ARTICULO CIENTIFICO

PCR EN TIEMPO REAL PARA LA DETECCIÓN DE VIRUS DEL HERPES SIMPLE, SIN EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO

LINA MARIA PINZON NARANJO

030150372009

JAZMIN SUAREZ

BIOLOGIA MOLECULAR

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA

FACULTAD DE INGENIERIA AGRONOMICA

PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

IBAGUE

2010

PCR EN TIEMPO REAL PARA LA DETECCIÓN DE VIRUS DEL HERPES SIMPLE, SIN EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO.

RESUMEN

Antecedentes: La velocidad y la sensibilidad en tiempo real de reacción en cadena de polimerasa (PCR) Se ha hecho un método popular para la detección de agentes microbiológico en la investigación y en especímenes clínicos. Para la detección y genotipificación del virus del herpes simple (VHS) en las muestras clínicas, PCR en tiempo real ha demostrado ser más rápido, más sensible y más seguro que los métodos anteriores que incluido el aislamiento del virus en cultivo celular seguido por microscopía de inmunofluorescencia. Mientras que Los ensayos de PCR para la detección basada en VHS posee claras ventajas sobre las técnicas anteriores, algunos aspectos del método PCR siendo dispendiosa. El proceso de extracción y purificación de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas antes de la PCR es particularmente difícil. La extracción de ácidos nucleicos es costosa, consume tiempo y es un paso mediante el cual las muestras pueden contaminarse antes de su análisis. En esto, se investiga la necesidad de extracción de ácidos nucleicos en un hisopo de base de las muestras clínicas para la detección de VHS por PCR en tiempo real. Encontramos que la extracción de ácidos nucleicos no es necesaria para la detección específica y sensible de HSV en muestras clínicas mediante PCR en tiempo real. Métodos: Estudio prospectivo (n = 36) y a posteriori (n = 21) muestras clínicas de los diferentes sitios anatómicos fueron analizadas para detectar la presencia del virus del herpes simple 1 o 2 por PCR en tiempo real utilizando el VHS RealArt 1 / 2 LC PCR Kit. Las muestras fueron analizadas por PCR, tanto antes como después de extracción automatizada de ácidos nucleicos. En el PCR se utilizaron muestras extraídas y sin extraer también para la comparación con el cultivo celular como un medio para detectar el VHS. Resultados: La detección de HSV 1 / 2 de ADN en muestras clínicas por PCR en tiempo real no se exigía que la muestra se somete a la extracción del ácido nucleico / purificación antes del análisis. Cada espécimen que pudo ser detectada por PCR en tiempo real se analizo , sin extraer, con los métodos en el mismo. El límite de detección del HSV-1 y el VHS-2 cuando se analizan las partículas en forma no extraída se encontró que aproximadamente el 17 y 32 partículas del virus, respectivamente, en comparación con una sensibilidad de 10 copias, para el análisis de ADN purificado. La omisión de la extracción del ácido nucleíco pasó a ser reducido tanto el tiempo de ensayo y de costos.

Conclusión: La omisión de la etapa de extracción por ácido nucleico antes de la PCR en tiempo real para la detección de virus del herpes simple dio lugar a un ensayo más rápido y rentable, con poco impacto sobre la sensibilidad de detección

