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Determinación de Bacillus cereus en alimentos

OBJETIVOS:

• Desarrollar y/o implementar una técnica para la detección del Bacillus cereus. • Desarrollar el método de enumeración en placa de Bacillus cereus.

FUNDAMENTO: Para llevar a cabo la determinación presuntiva de B. cereus se utilizan medios que contengan yema de huevo en su composición, para poner de manifiesto la lecitinasa, produciendo una zona opaca que rodea la colonia, mientras que otras bacterias formadoras de esporas como por ejemplo, B. thuringiensis, por lo general no producen la zona opaca, o si la producen, es muy restringida. En los medios que contienen manitol y rojo de fenol como indicador, el B. cereus no fermenta el carbohidrato y por lo tanto las colonias se presentan rodeadas por zonas de color rojo. Los medios de cultivo recomendados para su determinación son, el agar selectivo para Bacillus cereus según MOSSEL, agar yema de huevo-polimixina-rojo de fenol, agar yema de huevo piruvato, agar selectivo según REUTER y agar sangre de caballo en el cual se puede observar la hemólisis provocar por cepas de B cereus. Y es aplicable a cualquier alimento en el cual Este procedimiento analítico especifica el método de enumeración en placa de B. cereus y es aplicable a cualquier alimento en el cual B cereus esté viable y presente. MEDIOS DE CULTIVO, SOLUCIONES Y BIOLÓGICOS 5 placas (ó 10 placas si se desea efectuar las siembras por duplicado) de agar MYP estéril ó su equivalente según fabricante (p. ejemplo selectivo para B cereus de OXID) a. 1 matraz de 500 mL con450 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estéril a. 4 matraces de 250 mL con 90 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estéril ó 4 tubos de 16x150 mm con 9 mL de diluyente de fosfatos pH 7 estéril b. 2 tubos de 13x100 mm con 3.5 mL de agar nutritivo c 2 tiras API 50 CH para Bacillus * (o bioquímicas tradicionales en tubo) c. 2 tiras API 20E, * (o bioquímicas tradicionales en tubo) c. * 2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de caldo glucosa más rojo de fenol c. * 2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de caldo nitratos c. * 2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de RMVP c. * 2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de agar tirosina inclinado c.

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* 2 tubos de 13x100 mm con 3.5mL de medio SIM c. 2 placas de agar soya tripticaseína-sangre d. 2 placas de agar tirosina d. 2 placas de agar nutritivo completamente secas d. Reactivos para tinción de Gram b, c, d, e Reactivos para detección de nitratos A (ácido sulfánico) y B (N-(1, naftil) etiléndiamina) e. Reactivo para la pruebe de Voges –Proskauere. Creatinina. MATERIAL Equipo usual en los laboratorios de microbiología a, b, c, d, e

Incubadora a 30 + 2˚C y 35+ 2˚C a, b, c, d, e Cuenta colonias b Licuadora o “Stomacher” a 3 pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL estériles a , b, c, d, e 1 varilla de vidrio doblada en “L” a. Agitador de tubos tipo vórtex a. Microscopio, cubre y portaobjetos b, c, d Jarra de anaerobios con catalizador y generadores con H2+CO2

Baño de agua con control de temperatura de 45+ 2˚C a Gradillas a. NOTAS: a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica. c Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica. d Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica. e Material necesario a las 96 horas de iniciada la práctica. PROCEDIMIENTO Este procedimiento tiene como fundamento inocular diluciones decimales de la muestra en agar MYP (o su equivalente según fabricante), mediante método de extensión en superficie, e incubar a 30+ 2˚C/24 horas. A) Preparación de la muestra. En condiciones asépticas, pesar 50g de muestra y depositarla en 450mL de buffer de fosfatos (dilución1:10) y licuar durante 2 minutos. B) Enumeración en placa de B. cereus.

