PASTOREXTM MENINGITIS25 ensayos

61607 61611 6161661608 61613 6161861610 61614 61717

DETECCIÓN DE ANTÍGENOS SOLUBLES E IDENTIFICACIÓNDE NEISSERIA MENINGITIDIS A, C, Y/W135, B/E.COLI K1,HAEMOPHILUS INFLUENZAE b, STREPTOCOCCUSPNEUMONIAE, STREPTOCOCCUS B

1- VALOR CLÍNICOLa meningitis bacteriana es una infección de las meninges y los principalesorganismos causantes son: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,Haemophilus influenzae tipo b, y Streptococcus grupo B. La meningitis es unaenfermedad grave, por lo que es importante diagnosticar rápidamente lainfección a fin de iniciar el tratamiento indicado. La técnica clásica deidentificación mediante cultivo, aunque esencial para el antibiograma y laconfirmación del diagnóstico, es lenta y puede dar resultados falsos negativossi el espécimen ha sido transportado y conservado en condicionesinadecuadas, o si se ha iniciado una terapia antibiótica antes de la recogida demuestra. Las técnicas inmunológicas para detectar antígenos solublesliberados por los organismos causantes en los líquidos biológicos, como ellíquido cefalorraquídeo, la orina, el suero, durante la infección, permiten undiagnóstico más rápido. Los antígenos solubles que pueden detectarse coneste kit son los polisacáridos específicos para determinados serogrupos oserotipos: Streptococcus pneumoniae (83 tipos); Haemophilus influenzae tipoB, Neisseria meningitidis grupo A, grupo B / E. coli K1, grupo C, grupoY/W135, y Streptococcus grupo B. El antígeno polisacárido específico para elMeningococcus serogrupo B es muy poco antigénico y siempre ha sido muydifícil obtener anticuerpos de conejo reproducibles específicamente dirigidoscontra este antígeno. La tecnología de anticuerpos monoclonales aplicada a lapreparación de antígenos polisacáridos bacterianos específicos permiteproducir anticuerpos monoclonales de ratón capaces de reconocer de formaespecífica y reproducible el antígeno polisacárido del Meningococcusserogrupo B. Este antígeno polisacárido específico para el Meningococcusserogrupo B es idéntico a un antígeno polisacárido encontrado con E. coli K1.Esta homología antigénica entre el Meningococcus B y el E. coli K1 permitediagnosticar los casos de meningitis por E. coli en neonatos, un 80 % de loscuales son de la cepa K1. Debe subrayarse que E. coli y el Streptococcus Bson las principales bacterias responsables de la meningitis en los neonatos ybebés prematuros, y que la infección meningocócica es extremadamente raraen este segmento de edad.

2- PRINCIPIOEl antígeno contenido en el espécimen comprobado se identifica utilizandopartículas de látex recubiertas con anticuerpos homólogos específicos. Enpresencia del antígeno homólogo, las partículas de látex se aglutinan. Enausencia del antígeno, permanecen en una suspensión homogénea.

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3- PRESENTACIÓN

1. PASTOREXTM MENINGITIS kit de 25 ensayos, código 61607, formadopor:

• Reactivo 1 (R1): N. meningitidis B/E.coli K1 1 botella con 0,40 ml de látex rojo sensibilizado con anticuerpo monoclonalmurino específico para N. meningitidis grupo B/E.coli K1.

• Reactivo 2 (R2): control negativo para N. meningitidis B/E.coli K11 botella con 0,40 ml de látex rojo sensibilizado con anticuerpo monoclonalmurino específico para toxoide tetánico.

• Reactivo 3 (R3): H. influenzae b 1 botella con 0,40 ml de látex blanco sensibilizado con anticuerpos deconejo específicos para H. influenzae type b.

• Reactivo 4 (R4): S. pneumoniae1 botella con 0,40 ml de látex verde sensibilizado con anticuerpos deconejo específicos para S. pneumoniae.

• Reactivo 5 (R5): Streptococcus B 1 botella con 0,40 ml de látex amarillo sensibilizado con anticuerpos deconejo específicos para Streptococcus B.