BASE métodos fiables de detección y de subtipos de HSV infecciones han incluido inmuno absorción ligado a enzimas ensayo (ELISA), microscopía de inmunofluorescencia (IFA) y el aislamiento del virus mediante cultivo celular. Si bien cada uno de estos métodos ha sido muy útil para ayudar a diagnóstico clínico, tiempo y los avances tecnológicos han puesto de manifiesto las limitaciones de estos ensayos. Los tres ensayos son laboriosos y de mucho tiempo, con el cultivo de células a menudo requiere siempre hasta siete días antes de que los resultados se obtengan. Las sensibilidades de estas técnicas también han sido cuestionadas, sobre todo en referencia a metodologías más recientes, como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La aparición de PCR en tiempo real para la detección sensible y rápida de los ácidos nucleicos secuencias ha tenido un impacto significativo en la detección de agentes de enfermedades infecciosas. Muchos laboratorios, incluyendo nuestra propia PCR, han adoptado en tiempo real como el principal método de detección del HSV debido a la velocidad, la sensibilidad y la relativa falta de complejidad de la PCR en tiempo real método [1-4]. Normalmente, las muestras analizadas por tiempo real PCR primero deben ser procesados de tal manera que el ácido nucleico es extraído y purificado de la muestra clínica. El ácido nucleico extraído se utiliza como reactivo en la PCR para determinar si las secuencias de ADN de interés (es decir, una enfermedad infecciosa agente) están presentes. Las extracciones de ADN se consideren necesarias debido tanto a hipótesis y la observación empírica que la eficiencia de la química PCR puede ser negativa afectados por los mandantes de muestras biológicas. A pesar de que .Es cierto que la contaminación visible de las muestras de ácido nucleico con factores biológicos y químicos capaces de inhibir la PCR, hay muy pocos o ninguno tendencias fiables que describen tales inhibición. reacciones en cadena de polimerasa requieren evaluación sobre una base caso por caso para determinar su eficacia. Aquí, mostramos que el VHS muestras (hisopados diluido en una ampliamente utilizado, disponible en el mercado de transporte viral ) son susceptibles de ser analizadas por PCR en el falta de depuración o la extracción del ácido nucleico. Realización de la PCR en muestras de crudo no requiere ningún sacrificio de especificidad y sólo requiere un sacrificio menor de sensibilidad del ensayo.

MÉTODOS

Las muestras (n = 36) en cuenta para una posible infección por el VHS se obtuvieron de pacientes ambulatorios de la clínica de ETS en Octubre de 2005. Las muestras se tomaron de secreciones de lesiones, erupciones o úlceras de diversos sitios anatómicos, incluidos los genitales (masculino y femenino), rectal (hombres) y facial (masculino). Los hisopos fueron colocados en 2 ml de Cellmatics o Universal kit de transporte y de amortiguación (Becton Dickinson, Sparks, MD). Las muestras se refrigeraron a 4 ° C hasta su análisis, y posteriormente congelado a -35 ° C. Retrospectivo muestras (n = 21), entre junio de 2005 y Octubre de 2005 y almacenadas a -35 ° C, fueron seleccionados para análisis. Especímenes Retrospectivos fueron elegidos entre los hombres (N = 13) y mujeres (n = 8), procedentes de diversos sitios anatómicos (genital, rectal, facial). Alícuotas (1 ml) de todos los posibles y las muestras retrospectivas se combinaban con A549 células (Viromed Laboratories, Minnetonka, MN) en viales cascarón y se colocó a 37 ° C. Los cultivos se visualizan 24, 48, 72 y 168 horas después de la iniciación para la determinación de la presencia o ausencia de efecto citopático, fue observado en un modelo de cultivo, las células de que la cultura se cosecharon y se unta sobre el cristal diapositivas antes de ser sometido a fijos y de inmunofluorescencia utilizando el microscopio PathoDx Herpes Mecanografía Kit (Remel, Lenexa, KS) para confirmar la detección de VHS y VHS para determinar el tipo (1 o 2) Para la detección de HSV por PCR en tiempo real, las muestras (200 microlitros) de cada muestra clínica se combinaron con 200 l de MagNAPure LC tampón de lisis y se someten a extracción automatizada de ácidos nucleicos utilizando un MagNAPure LC (Roche Diagnóstico, Indianapolis, IN) programado para "La extracción Total de ácidos nucleicos que Kit" con la lisis externo. Final evolución volumen de cada muestra a la conclusión de extracción nucleicos fue de 50 microlitros. Las muestras fueron analizadas tanto por PCR inmediatamente después de la extracción, o se conservarse a -35 ° C. PCR para la detección de HSV 1 / 2 de ADN se llevó a cabo utilizando el VHS RealArt 1 / 2 LC PCR Kit (Qiagen, Germantown, MD). Las reacciones fueron puesta a punto y realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En casos de ejemplares extraídos, 5 microlitros de la muestra extraída se agregó a 15 ul de PCR Master Mix y 0,5 l de interior control de ADN. Para las muestras sin extraer, 1 l de clínica modelo que se combinó con 4 l de agua desionizada, 0,5 l de ADN de control interno y 15 ul de PCR Master Mix. Todas las reacciones se realizaron en un 2,0 LightCycler (Roche, Indianápolis, IN). El análisis de datos se llevó a cabo con- LightCycler 4.0, con criterios de detección positiva del VHS se designan como cualquier espécimen debe tener un punto de paso (valor de P + L) menor de 30 (nm utilizando el 640 / nuevo canal de 530 nm