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Transferir 10 mL de la dilución 1:10 a 90mL de diluyente, mezclar bien y continuar hasta llegar a la dilución 10-4. Inocular por duplicado placas de agar MYP (o de medios de cultivo equivalentes) con 0.1mL de cada una de las diluciones de la muestra y extender con varilla estéril. Incubar las placas a 30˚C/24 horas. Observar si existe la presencia de colonias rodeadas por zonas claras que indican la presencia de la lecitinasa. Las colonias de B. cereus en agar MYP generalmente son de color rosa, el cual se intensifica conforme continua la incubación. En agar selectivo para B. cereus (OXOID), las colonias presentes presentan un tamaño aproximado de 5mm de diámetro con precipitación en su entorno, debido a la hidrólisis de la lecitina. Al no utilizar manitol, las colonias se presentan de color azul turquesa rodeadas por un precipitado, debido a la yema de huevo. Si la reacción no es clara, incubar las placas 24 horas más antes de efectuar el cómputo. Seleccionar placas que tengan en promedio de 15-150 colonias productoras de lecitinasa y de coloración rosa (MYP) o azules (agar selectivo para B. cereus, OXOID); esta será la cuenta presuntiva de B. cereus en placa. Seleccionar 5 o más colonias características de las placas y transferir a tubos con agar nutritivo para confirmar la presencia de B. cereus, siguiendo la técnica que se describe en los puntos C y D. Calcular el número de B. cereus/g de muestra, basado en el porcentaje de colonias , probadas y confirmadas. Nota: el factor de dilución es 10 veces mayor, debido a que solamente se inoculó 0.1 mL de cada dilución, en lugar de 1mL. C) Confirmación de B. cereus Tomar 5 o más colonias sospechosas provenientes de agar MYP (o su equivalente) y transferir a tubos con agar nutritivo. Incubar 24 horas a 30˚C. Preparar una tinción de Gram y observar microscópicamente. El B. cereus, en el microscopio se presenta como bacilo Gram-positivo corto, forma cadenas, las esporas pueden ser elipsoidales, centrales o subterminales. Transferir 3 asa as de cada tubo de agar nutritivo a 0.5mL de buffer de fosfatos y mezclar en el vórtex. Utilizar esta suspensión e inocular los siguientes medios confirmatorios, (también se puede utilizar el inóculo del tubo de agar nutritivo sin diluir en buffer). C.1. Caldo glucosa + rojo de fenol Inocular 3 mL de caldo glucosa rojo de fenol con 1 asada del cultivo descrito en el punto anterior. Incubar anaeróbicamente 24 horas a 35˚C en jarra de anaerobiosis. Agitar los tubos después de la incubación y observar si se presenta un vire de color que va de rojo al amarillo, lo que indica la producción de ácido, en condiciones anaeróbicas a partir de la glucosa. C.2. Caldo nitratos Inocular 5 mL de caldo nitratos con 1 asada de cultivo descrito en el inciso C. incubar 24 horas a 35˚C. Para probar los nitratos, añadir 1.25 mL de los reactivos A y B a cada cultivo. El desarrollo de un color rojo-naranja en 10 minutos indica la reducción de nitratos a nitritos.

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C. 3. Medio VP Inocular 5 mL del medio VP con una asada de cultivo descrito en el inciso C. incubar 48+ 2 horas a 35˚C. A cada mL de cultivo añadir 0.6 mL de α-naftol y 0.2 mL de KOH. Agitar y observar el resultado después de 1 hora a temperatura ambiente. La prueba es positiva de producción de acetil metil carbinol, si se desarrolla un color rosa o violeta. C.4. Agar tirosina Inocular toda la superficie del agar con una asada del cultivo. Incubar a 35˚C por 48 horas. Observar aclaración de las zonas cercanas al desarrollo, que indica la descomposición de la tirosina, examinar las placas negativas con signos obvios de desarrollo e incubar hasta por un total de 7 días antes de considerar la prueba como negativa. C.5. Agar MYP (o medio de cultivo equivalente) Inocular las placas de agar MYP, con el cultivo descrito en el inciso C, con la finalidad de confirmar pureza, lecitinasa y manitol de la cepa aislada. Incubar 24 horas a 35˚C. Observar la producción de lecitinasa alrededor de las colonias (halo transparente). El B. cereus no fermenta el manitol en el agar MYP ni tampoco en el agar para B. cereus (OXOID). C.6. Resultados de las diferentes pruebas confirmatorias 1) Bacilo Gram-positivo largo esporulado que no deforma el esporangio 2) Productor de lecitinasa y no fermenta el manitol 3) Crece y produce ácido a partir de la glucosa 4) Reduce los nitratos a nitritos (unos cuantos tipos pueden ser negativos) 5) Produce acetil-metil-carbinol (VP positivo) 6) Descompone la L-tirosina D. pruebas para diferenciar a tres miembros del grupo B. cereus, incluyendo B. cereus variedad mycoides, B thuringiensis, B. anthracis. D.1. prueba de movilidad Inocular por punción en el medio de SIM para movilidad, a partir de un cultivo de 24 horas. Incubar 18-24 horas a 30˚C y observar el crecimiento a lo largo de la punción. La mayoría de los biotipos de B. cereus y B. thuringiensis son móviles mediante flagelos peritricos, la variedad mycoides es inmóvil, unos cuantos biotipos de B. cereus no son móviles. D.2. crecimiento rizoide Inocular con asa recta, en el centro de las placas de agar nutritivo que estén completamente secas, con el cultivo bacteriano (inciso C). Incubar a 30˚C por 48-72 horas. Observar el crecimiento rizoideo característico de colonias con estructura tipo raíz, que se pueden extender a partir del sitio donde se inoculo. Esta característica es típica de la variedad mycoides, en tanto que B. cereus presenta colonias en forma de “galaxia”.

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D.3. Actividad hemolítica Inocular palcas de agar soya tripticaseína con sangre. Incubar 24 horas a 35˚C. Posteriormente se observa que B. cereus, es fuertemente hemolítico, la mayoría de los biotipos de B. thuringiensis y B. cereus variedad mycoides son β-hemolíticos, en contraste con B anthracis generalmente no presenta hemólisis después de 24 horas. Nota: se puede utilizar API 50CHB Y API 20E en la caracterización bioquímica de los cultivos sospechosos. E. Limitaciones del método Las pruebas confirmatorias recomendadas pueden ser inadecuadas para distinguir al B. cereus de microorganismos similares encontrados en alimentos. Los resultados de los biotipos de B. cereus son variables y requieren además de otras pruebas para identificarlos. F. Informe de resultados Reportar el número de B. cereus/g de muestra basado en el porcentaje de colonias probadas y confirmadas, tomando en cuenta que el factor de dilución es 10 veces mayor debido a que el método de inoculación utilizado es el de extensión de superficie.