• Reactivo 6 (R6): N. meningitidis A 1 botella con 0,40 ml de látex azul sensibilizado con anticuerpos de conejoespecíficos para N. meningitidis grupo A.

• Reactivo 7 (R7): N. meningitidis C 1 botella con 0,40 ml de látex rojo sensibilizado con anticuerpos de conejoespecíficos para N. meningitidis grupo C.

• Reactivo 8 (R8): N. meningitidis Y/W 135 1 botella con 0,40 ml de látex rosa sensibilizado con anticuerpos de conejoespecíficos para N. meningitidis Y/W 135

• Reactivo 9 (R9): Control polivalente negativo 1 botella con 0,40 ml de látex ciruela sensibilizado con inmunoglobulinasIgG de conejo no inmunizado.

• Reactivo 10 (R10): Control polivalente positivo Control positivo: extracto antigénico liofilizado para reconstituir con 1 ml deagua estéril. Contiene los antígenos polisacáridos de N. meningitidis A, C,B, Y/W135, H.influenzae b, Streptococcus B, y S.pneumoniae. Volumensuficiente para 20 reacciones.

Todos los reactivos contienen timerosal al 0,02 %.Los reactivos R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, y R9 contienen menos de 0,1%de azida sódica.• Tarjetas de aglutinación desechables.• Bastoncillos desechables.

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2. PASTOREXTM MENINGITIS ENSAYOS EN LÁTEX INDIVIDUALES(25 ensayos cada uno):

• Ensayo simple en látex (sin control)- N. meningitidis A (R6) código 61608- N. meningitidis C (R7) código 61610- N. meningitidis B / E. coli K1 (R1) código 61611- Streptococcus B (R5) código 61613- Streptococcus pneumoniae ( R4) código 61614- Haemophilus influenzae b (R3) código 61616

• Control PASTOREXTM Meningitis Kit de reactivos control para ensayo simple en látex (para 2 x 25 ensayos) código 61618

- 2 botellas cuentagotas con 0,40 ml de control polivalente negativo (R9)- 2 botellas de control polivalente positivo liofilizado (R10) para reconstituir con- 1 ml de agua estéril.- 2 botellas cuentagotas con 0,40 ml de control negativo para N.m.B / E.coli

K1 (R2)- tarjetas desechables.- bastoncillos desechables.

3. Diluyente PastorexTM Meningitis

1 botella con 40 ml de diluyente para tratamiento con suero código 61717

4- ALMACENAMIENTOTodos los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en laetiqueta, si se conservan a una temperatura de entre 2 y 8º C y en ausencia decontaminación microbiana (incluso una vez abierto). El control positivopolivalente reconstituido (R10) es estable durante 1 mes a 2 – 8º C (enausencia de contaminación microbiana) o más si se toma la alícuota y secongela a –20º C inmediatamente.Conserve las botellas de reactivo de látex en posición erguida.NO DEBEN CONGELARSE LOS REACTIVOS DE LÁTEX

5- MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO• Pipeta para distribuir una gota (de 40 a 50 µl) del espécimen.• Tubos de hemólisis o Eppendorf• Incubador en seco o baño de agua a 100º C.• Centrífuga para tubos de hemólisis o Eppendorf• Baño desinfectante• Agua destilada estéril, estéril salina o diluyente (código 61717)

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6- PRECAUCIONESLa calidad de los resultados depende de observar estrictamente las BuenasPrácticas de Laboratorio (GLP).• Todos los reactivos y la muestra deben utilizarse a una temperatura

ambiente entre 18 y 25°C.• No toque la superficie de reacción de las tarjetas de aglutinación.• Cambie la pipeta o la punta desechable para cada muestra comprobada.• Agite las botellas de látex antes de su uso• Limpie la punta del frasco cuentagotas del reactivo a fin de obtenergotas

bien calibradas.• Mantenga la botella de reactivo en posición vertical para depositar lasgotas.• Cambie la varilla de mezclado para cada reacción• Introduzca todos los materiales desechables utilizados en un recipientepara

residuos que pueda someterse a autoclave o en un baño dedesinfectante.• El control positivo polivalente debe reconstituirse con agua estérildestilada

evitando toda contaminación.