para el análisis). Este valor fue elegido CP de la siguiente manera: En base a los resultados de laboratorio, 10 purificado VHS-2 copias de ADN resultó ser detectable 100% de el tiempo (4 / 4 intentos en un experimento), con la más alta CP valor que se está 26,77. Cinco ejemplares no era detectable (0 / 4 intentos en dos experimentos). Los resultados fueron similares para el VHS-1, con 25,53 siendo el más alto del PP para la detección de 10 copias de ADN purificado. Por lo tanto, para efectos de la presente trabajo, ponemos el límite superior para llamar a una muestra de HSV positivos en aproximadamente tres puntos de cruce superior a 26.77 (para un PC de 30) para dar cuenta de la posibilidad de los retrasos en la amplificación causado por el potencial sin extraer las impurezas cuando se analizan las muestras clínicas. Las muestras con los puntos de paso superior a 30 fueron considerados negativos para el VHS. De conformidad con el Código de Regulaciones Federales Título 45 Parte 46, esta obra es exentos de los sujetos humanos de reconsideración esta investigación implicó el estudio de las muestras de diagnóstico de una manera que los pacientes no pueden ser identificados ya sea directamente o por medio de identificadores vinculados a los modelos.

RESULTADOS

Determinar la factibilidad de la detección eficiente del VHS ADN por PCR en tiempo real en muestras clínicas sin tratamiento .Una vez establecido PCR en tiempo real dentro de nuestro laboratorio el método de elección para la detección de HSV en muestras clínicas, hemos tratado de explorar la eficacia temporal de nuestros PCR en tiempo real interno. Hemos encontrado que aproximadamente 50% (2 hrs.) Del tiempo total necesario para ejecutar el ensayo procedimiento fue empleado en el proceso de extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas. Investigamos si sería posible detectar ADN del VHS en el crudo (Sin extraer) las muestras clínicas, utilizando el mismo real Tiempo de reactivos para la PCR y los métodos actualmente utilizados en nuestra laboratorio. Nuestra hipótesis es que la naturaleza diluida de la muestras de frotis que analizan regularmente, junto con el típica falta de cualquier contaminación visible de la de transporte viral buffers permitiría muestras a analizar directamente por PCR. También se consideran en esta hipótesis, se el hecho de que los primeros 10 minutos de nuestro procedimiento de PCR incluyó un paso de desnaturalización 95 ° C, lo que podría permitir disociación adecuada de ácido nucleico viral de otros virus y componentes de acogida. Exploramos la posibilidad de PCR en tiempo real para la detección sin extraer de HSV en muestras clínicas mediante el análisis de tres muestras que recientemente se habían detectado y escrito en nuestro laboratorio. Las tres muestras clínicas

incluido un positivo HSV-1, HSV-2 positivos y negativos VHS, (según lo determinado por cultivo celular y el IFA). Estos tres ejemplares (200 l cada uno) fueron sometidos a automatizada extracción de ácidos nucleicos con un volumen de elución de 50 ml por muestra. muestras extraídas (5 microlitros) fueron analizadas a continuación, por el VHS 1/2- PCR específico en tiempo real. Simultáneamente a esto, muestras de los mismos tres especímenes clínicos fueron también μl analizadas por PCR en tiempo real, utilizando 5, 2,5 y 1 de crudo, sin extraer muestras combina con el agua (si es necesario) para alcanzar un volumen final de 5 microlitros. Como se muestra en la Figura 1, la curvas de amplificación de 5 l de muestras extraídas fueron casi idénticas a las curvas generadas cuando sea 1 μl o 2,5 l de muestra de crudo se analizó. Este hallazgo fue cierto tanto para el VHS-1 y HSV-2 muestras analizadas (Figuras 1A, 1B). El uso de 5 microlitros de muestra clínica sin extraer no parece alterar significativamente el cruce puntos de cualquiera de las muestras en relación con la muestra extraída. Sin embargo, el uso de 5 microlitros de muestra sin extraer tenía un impacto sobre algún aspecto de la amplificación y detección proceso, tales como curvas poseen composiciones irregulares, con fluorescencia máxima mucho menor. Conocido negativos muestra clínica no mostró amplificación cuando el 5, 2,5 ó 1 l de crudo, sin extraer muestras fueron sometidos a la PCR en relación con la versión extraída de la mismo espécimen (Figura 1C).