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Determinación de Clostridium perfringens en alimentos OBJETIVOS:

• Desarrollar y/o implementar una técnica para la detección de Clostridium perfringens. • Conocer la importancia en salud pública de este microorganismo patógeno causante

de intoxicación por la ingesta de alimentos contaminados.

FUNDAMENTO: Actualmente existen 2 métodos diferentes para el aislamiento, numeración e identificación de C. perfringens: a) Aislamiento y numeración presuntiva en agar sangre neomicina y confirmación por la reacción de Naegler y la neutralización de la reacción antitoxina de C. perfringens tipo A . b) Aislamiento y numeración en placas de tipo agar triptosa sulfito cicloserina y fermentación de carbohidratos.- Ésta técnica analítica tienen como principio el de inocular diluciones decimales de en placas de agar TSC ,agar triptosa-sulfito cicloserina, en donde el Clostridium perfringens se manifiesta por la reducción de sulfitos a sulfuros, los cuales reaccionan con las sales de hierro, produciendo color negro de sulfuro ferroso. -Éste método especifica el método de recuperación de C. perfringens mediante el método de cultivo convencional y es aplicable a cualquier alimento en el cual C. perfringens esté viable y presente. MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL con 225 mL de agua peptonada al 0.1% a 3 tubos 16x150mm con 9mL de agua peptonada al 0.1%a

8 cajas petri con agar triptosa-sulfito-cicloserina TSC con yema de huevo.a 8 tubos 22X175 mm con 8 mL de agar triptosa-sulfito-cicloserina TSC sin yema de huevo a 3 tubos de 22x175 mm con 15 mL de caldo hígado cocido o medio de carne cocido -solo en caso de tener colonias sospechosas en agar TSC- b

10 tubos de 16x150mm con 9 mL de medio fluido de tioglicolatob ó c 10 placas de de agar TSC sin yema de huevo –sólo en caso de que exista evidencia de contaminación-c ó d 10 tubos 16x150 mm con 5 mL de medio acidificado de leche-fierro c ó d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de agar gelatina lactosa c ó d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL con agar movilidad-nitratos c ó d 10 tubos 16x150 mm con 8 mL de caldo para esporulación c ó d 10 tubos 13x100 mL con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de salicina, con campana Durham c ó d 10 tubos 13x100mL con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de rafinosa, con campana Durham c ó d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de glucosa c ó d

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10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de sacarosa c ó d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de arabinosa c ó d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de manitol c ó d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de caldo tioglicolato mas 1% de lactosa c ó d 10 tubos 13x100 mm con 3.5 mL de agar esculina inclinado c ó d Reactivos para la prueba de nitratos –ácido sulfanílico y diclorhidrato de N-1 naftil etilén diamina-d o´e Zinc en polvo d o´e Reactivos para la tinción de Gramb,c MATERIAL

-Pipetas de 1.5 y 10 mLa -cuenta coloniasb, c -licuadora con vaso o Stomacher con bolsas estériles.a -jarras de anaerobiosisd -incubadora de 35+ 1° C a, b, c, d -cajas petri estérilesa, b, c -asa microbiológicab, c , d -baño de agua a 45 + 1° Cd -gradillas a, b, c, d

NOTAS: a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica. c Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica. d Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica. e Material necesario a las 96 horas de iniciada la práctica.

PROCEDIMIENTO

A.-PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Pesar en condiciones de asepsia , 25 g del alimento y añadir 225mL de diluyente, en este caso de agua peptonada al 0.1% dilución 1:10

Homogeneizar durante 1-2 minutos a velocidad baja y efectuar diluciones decimales hasta 10-4 con la menor aireación posible, en caso de no tener colonias sospechosas en agar TSC, guardar en refrigeración específicamente la dilución 1:10-

B.- CULTIVO Y AISLAMIENTO

Por duplicado, colocar en las cajas de TSC con yema de huevo 1mL de cada dilución , agitar

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perfectamente y dejar que se basorba por completo la muestra.

Verter 8mL de agar TSC sin yema de huevo a cada placa.

Incubar a 35+ 2 ° C por 24h

C.- MÉTODO DE CULTIVO ALTERNATIVO

Inocular 0.1mL de cada dilución sobre placas de agar TSC con yema de huevo y distribuir con varilla.

Después de que el inóculo se ha absorbido, añadir una sobrecapa de 8mL de agar TSC sin emulsión con yema de huevo. Dejar solidificar.

Colocar las placas sin invertir dentro de una jarra para anaerobios con generador y catalizador para incubar de 20-24 h a 35° C

Selecciona las placas que contengan entre 20-200 colonias negras.

C. perfringens presenta colonias negras en el agar TSC con yema de huevo, con diámetro aproximado de 2 a 4 mm opacas con una zona blanca alrededor de la colonia debido a la actividad de la lecitinasa.