INSTRUCCIONES DE HIGIENE Y SEGURIDADRespete siempre las técnicas y precauciones establecidas relativas a laprotección contra riesgos microbiológicos.• Todas las mezclas tomadas deben ser consideradas como potencialmente

infecciosas.

7- PROCEDIMIENTO: LCR, suero, orina

Muestras

Las muestras deben procesarse tan pronto como sea posible después de surecogida. Si esto es imposible, se pueden almacenar durante algunas horasentre +2 y +8°C, o más tiempo a -20°C (En este caso, mantenga sólo elsobrenadante a –20°C después de la centrifugación). Evite repetidascongelaciones / descongelaciones. Se deben realizar con prioridad exámenesbacteriológicos (cultivos) para evitar la contaminación de la muestra. El mínimovolumen de muestra para el ensayo con el kit de látex es 0,5 ml.

A) PREPARACION DE MUESTRAS CLINICAS.

PRECAUCIÓN : si utiliza un baño maría, use tubos herméticos para impedirque el agua penetre en los tubos. Utilice un incubador seco si es posible.

a) LCR (Líquido cefalorraquídeo)Si el LCR es muy turbio o contiene células rojas de la sangre, centrifúguelodurante 5 minutos a 350 g y recoja el sobrenadante.

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• Caliente la muestra durante 3 minutos a 100°C (incubador seco o bañomaría). Permita que la muestra se enfríe a la temperatura ambiente yentonces realice una centrifugación durante 5 minutos a 3.000 g o unfiltrado utilizando un filtro con un tamaño de 0,45 µm.

b) SUERO• Añada 3 volúmenes (1,5 ml) de diluyente (código 61717) por un volumen

(0,5 ml) de suero.• Caliente durante 3 minutos a 100°C en un baño maría o incubador seco.• Centrifugue durante 5 minutos a 3.000 g.

PRECAUCIÓN : No use muestras de plasma. No se ha ensayado lainterferencia debida a sobrecarga de albúmina, lípido, hemoglobina ybilirrubina. Los mejores resultados se obtienen usando suero fresco.

c) ORINAPara aumentar la concentración de antígeno, antes del ensayo, se puedeconcentrar la muestra hasta 25 veces en una membrana tipo Amicon B15(Amicon France).• Calentar la orina durante 3 minutos a 100°C (incubador seco o baño maría).• Centrifugar durante 5 minutos a 3.000 g o filtre utilizando un filtro de 0,45

µm.• Testar el sobrenadante con el LCR tratado con calor. (Cf. 7 – A)

B) PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA• Coloque una gota (de 40 a 50 µl) del sobrenadante de muestra pretratado

en cada círculo de la tarjeta de aglutinación • Agite suavemente los frascos de reactivo de látex. • Sujetando el frasco en posición vertical, coloque una gota de cada reactivo

de látex en la tarjeta desechable siguiendo el modelo de distribuciónindicado: R9, R6, R7, R1 y R2 en los círculos blancos, y R8, R3, R4 y R5 enlos círculos negros.

• Mezcle los reactivos de látex y la muestra usando una varilla; use una varilladiferente para cada látex.

• Gire la tarjeta (~120 rpm) con cuidado durante 10 minutos y esté atento a laaparición de aglutinación visible a simple vista en un plazo máximo de10 minutos (se puede usar un agitador orbital a una velocidad de ~120rpm).

8- PROCEDIMIENTO: HEMOCULTIVOPara una orientación supuesta, compruebe la morfología y la tinción de Gram.• Tome de 1 a 2 ml de un hemocultivo positivo.• Centrifugue durante 5 minutos a 2000g.

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• Coloque una gota (de 40 a 50 µl) de sobrenadante en cada círculo de latarjeta desechable, que deben corresponderse con los reactivos de látexsometidos a prueba, según la tinción de Gram.