Todas las reacciones de PCR en tiempo real era un interno de control que utilizan los mismos iniciadores, sino una diferente la sonda de los utilizados para detectar el VHS (las sondas para estos los controles internos emiten luz en una longitud de onda de 705 nm) (Figuras 1D, 1E y 1F). El control interno de las reacciones funcionado correctamente (es decir, que mostró una amplificación exponencial) para todos los modelos que figuran en las figuras 1A, 1B y 1C cuando ya sea 1 o 2,5 l de muestra fue analizada. Sin embargo, en cada caso en 5 l de muestra clínica crudo analizados, los controles internos o bien no para amplificar eficaz (figuras 1D, 1E), o no ampliar a todos la figura (1F) indicando que la química fundamental de la PCR se vio afectada negativamente por algo en la muestra cruda, pero que una cantidad significativa de la muestra de crudo estaba obligada a añadir a la reacción de esta situación tan negativa impacto que se produzca. En los casos en que el VHS-1 y VHS-2- muestras clínicas fueron probados (figuras 1D y 1E), amplificación del control interno sólo se retrasó cuando el 5 l de muestra clínica se utilizó. Por lo tanto, estos especímenes habría sido todavía considerados como muestras válidas para su análisis mediante el protocolo de prueba utilizado en el mismo. Sin embargo, en el caso de la muestra clínica negativa en que 5 microlitros de muestra prima se puso a prueba (Figura 1F), la amplificación del control interno se

inhibió completamente. Esta muestra no habría sido considerado "negativo" para el VHS. Más bien, este modelo se han tenido en cuenta inválida, y una muestra clínica adicional de el paciente tendría que haber sido ordenado. Evaluación de desempeño de la técnica con extraído y sin extraer muestras prospectivos y retrospectivos Con la evidencia preliminar de que el crudo, sin extraer clínica muestras de frotis, cuando se usa en las cantidades adecuadas, son adecuada para el análisis de PCR directa, intentamos determinar la capacidad de repetición de este hallazgo. Prospectivo y consecutivo Las muestras enviadas a nuestro laboratorio para su análisis VHS (n = 36) fueron sometidos a aislamiento intentada por cultivo celular. Todas las culturas con las pruebas del efecto citopático se posteriormente se probaron por ensayo de inmunofluorescencia (IFA)

para escribir. Simultáneamente a estas pruebas, las muestras fueron sometido a PCR en tiempo real el VHS-específica en cualquiera extrajeron (5 microlitros) o no extraída (1 microlitro) forma. Aunque ambos 1 μl y 2,5 l de muestra de crudo se desempeñaron adecuadamente en PCR en nuestro estudio inicial de viabilidad, como se muestra en las figuras 1A y 1B, se optó por utilizar 1 μl para el resto del estudio en razón de que tal volumen se podría aplicar un menor cantidad de posibles factores de inhibición, en su caso, en la muestra clínica. Como se muestra en la Tabla 1 [ver adicionales Archivo 1], utilizando un punto de paso de 30 como el límite de detección, la capacidad de detectar ADN del VHS (ya sea tipo 1 o tipo 2) en las muestras clínicas era perfectamente concordantes para extraídos y sin extraer las muestras. La tipificación genética de las muestras positivas, bien como el VHS-1 o VHS-2 también 100% concordantes entre extraídos y sin extraer especímenes. Una muestra decidido a ser indetectable por el método de cultivo viral resultó ser positiva por Si la reacción de PCR se realizó en extraídos o muestras de crudo de ese espécimen. Estos resultados refuerzan nucleicos que las extracciones no son necesarios cuando se analizan muestras clínicas para detectar la presencia de ADN del VHS por PCR.