Contar y calcular el número de colonias de clostridios por g de alimento- verificar la manera de efectuar los cálculos en la técnica analítica de S. aureus tomando en cuenta el volumen inoculado en cada placa TSC el cual puede ser de 1mL ó 0.1 mL-.

D.-PROCEDIMIENTO COMPLEMENTO

Éste inciso no se realiza cuando existan colonias sospechosas en el agar TSC. En caso contrario:

Preparar caldo hígado o bien medio carne, previamente calentado durante 10 minutos en agua hirviente y enfriado rápidamente. Inocular en los medios antes mencionados , 3 tubos con 2mL de la dilución 1:10, e incubar los tubos durante 24-48 horas a 35 + 2 ° C

E.-PRUEBAS CONFIRMATORIAS PRESUNTIVAS

E.1 ENRIQUECIMIENTO

Seleccionar 10 colonias típicas e inocular en medio fluido del tioglicolato desaireado y enfriado. Incubar de 15-24 horas a 35 + 2 ° C . Después examinar el desarrollo microbiano de cada cultivo mediante tinción de Gram y comprobar la pureza de las colonias

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desarrolladas.

Si existe evidencia de contaminación, seleccionar colonias características y sembrarlas nuevamente sobre placas de agar TSC con yema de huevo e incubar anaeróbicamente durante 24 horas a 35 + 2 ° C.

La colonias sobre la superficie del agar TSC , son de color amarillo grisáceo, con zonas opacas de 2-4mm de diámetro , por la actividad de la lecitinasa. Este procedimiento también es usado para aislar C. perfringens de los tubos de cakdo hígado cocido o medio de carne.

E.2 PRUEBA PRESUNTIVA DE LECHE –FIERRO

Inocular medio de leche-fierro con 1 mL del cultivo del tioglicolato fluido-del paso anterior-, e incubar a 46+ 1 ° C durante 2 horas.

La fermentación tormentosa se caracteriza por la rápida coagulación de la leche y la fractura del coágulo, provocada por la formación de gas que generlmente se eleva a la superficie del medio.Es recomendable utilizar tubos largos para esta prueba , con el fin de evitar derramamientos accidentales. Los cultivos que no presentan la reacción descrita anteriormente, al cabo de 5 horas, difícilmente será c. perfringens ; la rapidez de esta prueba también depende de la cepa y de la población inicial. Esta prueba es suficiente para casos de prueba presuntiva.

F.-PRUEBAS CONFIRMATORIAS COMPLETAS

F.1. Gelatina-lactosa, movilidad nitratos y caldo de esporulación.

Inocular por picadura los tubos con medio gelatina lactosa y medio movilidad nitratos, a partir de cultivos puros de caldo tioglicolato fluido o colonias aisladas en el agar TSC. Incubar durante 24horas a 35 + 2 ° C ; posteriormente en el caso específico de la gelatina lactosa, examinar el desarrollo, y observar si se presenta cambio de color de rojo a amarillo y producción de gas, además enfriar el tubo 1 hora a 5°C y observar si hubo licuefacción de la gelatina; si el medio de gelatina lactosa permanece sólido, incubar adicionalmente 24 horas a 35 + 2 ° C y observar.

Como C. perfringens no es móvil, observar los tubos de movilidad-nitratos, para ver si el crecimiento solamente está a lo largo de la picadura .Por otra parte C. perfringens reduce nitratos a nitritos; para lo cual se añaden 0.5 mL de reactivo A y 0.2 mL del reactivo B.

La formación de un color violeta desarrollada en 5 minutos indica presencia de nitritos. Si no hay desarrollo de color, añadir polvo de zinc, si nuevamente no hay desarrollo de color-violeta-, indica que los nitratos se redujeron por completo hasta nitrógeno molecular.

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Inocular caldo para esporulación, 1 mL de caldo tioglicolato fluido. Incubar 24 horas a 35 + 2 ° C al término establecido preparar una tinción de Gram , en el caso de existir desarrollo microbiano y observar microscópicamente las esporas.

Refrigerar los cultivos esporulados por si se requieren pruebas adicionales.

F.2 FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS

F.2.1 FERMENTACIÓN DE SALICINA Y RAFINOSA

Inocular el caldo tioglicolato que contiene salicina o rafinosa con una asada del cultivo de caldo tioglicolato enriquecido. Incubar durante 24 horas a 35 + 1 ° C y concluido este tiempo examinar el medio para observar si hubo producción de ácido y gas ; C. perfringens no fermenta la salicina, sin embargo sí produce ácido y gas a partir de la rafinosa.

F.2.2 FERMENTACIÓN DE OTROS CARBOHIDRATOS E HIDRÓLISIS DE ESCULINA

Inocular el caldo tioglicolato adicionado del carbohidrato seleccionado, con una asada del cultivo de caldo tioglicolato enriquecido. Incubar durante 24 horas a 38 + 1 ° C y posteriormente examinar el medio después de adicionar un indicador ácido-base, como por ejemplo, rojo de fenol, para observar la producción de ácido.

Tomar una asada de caldo tioglicolato enriquecido e inocular por estría únicamente la pendiente del tubo de agar esculina, incubar durante 24 horas a 38 + 1 ° C y examinar el medio después de la incubación.

Nota: En el cuadro 1 se resumen la mayoría de las pruebas bioquímicas para identificar al C. perfringens.