• Agite suavemente los frascos de reactivo de látex seleccionados para laprueba.

• Sujetando el frasco en posición vertical, coloque una gota de cada reactivode látex seleccionado en la parte exterior de las gotas de sobrenadante.

• Mezcle los reactivos de látex y la muestra usando una varilla; use una varilladiferente para cada látex.

• Gire la tarjeta a ~120 rpm durante 5 minutos. Durante este período de5 minutos, compruebe si aparece aglutinación.

Algunos medios de hemocultivo pueden presentar reacciones inespecíficas oproblemas de interpretación. Como control negativo, use un hemocultivoinoculado con sangre estéril o con un microorganismo diferente a losdetectados por PASTOREX™ Meningitis.

9- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

REACCIÓN POSITIVAUna reacción positiva es indicada por una aglutinación fina que se puedeobservar a simple vista, en comparación con los controles negativos. La intensidad de la aglutinación y el tiempo de aparición dependen de laconcentración de antígeno en la muestra sometida a prueba. Una discordancia entre una prueba de antígeno positiva y un cultivo negativose puede explicar por la ausencia de bacterias viables en la muestra delcultivo (tratamiento antibiótico iniciado antes de que se haya obtenido lamuestra o condiciones de transporte no adecuadas para la supervivencia debacterias frágiles). En la mayor parte de los casos, una reacción positiva con látex anti-N. meningitidis B/E. coli K1 en un recién nacido o un lactante prematuro indicainfección por E. coli K1. En un individuo de más edad, es más probable que setrate de Meningococo B. El cultivo de la muestra debe confirmar eldiagnóstico.

REACCIÓN NEGATIVASuspensión homogénea, sin aglutinaciones.

RESULTADOS NO INTERPRETABLESUna reacción es ininterpretable si la muestra se aglutina con los controlesnegativos de látex (R2 o R9) o con más de un reactivo de látex del kit. En estecaso, es aconsejable repetir la prueba con otra muestra y esperar al resultadodel cultivo. (Muy raras veces, una infección puede deberse a dos especies debacterias diferentes).

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10- PROCEDIMIENTO: AGRUPAMIENTO DE CEPAS BACTERIANASAISLADAS EN AGAR (colonias de un cultivo reciente y puro)No se puede usar látex Y/W135 para este agrupamiento de cepas debacterias. Para determinar estos grupos, se recomienda usar antisuerosconvencionales (Kit Y, W135, 29E: Ref # 58704, 3 x 1ml)Para una orientación provisional antes de realizar la prueba:• Compruebe la morfología y la tinción de Gram.• Para bacterias gramnegativas, haga la prueba de oxidasa (positiva para

N. meningitidis, negativa para E. coli K1).• Para cocos grampositivos, realice una prueba de catalasa. (No realice

pruebas en cepas positivas para catalasa).Cepas de S. pneumonia y Haemophilus influenzae no encapsuladas nopueden ser identificadas mediante esta técnica.

a) Agrupamiento: N. meningitidis (A, B y C solamente), H. influenzae, E. coli,S. pneumoniae• Coloque una gota de 30 µl de solución salina estéril en un círculo de la

tarjeta desechable.• Muestra:

- Para Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae y Escherichia coli, elequivalente a un asa de 1 µl, que es un máximo de 2 a 3 colonias.

- Para Streptococcus pneumoniae, el equivalente a un asa de 5 µl, que esun mínimo de 10 a 12 colonias.

• Emulsione con cuidado las colonias de la muestra de tal forma que seobtenga una suspensión homogénea.

• Agite suavemente el frasco de reactivo de látex elegido para laidentificación; sujetando el frasco en posición vertical, coloque una gota deeste látex en la parte exterior de la gota de suspensión bacteriana.