VHS especímenes clínicos, analizados por PCR en tiempo real Uso Extraído y sin extraer muestras. especímenes clínicos, analizados por PCR en tiempo real Uso Extraído y sin extraer muestras. Clínico muestras resultaron positivas para el VHS-1 (A), el VHS-2 (B), o que tengan resultados negativos para el VHS (C) cuando se analizaron mediante cultivo celular e inmuno fluorescencia fueron analizadas por microscopía en tiempo real utilizando PCR ácido nucleico extraído y sin extraer muestras de cada muestra. La amplificación de las curvas de los controles internos de las reacciones que se muestran en A, B y C se muestran en la D, E y F respectivamente. Para las muestras extraídas, 200 l de una muestra clínica (en tampón de transporte viral) fue sometido a total automatizada extracción de ácidos nucleicos con un volumen de elución de 50 μl, 5 l de la muestra diluida se analizó. Para las muestras sin extraer, 5 microlitros, 2,5 μl y 1 l

de recta muestra clínica se analizaron. Las muestras fueron tomadas por hisopado de lesión genital de un macho (A, D) o hembra (B, C, E, F). Los hisopos fueron colocados en una solución tampón de transporte viral y se almacenan congelados (-35 ° C) hasta su análisis. Las sondas de hibridación de ADN del VHS se detectaron en el canal de 640 nm de un 2,0 Light Cycler. Las sondas de ADN específicas para el control interno se detectados en el canal 705 nm. El control positivo PCR en tiempo real en la figura 1c fue de 10.000 copias de un plásmido purificado que contiene VHS-2 objetivo un fragmento de ADN (proporcionado por el kit de PCR en tiempo real).

Estos datos también indican que la PCR puede seguir siendo un más sensibles método de cultivo viral como medio de detección de HSV, si la muestra analizada se somete a extracción del ácido nucleico antes del análisis. Todas las muestras resultaron negativas por PCR en tiempo real poseía exponencial curvas de amplificación de PCR de control interno (datos no se muestra). Para determinar si el origen fisiológico de la clínica modelo que afecta a la extracción si es necesario para análisis de PCR, ampliamos nuestro análisis a posteriori para incluir 21 muestras evaluadas. Las muestras fueron seleccionados para que una serie de muestras de varios anatómicas sitios, de ambos sexos, sería representado. Por otra parte, una retrospectiva de los ejemplares fue elegido

seleccionada debido a que había sido considerada como negativa mediante cultivo celular, pero positivo por PCR (extracción) en nuestro laboratorio. Este ejemplar fue analizado con el fin de determinar si la mayor sensibilidad demostrada por PCR en cultivos celulares utilizando muestras extraídas puede mantenerse cuando el PCR se realizó con sin extraer las muestras. Como se muestra en la tabla [2 véase el archivo adicional 2], los resultados de la PCR ensayo de extraer y sin extraer las versiones de todos los retrospectiva muestras indican que ambas formas de especímenes eran detectables. Una muestra que se previamente determinados como negativos por medio de cultivo celular y positivas por PCR en tiempo real resultó ser positivo por PCR si el espécimen fue sometido a extracción. Todas las muestras resultaron negativas por tiempo real PCR posee curvas exponenciales de amplificación de de control interno de PCR (datos no mostrados). Estos datos confirman que la extracción del ácido nucleico de muestras clínicas de HSV no es necesaria antes de la detección por PCR, y que el aumento de la sensibilidad de la PCR en cultivo de células para el VHS de detección al menos no es totalmente sacrificado cuando el fase de extracción se pasa por alto. Por otra parte, estos datos indican que las muestras clínicas tomadas de una variedad de anatomía sitios pueden ser objeto de PCR de ácidos nucleicos, sin previa extracción. Comparación de la sensibilidad de la PCR utilizando extraídos y sin extraer muestras Sobre una base cualitativa, los datos en los cuadros 1 y 2 [véase Archivos adicionales 1 y 2] show 100% de concordancia de la PCR resultados para extraer y sin extraer las muestras clínicas. Sin embargo, la inspección de los valores de cada punto de cruce muestra analizada revela una tendencia a la

disparidad entre extrae y extrae muestras de las Naciones Unidas-. Para prospectiva analizaron el VHS-2 ejemplares, el promedio de punto de cruce de muestras extraídas fue 14,69, mientras que el promedio de cruzar punto por las mismas muestras analizadas en sin extraer forma era 16.26 (una diferencia de 1,57). Del mismo modo para los futuros HSV-1 muestras, el promedio de extraer y sin extraer muestras fueron 15,68 y 17,17, respectivamente (Una diferencia de 1,49). Estas diferencias indican que las muestras analizaron en forma extraídos son más fácilmente detectó que las muestras se ejecutan en forma sin extraer. Tal