Cuadro 1 Reacciones Bioquímicas de C. perfringens

PRUEBA COMPORTAMIENTO

Movilidad _

Reducción de nitratos +

Licuefacción de la gelatina a 22° C +

Fermentación de la glucosa +

Fermentación de la rafinosa + gas y acidez

Fermentación de la sacarosa +

Fermentación de la arabinosa _

Fermentación del manitol _

Fermentación de la salicina _

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Fementación de la lactosa +

Fermentación tormentosa de la leche +

Hidrólisis dela esculina _

G.-INFORME DE RESULTADOS Calcular el número de células C. perfringens en la muestra sobre la base del porcentaje de colonias probadas y confirmadas. EJEMPLO: En el caso de haber inoculado 0.1mL de cada una de las diluciones: El cómputo promedio de la placa para la dilución 10-4 es de 85 colonias y 8 de 10 colonias se confirmaron para C. perfringens, el número de microorganismo por g de alimento es: 85x (8÷10)x 100,000 x 0.1------- 6800000UFC _g alimento--------------68x105UFC_g alimento En el caso de haber inoculado 1mL de cada una de las diluciones: 85x(8÷10)x 10,000 ------- 680000UFC _g alimento--------------68x104 UFC_g alimento Nota: El factor de dilución en las placas que contienen yema de huevo y que solamente se sembró 0.1mL de las siluciones, es diez veces mayor como se observa en el ejemplo previamente descrito.

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Determinación de Campylobacter jejuni en alimentos. OBJETIVOS:

• Desarrollar y/o implementar una técnica para la detección de Campylobacter jejuni. FUNDAMENTO: La presente técnica para la detección de Campylobacter en alimentos, describe un esquema general que consiste en los siguientes pasos: Aislamiento en medios sólidos, se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Campylobacter y que permita el reconocimiento visual característico de colonias sospechosas. Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Campylobacter y la eliminación de cultivos sospechosos falsos. MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES. 1 matraz Erlenmeyer de 250mL con 90 mL de agua peptonada al 0.1%a

4 cajas Petri estéril con 20.0 mL de agar selectivo para Campylobactera

3 tubos 16X150 mm con 9 mL de agua peptonada al 0.1%a

2 tubos de 13x100 mm con 3.5 mL de caldo nitratosb

2 tubos de 13x100 mm con 3.5 mL de medio SIMb

Reactivo para la prueba de oxidasab

Reactivos para tinción Gramb

MATERIAL 1 bolsa para Stomacher o vaso de licuadora estéril.a

Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos.a

Stomacher o motor para licuadora.a

Mechero Bunsen.a

2 pipeta estéril con algodón de 1 mL.a

1 varilla de vidrio esterila

1 balanza granataríaa

1 jarra de anaerobiosisa

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Propipeta.a

Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetrob

Tijeras y pinzas estérilesb

Microscopiob

Incubadora a 42°C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a ±0.1 °Ca

NOTAS: a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 24 horas de iniciada la práctica. c Material necesario a las 48 horas de iniciada la práctica. d Material necesario a las 72 horas de iniciada la práctica. e Material necesario a las 96 horas de iniciada la práctica. PROCEDIMIENTO. Aislamiento selectivo. 1.- Para el caso de muestras solidas colocar 25 g de la muestra, para muestras liquidas 25 mL de la muestra 2.- Transferir la muestra pesada o medida a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. 3.- Adicionar 90.0 mL de diluyente estéril al 0.1% a la licuadora o bolsa Stomacher. 4.- Homogenizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora o velocidad mínima. 5.-Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el numero de diluciones está en función de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 X 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente. 6.- Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1,10-2, 10-3 y 10-4 a cajas petri con agar selectivo para Campylobacter. 7.- Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estéril, en forma de “L”, iniciando a partir de la mayor dilución (Método de inoculación por extensión en superficie). 8.- Mantener las placas en su posición hasta que el inoculo sea absorbido por el agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente. 9.- Invertir las placas e incubar en condiciones microaerofílicas 42-43°C, durante 24 a 48 horas. 10.- Después de incubar observar las colonias características de este microorganismo en el agar selectivo para Campylobacter. Estas se presentan como gotas de agua extendidas a lo largo de la estría.

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Pruebas bioquímicas Realizar la confirmación bioquímica del microorganismo, haciendo las pruebas de presencia de las enzimas citocromo oxidasa, catalasa, producción de H2S, reducción de nitratos a nitritos, e hidrólisis de purato. Prueba de oxidasa. 1.- Colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial. 2.- Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en agar Skirrow y depositarlo en el papel filtro anterior. NOTA Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se torna púrpura oscuro o azul en pocos segundos. Prueba catalasa. 1.- Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solución de peróxido al 3%. 2.- la formación inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. 3.- ¡Precauciones, la emulsión debe realizarse con un asada platico o palillo de madera estéril evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre, cualquier contaminación con eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas. Reducción de nitratos. 1.- Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35C por 5 días. Para la lectura se debe agregar 0.2 mL de reactivo A y 0.2 mL de reactivo B, un color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo después de una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). 2.- en forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0.2 mL del reactivo B y 0.2 mL del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva ( presencia de nitritos). Si esta coloración no se observa, adicionar 0.2 mL del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa-naftilamina, que es carcinogénica. Movilidad en agar. 1.- Inocular en medio SIM, incubar por 48 horas a una temperatura de 37 °C. Observar si el microorganismo inoculado es móvil. Producción de H2S 1.- Inocular en medio SIM, incubar por 48 horas a una temperatura de 37C. Observar si el microorganismo es productos de un precipitado negro. NOTA Para los microorganismos catalasa positivos en el medio se observa un burbujeo al rededor de la estría.