• Mezcle el látex y la suspensión usando una varilla. • Gire la tarjeta a (~120 rpm).• Observe la aparición de cualquier aglutinación clara en menos de

2 minutos,• Confirme la identificación de las especies usando pruebas bioquímicas

convencionales.

b) Agrupamiento: Estreptococo B (colonias ß-hemolíticas)• Suspenda 5 colonias en 2 ml de caldo de Todd Hewitt. • Incube en baño maría a 37ºC durante entre 2 y 3 horas.• Centrifugue durante 5 minutos a 3.000 g.• Coloque una gota (de 40 a 50 µl) de sobrenadante en un círculo de la tarjeta

desechable.

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• Agite suavemente el frasco de reactivo de látex; sujetando el frasco enposición vertical, coloque una gota de este látex en la parte exterior de lagota de reactivo.

• Mezcle el látex y la muestra usando una varilla. • Gire la tarjeta (~120 rpm).• Observe la aparición de cualquier aglutinación clara en menos de 1 minuto,• Confirme la identificación de las especies usando pruebas bioquímicas

convencionales.Para una extracción directa desde colonias aisladas, use el kit PASTOREX™STREP (Código 61721)

11- CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA Los reactivos de látex deben ser totalmente homogéneos después deagitarlos.El control polivalente positivo R10 se usa para verificar la inmunorreactividadde cada látex.• Para realizar esta prueba de control de calidad, coloque una gota (40 µl) del

control positivo (R10) en cada círculo de la tarjeta desechable. • Agite suavemente los frascos de reactivo de látex. • Sujetando el frasco en posición vertical, coloque una gota de cada reactivo

de látex en la tarjeta desechable siguiendo el modelo de distribuciónindicado: R9, R6, R7, R1 y R2 en los círculos blancos, y R8, R3, R4 y R5 enlos círculos negros.

• Mezcle los reactivos de látex y el control positivo usando una varilla; useuna varilla diferente para cada látex.

• Gire la tarjeta a ~120 rpm durante 10 minutos. Durante este período de10 minutos, compruebe si aparece aglutinación observando a simple vista(compare las reacciones del látex de prueba con las reacciones de loscontroles negativos de látex).

La intensidad de la aglutinación y la velocidad de aparición dependen de laavidez de los anticuerpos/antígenos. Por lo tanto, las reacciones observadascon cada látex son variables. Las del látex NmB/Coli K1 son más sutiles quelas de los otros. • Una solución salina o el diluyente (código 61717) controla la ausencia de

aglutinación inespecífica en cada látex. Para realizar esta prueba de control de calidad, se usa solución fisiológica odiluyente R11 (código 61717) según el protocolo para el control positivopolivalente (cf. el procedimiento anterior).

• Los reactivos de látex no deben usarse cuando no se aglutinan con controlpositivo polivalente (R10) o cuando se aglutinan inespecíficamente consolución salina o diluyente (código 61717) (esto podría deberse a unascondiciones de conservación incorrectas del kit o a la contaminación delreactivo de látex).

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12- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTETodos los reactivos fabricados se elaboran conforme a nuestro sistema decalidad, que se extiende desde el momento de recepción de las materiasprimas hasta la comercialización del producto. Cada lote se somete aexámenes de control de calidad y únicamente se autoriza su introducción enel mercado tras cumplir los criterios de aceptación predefinidos. Bio-Radconserva los expedientes relativos a la producción y el control de cada uno delos lotes.

13- RENDIMIENTO DEL ENSAYO

SENSIBILIDADLa sensibilidad de cada reactivo del kit se determinó mediante análisis de:• antígenos purificados diluidos en solución salina• muestras clínicas de fluido cerebroespinal documentadas mediante las

técnicas convencionales de análisis (cultivo, examen microscópico)• cepas aisladas del cultivo sobre agar Mueller Hinton, agar chocolate + PVS,

agar Columbia + sangre de cordero al 5% .