diferencia era de esperar, sobre la base de la metodología: Durante la extracción del ácido nucleico, 200 l de muestra clínica se lisa, purificada, y finalmente eluye en 50 l de elución búfer. Por lo tanto, suponiendo que la extracción de ácidos nucleicos resultó en un 100% de recuperación de ADN del VHS, la muestra eluida teóricamente equivalentes consta de 4 l de originales muestra clínica (200 l original specimen/50 μl eluye muestra) por microlitro. Cuando el 5 l de extraer, eluye muestra se analiza por PCR, esto se correlaciona con 20 μl equivalente de la muestra clínica original. En este estudio, cuando el misma muestra clínica se analizó en forma sin extraer, sólo un 1 l de muestra clínica original se utilizó. Esta diferencia en la cantidad de extraer y sin extraer de los utilizados en la polimerización en cadena a entender que la sensibilidad teórica aumento de la VHS PCR utilizando extraídos frente sin extraer las muestras debe ser de al menos 20 veces. Otros han encontrado sin embargo, que el proceso automatizado de extracción de ácidos nucleicos se utilizó en este documento resulta en mucho menos de 100% de recuperación de ácidos nucleicos a partir de muestras [5]. Por lo tanto, tratamos de determinar el rendimiento de ácido nucleico la extracción con este método automatizado en nuestro laboratorio. Para hacer esto, se utilizaron plásmidos que contienen cuantificados VHS Fragmentos de ADN de destino (proporcionado por el kit de PCR en tiempo real), junto con muestras conocidas clínicos negativos VHS. Tales formulaciones pinchos que contengan cantidades conocidas de VHS fragmento de ADN diana fueron sometidos luego a nucleicos extracción de ácido, y las muestras eluidas fueron cuantificados por PCR en tiempo real. VHS-2 fragmentos de ADN de destino (90.000 copias en 200 l de no VHS que contienen (negativo) clínica muestra) fueron sometidas a extracción automatizada, y se eluyeron a un volumen final de 50 microlitros. Tras cuantitativos análisis de PCR mostraron que el rendimiento medio (recuperación) de tres extracciones fue de 24,1%. El uso de este factor, una Comparación de las sensibilidades de la utilización de extraer y sin extraer muestras de PCR fue examinada de nuevo: En el contexto de este trabajo, utilizando 5 microlitros de la muestra extraída se en realidad el equivalente de analizar sólo el 4,8 l de originales muestra. Por lo tanto, la sensibilidad de la PCR para la detección de VHS utilizando muestras extraídas es de aproximadamente 5 veces sólo

mayor que la sensibilidad de la PCR mismo usando sin extraer muestra. De acuerdo con esto, tenemos que rutinariamente encontrados con el VHS RealArt 1 / 2 LC PCR Kit de que un 3-ciclo diferencial punto de cruce se correlaciona con una aproximación 10 veces la diferencia en la concentración objetivo de ADN. Esta de acuerdo con la afirmación de que extrajeron especímenes poseen puntos de paso de aproximadamente 1,5 ciclos menor que las de sus homólogos sin extraer.Para evaluar la sensibilidad de la PCR en sin extraer muestras clínicas, se realizó un análisis en tiempo real PCR en diluciones de las poblaciones previamente cuantificada de patientderived VHS partículas. HSV-1 y VHS-2 que contienen las poblaciones de 3,4 × 107 y partículas de 1,02 × 108 virus por mililitro respectivamente, fueron objeto de dilución en serie dos veces con un muestra clínica, el VHS-negativas como diluyente. Las diluciones PCR fueron sometidos a tiempo real en forma sin extraer de determinar la dilución máxima de conjunto, sin extraer partículas de virus detectable por el ensayo. Para el VHS-1, un diluido teóricamente muestra contiene 17 partículas virales (1 l de un 1 / 2000 de dilución) fue la dilución máxima detectable, dando un valor del punto de cruce de las 27,98. Para el VHS-2, un muestra diluida en teoría contiene 32 partículas virales por microlitro (1 l de un 1 / 3200) fue la máxima detectable dilución, dando un valor del punto de cruce de las 26,59. Purificada HSV-1 y HSV-2 objeto estándar de ADN (proporcionado por el kit) se encontraron para ser detectado en un nivel mínimo de 10 copias en 4 de 4 reacciones, con la más alta detectada cruce de los valores de punto que se encuentre 26,77 para el VHS-2 y 25,53 para HSV-1. Estos datos confirman que hay una pérdida de sensibilidad para PCR en tiempo real cuando el VHS se detecta en el sin extraer forma en comparación con la detección de ADN purificado.

