAS

RAZAS DEL MUNDO

Resultados

População/Raça Codigo Origem/Pais

1 Pampa Chaqueño PCH Paraguai Paraguai

2 Crioulo Ñeembucú CNE Paraguai Paraguai

3 Crioulo Mexicano CMX Mexico Mexico

4 Crioulo Argentino CAR Argentina Argentina

5 Crioulo Colombiano CCO Colombia Colombia

6 Crioulo Uruguaio CUR Uruaguai Uruguai

7 Berrenda Vermelha CPR Espanha Espanha

8 Berrenda Preto BNM Espanha Espanha

9 Marismeña MAR Espanha Espanha

10 Pajuna PAJ Espanha Espanha

11 Retinto RET Espanha Espanha

12 De Lidia LID Espanha Espanha

13 Negra Andaluza NAN Espanha Espanha

14 Vaca Canaria VCA Espanha Espanha

15 Palmera PAL Espanha Espanha

16 Frisona FRI Holanda Mexico

17 Pardo Suizo SPA Suiza Mexico

18 Hereford HER Inglaterra Paraguai

19 Holando Zebú HOC Cruza Mexico

20 Brahma BRH Brasil EUA

21 Gir GIR Brasil India

22 Nelore NEL Brasil India

Tabela 10: Poblaciones o razas utlilizadas en esta parte del estudio,

Figura 13. Distância genética DA de Nei, pelo método do vizinho mais próximo (DANJ), entre 19

populações bovinas.

0.1

PCH

HER

93

CAR

CUR

84

48

MEX

CNE

CCO

98 95

46

VCA

PAL

97

FRI

SPA

38

27

9

MAR

RET

BPR

PAJ

58

12

4

LID

BNM

NAN

46

13

Resultados

Espanhois

CMX HOC

CCO

CNE

CAR

PCH CUR

HER

SPA FRI

VCA PAL

NAN

Figura. AFC para la diferenciación genética de 19 poblaciones bovinas. GENETIX. Versión 3D.

Resultados

K2

K3

K4

Figuras 16: Indivíduos asignados a grupos geneticos mediante el programa Structure. De K2 a K22.

K18

K19

K17

Resultados

K 20

K 21

K 22

Resultados

Resultados

-74000

-72000

-70000

-68000

-66000

-64000

-62000

-60000

-58000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

k

log

Serie1

Figura 17: Determinación del K óptimo, estimado por la relación entre el logartimo de

probabilidades de asignación de individuos y los diferentes valores de K.

Tanto en la Región Occidental o Chaco como en la Región Oriental del Paraguay, aún se encuentran recursos genéticos animales

locales, criollos o locales, los que deberían ser mejor atendidos, visualizando una

producción de alimentos en áreas “especiales”, de calidad a mediano y largo

plazo

Estudios genéticos en otras especies de animales

domésticos de Paraguay

Buscando Genética local = Adaptación y Rusticidad

CABRAS FINANCIACIÓN DE LA RED CONBIAND Y EL LABORATORIO DE GENETICA

ANIAMAL DE LA UNIVERSIDAD DE CORDOBA, ESPAÑA

Tesis de grado de Juan Manuel Gabaglio, DPA-CIA-FCA

Apoyo

CEMIT – DGICT - UNA

Fundación Carolina, España

Asociación Criadores de Pampa Chaqueño

CONACYT, Paraguay

Ubicación del área de estudio

Ruta transchaco

Puerto Elsa

Gral. Díaz

Monte Lindo

Materiales y Métodos

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de muestras

Animales

Arboles genéticos

Análisis factorial de correspondencia (3D)