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CUADRO 2. Características mínimas para la identificación de Campylobacter jejuni

Morfología Bacterias curvas Gram negativas no esporuladas.

Citocromo oxidasa + Catalasa + Reducción de nitratos a nitritos + Producción de H2S + , + Hidrólisis de hipurato + Crecimiento a 37°C y 42°C + , + Crecimiento aerobio - Movilidad +

Resultados. Interpretación de resultados. Consultar los resultados obtenidos en el cuadro de identificación de Campylobacter jejuni y concluir acerca del tipo de microorganismos que se aisló.

• AGAR SELECTIVO PARA Campylobacter USO Para el aislamiento primario y cultivo de Campylobacter, a partir de muestras clínicas, alimentos, aguas, etc. PRINCIPIO La base y la sangre de carnero junto con la atmósfera deficiente en oxígeno producen un buen crecimiento de Campylobacter. El suplemento con agentes antimicrobianos inhibe marcadamente el crecimiento de las bacterias acompañantes y facilita la recuperación de Campylobacter. Sembrar la muestra de prueba en la superficie del medio de cultivo por estría cruzada. Incubar 24 – 48 h en atmósfera de CO2. De acuerdo a la temperatura de incubación, es posible hacer diferenciación de especies: TEMPERATURA DE INCUBACION MICROORGANISMO 25ºC 35ºC 42ºC Campylobacter fetus ssp fetus + + - Campylobacter jejuni - + + Campylobacter coli - + - Campylobacter fetus ssp venerealis + + -

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FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA BASE Agar 15.0 Extracto de levadura 2.0 Bisulfito de sodio 0.1 Dextrosa 1.0 Cloruro de sodio 5.0 Polipeptona 20.0 SUPLEMENTO Anfotericina B 0.002 Vancomicina 0.010 Cefalotina 0.015 Polimixina B 2500 Unidades Trimetoprim 0.005 Sangre de carnero estéril desfibrinada 100 mL PH 7.2 ± 0.2 PREPARACION Rehidratar 43.1 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45ºC. Adicionar la sangre de carnero estéril desfibrinada, homogeneizar perfectamente. Agregar los suplementos previamente hidratados, según las especificaciones del fabricante en condiciones de esterilidad, mezclar sin producir burbujas. Vaciar en cajas de Petri estériles. Conservar en refrigeración de 2º a 8ºC. CONTROL DE ACTIVIDAD MICROORGANISMO CEPA CRECIMIENTO Campylobacter jejuni ATCC 33291 Bueno Escherichia coli ATCC 25922 Parcial a completa inhibición Enterococcus faecalis ATCC 29212 Parcial a completa inhibición

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Determinación de Shigella spp. en alimentos.

OBJETIVOS:

• Desarrollar y/o implementar una técnica para la detección de Shigella spp. FUNDAMENTO: Para demostrar la presencia de Shigellas, se usan muestras preparadas a partir de los alimentos o materia fecal de los pacientes o bien de individuos sospechosos de ser portadores. Las muestras se siembran directamente en placas con agar selectivo o se pasan primero a través de un medio de enriquecimeinto en un caldo selectivo y se siembran luego en placas. Los cultivos cuyas colonias previemente se han observado en el microorcopio teñidos al Gram y se caracterizan por ser bacilos Gram-negativos, se utilizan para realizar las pruebas bioquimicas, pruebas de aglutinación (antigeno-anticuerpo). Este procedimiento analítico especifica el método de recuperación de Shigella mediante cultivo convencional especialmente formulado para Shigella, así como la adición de novobiocina, incubando anaeróbica y estriado en agar Mac-ConKey y es aplicable a cualquier alimento en el cual la Shigella esté viable y presente. El principio de la técnica de aislamineto consiste en:

a) Enriquecimiento de Shigelle sonnei. Colocar 25 g de la muestra en 225mL de caldo GN adicionado de 0.5 mg/mL de novobiocina, seguido de incubación anaeróbica a 44±2 oC / 20 horas y después es sembrado por estria en agar Mac ConKey

b) Enriquecimiento de otras especies de Shigella. Proceder como en el inciso a) ,pero adicionar 3 mg/mL de novobiocina, incubar anaeróbicamnete a 44±2 oC / 20 horas y después es sembrado por estria en agar Mac ConKey.