DISCUSIÓN

Los datos que se describen en este trabajo indican que en tiempo realPCR para la detección del virus del herpes simple se puede realizarsin extracción y purificación de anteriores ácidos nucleicos de muestras clínicas. Es importante subrayar que esta afirmación se hace sólo en el contexto de los especímenes recogidos por hisopos que se han puesto encontacto con las zonas anatómicas y diluido posteriormente en un búfer de transporte comúnmente utilizados viral. Las muestras recogidos de esta manera probablemente contienen muy poco los desechos fisiológicos, y lo poco que los residuos se lleva a por el hisopo se diluye en gran medida en el buffer de transporte. Por otra parte, el primer paso de esto (y muchas protocolo PCR) consiste en 10 minutos a 95 ° C. A esta temperatura, muchas biomoléculas se desnaturaliza y solubilizado, lo que permite a los lípidos y complejos de proteínas de disociar, lo que permite para la exposición de la meta ácidos nucleicos para la detección de la químicareactivos (por ejemplo, los cebos, sondas, enzimas). Por otra parteprotocolos de PCR convocatoria de una cantidad relativamente pequeña de tal muestra diluida se coloca dentro de la reacción de PCR, más-diluir cualquier inhibidores potenciales. Sea o no La RCP puede llevarse a cabo en materia de no extraer, sin depurar muestras es ciertamente una cuestión que deberá establecerse de forma empírica sobre una base caso por caso. Sin embargo, los datos facilitados en este documento implica que muy bien puede valer la pena considerar omisión de medidas de extracción de ácido nucleico en los casos en dilución de inhibidores potenciales lleva a cabo durante espécimen de recogida o en casos en que la clínica recogidamodelo que se piensa que es relativamente libre de potencial inhibidores. Ciertas condiciones de la demanda que el ácido nucleico extracción y purificación se realizaron antes del PCR.Esto es cierto para protocolos relativos a los virus de ARN, donde transcripción inversa del ARN en ADN debe llevarse a cabo antes de la PCR. Dado que los protocolos en cuestión afectan a la transcripción reversa pasos que se realizan a temperaturas relativamente más bajas(A menudo 48 ° C) antes del paso de desnaturalización (95 ° C o mayor), el acceso de las enzimas de ARN viral se requiere.Los intentos para realizar la transcripción inversa-PCR en muestrasse sabe que contienen el virus A (un virus de ARN) en nuestro laboratorio no tuvieron éxito sin la extracción de y purificación de ácidos nucleicos.Nuestro uso de la PCR para la detección de HSV en muestras en lugar deextracción de ácidos nucleicos no sin cierto sacrificio en la sensibilidad del ensayo. Usando 1 l de primas muestra clínica dado lugar a una reducción aproximada de 2 a 5 veces en el sensibilidad relativa a si se extraen las muestras fueron utilizadas. Sin embargo, este nivel de pérdida de sensibilidad no parece considerable en términos de detección de la infección en los pacientes. Es típica de las