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Antígenos o bacteriasreveladas en la muestra

Antígenosdiluido

(NaCl, 9 ‰)LCR Cepas

Concentraciónlímite detectada

Número demuestras

analizadas

Número depruebas de

látexpositivas

Número demuestras

analizadas

Número depruebas de

látexpositivas

N. meningitidis A 2,5 ng/mL 12 12 22 22

N. meningitidis B

E. coli K1

62,5 ng/mLND

10

1

10

1

N. meningitidis C 2,5 ng/mL 3 3 16 16

N. meningitidis Y 5 ng/mL ND - -

N. meningitidis W 2,5 µg/mL ND - -

S. pneumoniae 95 ng/mL 24 22 15 15

Streptococcus B 20 ng/mL 1 1 15 15

H. influenzae type b 0,1 ng/mL 34 33 17 17

ESPECIFICIDADLa especificidad de cada reactivo se determinó mediante análisis de:• LCR estéril (a) o LCR contaminado por bacterias responsables de

meningitis y diferentes a las detectadas por el ensayo de látex (b)• Cepas pertenecientes a los géneros Neisseria, Branhamella, Moraxella,

Acinetobacter, Kingella, Klebsiella, Streptococcus, Haemophilus ensayadascon látex heterólogo.

*1 cepa de Klebsiella pneumoniae dio una reacción no específica.

CULTIVOS DE SANGRELos rendimientos de PASTOREXTM MENINGITIS se han ensayado en cultivosde sangre. Los resultados de esta evaluación son:• Sensibilidad: 100 % (4/4 incluyendo 2 cepas de S. pneumoniae y 2 cepas

de Streptococcus B).• Especificidad: 100 % (37/37). Para los reactivos R3, R4, R5, R6, R7 y R8.• Especificidad: 98,2% (54*/55). Para el reactivo R1. *Entre las 19 cepas de

estafilococos coagulasa-negativas ensayadas, 1 cepa dio una reacción noespecífica, resultado no confirmado en la cepa ensayada a partir desubcultivo en agar tras el procedimiento de agrupación.

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Latex test LCR estéril (a) LCR contaminado (b) Cepas (c)

Número demuestras

analizadas

Número depruebas de

látex negativas

Número demuestras

analizadas

Número depruebas de

látex negativas

Número demuestras

analizadas

Número depruebas de látex

negativas

N. meningitidis A 52 52 50 50 122 122

N. m. B / E. coli K1 25 25 ND 41 40*

N. meningitidis C 52 52 56 56 127 127

S. pneumoniae 60 60 39 39 33 33

Streptococcus B 49 49 58 58 17 17

H. influenzae type b 61 61 32 32 31 31

LCR no seleccionado

Número de muestrasanalizadas

Número de pruebas de látexnegativas

N. meningitidisY/W 135

40 40 - -

14- LÍMITES DE LA TÉCNICA• En numerosos casos, la técnica inmunológica de látex permite un

diagnóstico preliminar del organismo. Sin embargo, la concentración deantígeno en la muestra puede quedar por debajo del límite inferior dedetección del látex y producir un resultado negativo. Puede ser útil en estecaso repetir la muestra posteriormente.

• Esta técnica no puede sustituir el cultivo de las bacterias, lo que por sí solopermite establecer un resultado de susceptibilidad antimicrobiana.

• Considerando la amplia variedad de medios de cultivo de sangre, no sepueden garantizar rendimientos en todos los medios. (Cf. 7-D).

• Los datos clínicos y bibliográficos relativos a la detección de antígenos ensueros y orina usando reactivos de látex son limitados en la actualidad.

• Se ha informado de algunos ejemplos de bacterias no relacionadas quetienen antígenos similares. La posibilidad de reacciones cruzadas debetenerse en cuenta siempre (1, 4, 5).

• Las diagnosis finales, como para todas las diagnosis de laboratorio, no sepueden basar en los resultados de un único ensayo, sino en una visióngeneral de los datos clínicos y los resultados bioquímicos, citológicos einmunológicos.

• La detección de antígeno soluble en cultivo de sangre, así como elagrupamiento de cepas aisladas sobre agar, debe completarse medianteuna identificación de las especies de la cepa bacteriana.

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15- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. BRADSHAW M.W., CHNEERSON R., PARKE J.C. Jr., ROBBINS J.B.

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