MEDIOS DE CULTIVO 1 matraz Erlenmeyer con 225 mL de caldo para Gram-negativos con 0.5 mg y/o 3 mg de novobiocina cuyo pH final sea 7.0 (caldo GN+novobiocina)a

2 cajas Petri con 20mL de agar Mac Conkey (MC)b 2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar Kligler (KIA) inclinadosc

2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar hierro lisina (LIA) inclinadosc

2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo rojo de metilo Voges Proskauer (RMVP)e

2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de medio sulfuro indol movilidad (SIM)e

2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo glucosa más rojo de fenol y conteniendo campana de Durhame

2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo surraco o caldo ureae

2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo malonatoe

2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de agar citrato de Simmonse

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2 tubos de 13x 100 mm con 3mL de caldo KCN 2 tubos con caldo sacarosa más rojo de fenole

2 tubos con caldo adonitol más rojo de fenole

2 tubos con caldo inositol más rojo de fenole

2 tubos con caldo salicina más rojo de fenole

2 tubos con caldo mucato (sólo en el aislamiento de otras especies diferentesa S. sonnei )e

2 tubos con agar acetato de sodio (sólo en el aislamiento de otras especies diferentesa S. sonnei )e

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES. 1 frasco gotero con solución salina isotónica estéril (NaCl 0.85%)c

1 frasco gotero con reactivo de Kovac´se 1 frasco gotero con solución de rojo de metiloe. 1 frasco gotero con solución reactivo de Voges-Proskauer No.1 (VP1; solución etanólica de alfa-naftol al 5% p/V)e. 1 frasco gotero con solución reactivo de Voges-Proskauer No.2 (VP2; hidróxido de potasio a 40% P/V)e. Juego de colorantes para la tinción de Grame

BIOLÓGICOS Antisuero polivalente somático “O”

MATERIAL Y EQUIPO. Balanza granatariaa. 1 caja de Petri de vidrio estérila. 1 bolasa de Stomacher o un vaso de licuadora estérila. Utensilios necesarios para la manipulación de la muestra: cucharas, cuchillos, tenedores, estérilesa. Stomacher o motor para licuadoraa. Pipetas de vidrio de 1.0 y 5 mL, estériles con filtro de algodónd. Pipetas Pasteur estérilesc. Asa microbiológica b. Mechero de Bunsena, b, c,d,e Portaobjetosc. Microscópio ópticod,e. Jarra para anaerobiosis a

Incubadora a 35ºC con termostato calibrado que evite variaciones mayores a +/-0.1ºC a,b,c, Incubadora a 42 y 44ºC con termostato calibrado que evite variaciones mayores a +/-0.1ºC a. NOTAS.

a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 24 h. de iniciada la práctica. c Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. d Material necesario a las 72 h. de iniciada la práctica. e Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.

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PROCEDIMIENTO: Método convencional de cultivo. A) Enriquecimeinto de S. sonnei: 1. Pesar en una caja de Petri esteríl, en área aséptica 25g de muestra. 2. Verter el contenido de la caja Petri en una bosa de Stomacher o vaso de licuadora estéril. 3. Adicionar a la muestra, 225mL de caldo GN estéril más 0.5 mg de novobiocina. 4. Homogenizar la muestra con el diluyente durante 30 segundos a velcidad media en Stomacher o 10 segundos en la licuadora a la mas baja velocidad 5. Mantener la suspensión 10 min. A temperatura ambiente y agitar periódicamente. 6. Incubar en jarra de anaerobiosis con catalizador en incubadora a 44±2 oC durante 20 horas 7. Agitar y sembrar por estria en placas de agar Mac Conkey 8. Incubar a 35±2 oC durante 20 horas. B) Enriquecimiento de otras especies de Shigella 1. Proceder como en el inciso “a” utilizando 3 mg de novobiocina 2. Incubar la muestra homogénea anaeróbicamente a 42±2 oC durante 20 horas. C) Aislamiento de S. sonnei o cualquier otra especie de Shigella. 1. Examinar las placas de agar Mac Conkey (colonias ligeramente rosas y translúcidas, con o sin bordes rugosos). 2. Inocular 2 colonias sospechosas en agar TSI y en agar LIA. 3. Incubar todos los medios a 35±2 oC durante 20 a 24 horas. 4. Descartar los cultivos que muestren motilidad, H2S, formación de gas, descarboxilación de la lisina y fermentación de lalactosa o sacarosa. D) Caracterización fisiológica. Realizar tinción de Gram e inocular los cultivos sospechosos en diferentes pruebas bioquímicas, en tiras de API 20 E. Las características de Shigella se resumen en: bacilos Gram-negativos, negativos para H2S, ureasa, glucosa (gas), mitilidad, descarboxilación lisina, sacarosa, adnitol, inositol, lactosa (2 días), KCN (Caldo cianuro de potasio), malonato, citrato, salicina y acetato. Es positivo para rojo de metilo en RM/VP. Utiliar antisuero para identificar el serotipo. Las especies de Shigella tieneden a dar negativas las reacciones de acetato de sodio, citrato y mucato, mientras que la E. coli , anaerógena tiende a dar positiva al menos una de estas 3 últimas reacciones. E) Pruebas bioquímicas 1.Agar triple azúcar hierro o agar Kligler hierro. Registrar las características del medio TSI o KIA antes de la inoculación (color del medio). Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa bacteriológica recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar triple azúcar hierro (TSI) o

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agar Kligler (KIA) inclinado. Incubar el medio TSI o KIA a 35+/-2ºC durante 24 h.