lesiones cutáneas causadas por el VHS para que secrete muy alto concentraciones de partículas de virus [1]. Esto es corroborado por el estudio de este documento que participen tanto prospectivos y retrospectivos muestras clínicas. En todos los clínicos positivos ejemplares detectados, el más alto el valor punto de paso identificados por PCR de muestras sin extraer fue 24,98, con la gran mayoría de las muestras positivas que posee el cruce valores de punto menos de 22, que corresponden a aproximadamente 500 partículas de virus por microlitro en nuestro ensayo (Datos no mostrados). Por lo tanto, parece que la consecuencia pérdida de sensibilidad de aproximadamente 1,5 punto de paso de Los valores para el análisis de las muestras sin extraer muy se rara vez se hacen indetectables una muestra positiva de la sin extraer PCR en tiempo real método. En este conjunto de datos, Se identificaron dos muestras positivas (con cultivo negativo, PCR-positivos mediante extrajeron muestras de especímenes) que fueron detectados fácilmente por PCR en tiempo real cuando está cruda, sin extraer Se analizaron muestras de especímenes. También hay que señaló que en este estudio, se optó por analizar sólo 1 l de muestra clínica. Esta cantidad fue elegido en el interés de generar una estimación conservadora de las capacidades de sin extraer de PCR para VHS, mientras que, además, el mantenimiento de una baja probabilidad de llevar más de un inhibidor fisiológico a la PCR. Nuestros resultados muestran que tanto como 2.5 μl podría ser analizados por reacción. Si dicha cantidad se utilizó, entonces la diferencia de sensibilidad entre PCR en extrajeron y sin extraer muestras podría ser inferior a dos veces. Además, los datos aquí indican que el uso de un cruce valor en puntos de 30 como límite para la detección de la impura especímenes pueden haber sido innecesariamente elevados. Tomando nota de que el más alto punto de cruce generado para un sin extraer espécimen fue 27,98 por el monto más pequeño detectado de virus completo (17 VHS-1 partículas), tenemos la intención de considerar 28, como máximo, punto de paso para la asignación de estado positivo a un modelo. El uso de PCR, sin una extensa extracción de ácidos nucleicos de especímenes no carece de precedentes. Cadena de la polimerasa reacción para la detección de Bordetella pertussis ha sido fiable utilizando hisopos logrado sólo agitado en el agua y calentado por diez minutos [6]. PCR en tiempo real para la detección y cuantificación de vectores virales adeno-asociado Se ha demostrado que funcionan muy bien de manera rutinaria, con una pérdida aproximada de dos veces en la sensibilidad en la capacidad de detectar sin extraer las partículas de AAV en relación con los sujetos a la extracción de ácidos nucleicos [7]. Otras simplificaciones en el proceso global de la utilización de PCR para diagnosticar las infecciones por VHS se han demostrado ser eficaces. Filen et al han demostrado que hisopos de algodón seco en un tubo de transporte vacíos son tan eficaces como los colocados en tampón de transporte viral cuando se utiliza posteriormente en en tiempo real PCR [1]. Estos hallazgos, junto con las del presente trabajo, puede funcionar bien

juntos hacia el establecimiento de un protocolo simplificado enormemente el diagnóstico. Simplificación de los el protocolo general un fuerte riesgo de eliminar la posibilidad de contaminación durante el procesamiento de la muestra, mientras que el acortamiento ensayo de tiempo. En tiempo real, PCR cuantitativa se está convirtiendo en habitual en tanto en la clínica y de laboratorio de salud pública ajustes. El costo de los consumibles, reactivos y mano de obra que se necesarios para el funcionamiento de un laboratorio con capacidad de PCR puede ser prohibitivo. Por lo tanto, los estudios que evaluar críticamente la relevancia de los pasos individuales de los protocolos complejos, tales como PCR puede resultar en modificaciones a los protocolos que ahorran tiempo y dinero, con un sacrificio mínimo en el rendimiento del ensayo.

CONCLUSIÓN

Las muestras clínicas de las lesiones que consiste limpió el pensamiento que es causada por el virus del herpes simple (VHS tipo 1 o 2) pueden ser analizados por PCR en tiempo real en lugar de ácido nucleico extracción y purificación. Análisis de muestras en tiempo real por PCR sin extracción anterior o purificación de resultados de ácido nucleico en un aproximado de 2 a la pérdida de 5 veces en sensibilidad, sin pérdida apreciable de especificidad. La sensibilidad una pérdida que ocurre cuando las muestras se analizan en de esta manera sigue los resultados en un ensayo muy sensible en relación con cultivo celular basada en el aislamiento. Por otra parte, la exclusión de resultados de extracción por ácido nucleico en un ahorro considerable en tiempo y dinero.

Competir intereses El autor (s) declaran que no tienen intereses opuestos. Contribución de los autores PCM diseñado el experimento realizado algunos de los la experimentación, analizados los datos y el autor de la manuscrito. JL y EHW llevaron a cabo experimentos. JDK conseguidas muestras clínicas y junto con SL, a condición de supervisión del proyecto