Referencia: Mestizo Anglo Nubian Anglo Mestizo Boer Mestizo

OVEJAS

FINANCIACIÓN DE LA RED CONBIAND Y EL LABORATORIO DE GENETICA ANIAMAL DE LA UNIVERSIDAD DE CORDOBA, ESPAÑA

Tesis de grado de Giovanni Ochipinti y Ever Godoy, DPA-CIA-FCA

Apoyo

CEMIT – DGICT - UNA

Fundación Carolina, España

Asociación Criadores de Pampa Chaqueño

CONACYT, Paraguay

0.1

tipotexel

acriollada1

hamp5

43

corridale2

poba

61

polldorset6

doper3

santaines4

54

27

18

Árbol Genético para 7 poblaciones ovinas de

los humedales de Paraguay

Poll dorset

Referencia: Acriollado Santa Inés Población A Dorper

Corridale Hampshire Tipo Texel Poll Dorset

ASNOS

FINANCIACIÓN LABORATORIO DE GENETICA DE LA FACULTAD DE CIENCIA

ANIMAL DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELON, ESPAÑA

Cooperación del Dr. Higinia Carreras, DEAG-MAG

Apoyo

CEMIT – DGICT – UNA

FCA – CIA - UNA

Asnos colectados en Paraguay

Resultados

Figura 2. Analise Fatorial de Correspondência para Diferenciação genética individual do Pampa

Chaqueño (PCH), Crioulo Pilcomayo (CNE) e Hereford (HER), Versão 2D.

HER PCH CNE

CERDOS (Inicio en Marzo 2011) COPERACIÓN DEL LABORATORIO DE GENETICA DE LA FACULTAD DE CIENCIA

ANIMAL DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELON, ESPAÑA

Muestras de Tejidos de la oreja de Cerdos

Biotipo: Kure Burro, Kure Bañado, Kure Alzado, Kure Ka’aguy, Kure

Saite, Kure Paraguay, Kure Moro, etc.

Zonas de muestreo: Lugares con “barreras naturales”, esteros,

bañados, pantanos, humedales en generales.

BOVINOS PARAGUAYOS CON CARACTERÍSTICAS CRIOLLAS

Pampa Chaqueño

Región Occidental .

Asociación de Criadores

Resistencia y adaptación

Criollo Pilcomayo:

Chaco (Tte. E. Martínez, Gral. Díaz

y el rió Pilcomayo).

Adaptación campos bajos

Criollo Arroyense:

• Zona de Arroyos y Esteros y 25 Diciembre

• Cruzamiento con Cebuíno

Criollo Ñeembucú:

• Zona pantanosa de los esteros del Ñeembucú

•Capacidad de habitar el humedal “Barrera natural”

OBJETIVOS DEL PROYECTO.

OBJETIVO(S) GENERAL(ES)

-Realizar un primer estudio hacia la caracterización genética de cerdos con características criollas, nativas o locales del Paraguay, mediante el uso de marcadores moleculares SNPs (Polimorfismo de un solo nucleótido).

OBJETIVO(S) ESPECIFICO(S)

-Identificar poblaciones porcinas criollas, nativas o locales del Paraguay

-Mapearlos genéticamente con relación a otras poblaciones porcinas

-Ubicarlos geográficamente en las zonas de colecta de muestras

-Asociar las poblaciones o animales identificadas genéticamente, con aspectos fenotípicos para mejor reconocimiento.

Visión de los animales con genética local, criolla o nativa en el Paraguay

HOY

Visión de los animales con genética local, criolla o nativa en el Paraguay

Selección y Cruzamiento

Posible presencia de genes asociados a caracteres de importancia económica:

Leptina, Miostatina, Calpaina y Calpastatina

Grasa, Ternura, Marmóreo, resistencia de corte de la carne

Entrada en vigencia de Condiciones o Reglamentos internacionales de

protección de ciertos Productos específicos:

Protección a la Denominación de Origen del Producto (DOP)

Productos c/valor agregado de acuerdo Índice Geográfica de Protección (IGP)

Procesos de Certificación de Carnes Ecológicas o NATURALES

Buenas Prácticas Agropecuarias, Bien-estar animal, etc.

Aplicada a la Reproducción Animal Transferencia de Embriones, Inseminación Artificial (..y tambien IATF), Sincronización de Celos, etc.