2. Agar lisina hierro. Hacer la misma operación que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.), tomando la asada de la misma colonia con la que se sembró en estos medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro. 3. Caldo urea (convencional). Con asa bacteriológica recta estéril, tomar del crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular

en el tubo con caldo urea o caldo Surraco. Incubar a 35+/-2ºC durante 24 h.

Caldo urea (rápida). Con asa bacteriológica estéril, tomar dos asadas de crecimiento de l cultivo presumiblemente

positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o LIA e inocular tubos de caldo urea (rápido). Incubar a 35+/-2ºC durante 24 h.

• 4. Agar citrato de Simmons. Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e inocular

por estría en el tubo con agar citrato de Simmons. Incubar a 35+/-2ºC durante 96 h.

5. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad). Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e inocular

por punción vertical en el tubo con medio SIM. Incubar a 35+/-2ºC durante 24 h. Para verificar la producción de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente

crecimiento de 0.2 a 0.3mL de reactivo de Kovac´s. 6. Caldo RM-VP (rojo de metilo- Voges Proskauer) . Con asa bacteriológica recta estéril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e inocular en tubo con caldo RM-VP.

6.1. Prueba de Voges Proskauer. Para la prueba de Voges Proskauer incubar a 35+/-2ºC durante 48 h. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estéril un mililitro de cultivo. Adicionar a este cultivo, 0.6mL de reactivo de VP1 (alfa- naftol etanólico al 5%), agitar y agregar o.2mL de reactivo VP2 (Hidróxido de potasio al 40%). Adicionar algunos cristales de criatinina (opcional). Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto de que la

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reacción se lleve a cabo en presencia de oxígeno.

Prueba de Rojo de metilo. Para la prueba de Rojo de metilo (RM) incubar a 35+/-2ºC el resto del medio RMVP durante 48 h más (96 h. de incubación en total a partir de la incubación del medio RMVP). Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solución indicadora de rojo de metilo. 7. Caldo malonato (para confirmar la presencia de S.arizanae). Con asa bacteriológica recta estéril, tomar crecimiento del medio TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo que contiene caldo malonato. Incubar a 35+/-2ºC durante 40 h. 8. Caldo KCN y/o caldo mucato Con asa esteríl tomar un inóculo de Kliger, TSI o LIA y sembrar en los caldos antes mencionados (según sea el caso), incubar a 35+/-2ºC durante 20 a 24 horas. 9. Agar acetato de sodio Con asa esteríl tomar un inóculo de Kliger, TSI o LIA y sembrar por estria en el agar acetato de sodio e incubar a 35+/-2ºC durante 20 a 24 horas. 10. Pruebas de fermentación de carbohidratos más rojo de fenol (indicador de pH) Con el asa, tomar inóculo de los medios Kliger, TSI o LIA y sembrar en un tubo de ensayo que contenga el caldo con el carbohidrato más rojo de fenol además de una campana de Durham (según sea el caso), para poder onservar la posible produccion de gas y cambio de pH. Incubar a 35+/-2ºC durante un lapso de 20 a 24 horas. Interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas consultando su carcaterización fisiológica en el inciso “D”. En caso de no aislarse ninguna especie del género Shigella , es recomendable identificar el o los microorganismos coliformes que están presntes en el alimento analizado. F) Identificación serológica: 1. Colocar con un asa bacteriológica, 2 gotas separadas de solición salina estéril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos; en donde una gota será el control. 2. Suspender en cada una de las gotas, una porción de cultivo desarrollado en agar Kliger. 3. Agragar a una de ellas, una gota de antisuro polivalente somatico “O” y mezclar perfectamente bien. 4. Inclinar la lámina hacia atrás u hacia delante, durante aproximadamente un minuto para posteriormente observar bajo buena iluminación y fondo obscuro los resultados de esta prueba. 5. Considerar el grado de aglutación de acuerdo a:

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0 = no aglutinación 1+ = aglutinación escasa 2+ = aglutinación con un 50% de claridad 3+ = aglutinación con 75% de claridad 4+ = aglutinación total

Notas:

a) Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente “O”, puede determinarse el subgrupo, empleando antisueros especificos como son el A, B, C y D

b) Si la aglutinación con el antisuero “O” es negativa, calentar a ebullición a baño María durante 30 min. para hidrolizar el antigeno capsular que interfiere en la reacción. Después repetir la prueba con el antisuero polivanete “O”.

G) Informe de resultados Reportar presencia o ausencia de Shigella spp. (identificación de especie) en 25 gramos de alimento. Bibliografía:

� MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS; David A. A. Mossel; Editorial Acribia; 2a edición; Zaragoza (España); 2003; pp. 258, 440, 626.

� MICROBIOLOGIA MODERNA DE LOS ALIMENTOS; James M. Jay; Editorial

Acribia; 3a edición; Zaragoza (España); 1994; pp.217, 321-326, 407.

� FOOD MICROBIOLOGY FUNDAMENTALS AND FRONTIERS; Michael P. Doyle;

ASM Press Washington D.C.; 1997; pp. 102, 110-111, 327-335, 704-705.

� TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS DE APLICACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD

DE LOS ALIMENTOS; Mercedes Palao, Aurora Ortegón, Martha Giles; Facultad de Química UNAM