Aplicada a observaciones Cuantitativas Evaluaciones de CPM = Conformación – Peso - Musculatura Obtención de Diferencias Esperadas entre Progenies = DEP’s

Uso de Marcadores Genéticos (Microsatelites) en la producción y sanidad animal Mejoramiento

Análisis Autores Año Razas Nº SSR

Paternidad y Matriz de

parentesco

LARA et. al 2003 2 Poblaciones de Zebú 12

MARTINEZ A. M. et al 2003 Criolla –Mostrenca/España 12

USHA et al. 1995 Cruzas 5

HEYN et al. 1997 Angus 22

TROMMELN et al. 1993 Holstein

Origen y/o Evolución

MEDJURAC et al. 1994 14 razas europeas 5

MACHUGH 1996 Europeas, Indias y Africanas. 20

QUEVAL et al. 1998 Pblaciones africanas de origen taurino y zebuíno

10

Distanciamiento y

Similitud

SASTRE et al. 2003 3 criollas colombianas 7

BARRERA et al. 2003 Criollas colombianas 12

LARA et al. 2003 2 Poblaciones zebuínas de Brasil 12

MARTINEZ R. D. et al 2003 Criollo argentino 17

MARTINEZ A. M. et al 2003 Criolla -Mostrenca 26

ZAMORANO et al. 1998 Berrenda Negra/España 15

CARVALHO 2000 5 criollas portuguesas 7

Selección MACHADO et al. 2003 Gir, Nelore, Guzerá e Holstein 7

HEYN et al. 1997 Angus 22

Marcadores microsatelites en Estudios Genéticos Animales

Esquemas de selección, apareamiento y cruzamientos en animales. Ejm: Bovinos

Para aumentar endogamia dentro de un rebaño de vientres Nelore

Toros Nelore del racimo central (Ejm: NE 14, NE 04, NE 02, NE 15, etc)

Para explotar vigor hibrido dentro de un rebaño de vientres Nelore

Toros Nelore del racimo central (Ejm: GU 18, GU 15, GU 16, GU 13, etc)

Resultados

Figura 10: Dendrograma de distâncias genéticas individuais entre todos os bovinos Pampa Chaqueño, Crioulo de Ñeembucú e Hereford. Referências:

(95) Pampa Chaqueño (36) Crioulo Ñeembucú (45) Hereford (Paraguay y Mexico)

Resultados

HER PCH CNE

Figura 3. Analise Fatorial de Correspondência para Diferenciação genética individual dos bovinos, Pampa Chaqueño (PCH), Crioulo Pilcomayo (CNE) e Hereford (HER), Versão 3D.

Selección de reproductores

Referencia: Mestizo Anglo Nubian Anglo Mestizo Boer Mestizo

Selección de reproductores

OTROS USOS PRACTICOS DE MARCADORES EN GANADERIA BOVINA

Programa Estadístico Computacional “STRUCTURE”

1. Identificar animales que pertenezcan a una determinada variedad dentro de una raza sintetica:

Ejm: Braford: ½ (50% de Hereford y 50% Cebu), ¾ (25% Hereford y 75% Cebu), 1/4 (75% Hereford y 25% Cebu), 3/8 (62,5% Hereford y 37,5% Cebu) y 5/8 (37,5% Hereford y 62,5 Cebu). Igual procedimiento para la raza Brangus, salvo excepción del 5/8 Brangus. Con el STRUCTURE

1. Identificar animales que pertenezcan a una determinada generación .En el caso de la raza Braford: Base, Preparatorio, Avanzado y Definitivo, mediante el uso de marcadores microsatélites. Igual procedimiento en la raza Brangus, pero; Preparatorio, Controlado, Avanzado y Definitivo. Con el STRUCTURE

2. Certificación de nivel de pureza para reproductores (machos y hembras) a remate o a feria. STRUCTURE

OTROS USOS PRACTICOS DE MARCADORES EN GANADERIA BOVINA

http://www.simposiorzgpy.org/