Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de...

Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Reacciones enzimáticas en temperaturas extremas

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa


Introducción a los extremófilos

• ¿Qué son?– Microbios viviendo donde nadie más puede

Extremófilos

• ¿Cómo sobreviven?– Extremo-enzimas

• ¿Por qué son interesantes?– El anzuelo para tener a los estudiantes interesados

• Los extremos nos facinan– Vida en otros planetas

• Las aplicaciones prácticas son interesantes


Extremófilos

Historia– Se suponía su existencia hace 30 años– Se suponía su existencia hace 30 años– Conocidos y estudiados por cerca de 20 años

• Temperaturas extremas– ebullición o congelamiento, 100 °C a 4 °C (212 °F a 34 °F)

• Químicos extremos– vinagre o amonia (<5 pH o >9 pH)– Alta salinidad, más del doble del agua de mar

(1 M Na Cl )


FE"OTIPO MEDIO AMBIE"TE

GÉ"ERO TÍPICO

Termofílico 55 – 80 oC Methanobacterium, Thermoplasma, Thermus*,

algunas especies de bacillus

Hipertermofílico 80 – 113 oC Aquifex*, Archaeoglobus, Hydrogenobacter*,

Methanothermus, Pyrococcus, Pyrodictium,

Extremófilos y su medio ambiente

Methanothermus, Pyrococcus, Pyrodictium,

Pyrolobus, Sulfolobus, Thermococcus,

Thermoproteus, Thermotoga*

Psicrofílico -2 – 20 oC Alteromonas*, Psychrobacter*

Halofílico 2 – 5 M NaCl Haloarcula, Halobacterium, Haloferax, Halorubrum

Acidofílico pH < 4 Acidianus, Desulfurolobus, Sulfolobus,

Thiobacillus*

Alcalifílico pH > 9 atronobacterium, atronococcus, algunas especies de bacillus*

* Género del dominio bacteria, todos los otros son “Archaea”


Temperaturas extremas

• Termófilos - Altas temperaturas– Respiraderos térmicos y fuentes calientes

– Podrían ir de la mano con los químicos extremos– Podrían ir de la mano con los químicos extremos

• Psicrófilos - Bajas temperaturas– Ártico y Antártico

• ½ de la superficie de la tierra es oceano entre 34 y 38 °F

• La mayoría cuentan con la fotosíntesis


Químicos extremos

• Acidófilos - Ácidos– Otra vez respiraderos térmicos y algunas fuentes calientes

• Alcalífilos - Alcalinos– Lagos de sosa en África y el oeste de USA

• Halófilos – Altamente salinos– Lagos salados naturales y estanques artificiales

– Algunas veces ocurre con alcalinidad extrema


Sobrevivencia

• Temperaturas extremas– Cada parte del microbio debe

funcionar al extremofuncionar al extremo• Enzimas “rudas” para Termófilos • Enzimas “eficientes” para

Psicrófilos

– Muchas enzimas de estos microbios son interesantes

Life at High Temperatures, Thomas M. Brock


Sobrevivencia

• Químicos extremos– El interior de la célula es “normal”

– El exterior protege la célula• Los Acidófilos y Alcalófilos excretan substancias protectoras y

enzimas

• Los Halófilos tienen altas concentraciones de un soluto en el interior por protección

– Algunas enzimas de estos microbios son interesantes


Aplicaciones prácticas

• Extremo-enzimas�Enzimas de Extremófilos

– Industria & Farmacéutica

• Qué sucede si quieres una enzima para trabajar … – ¿En una industria caliente?

– ¿Un tanque de una solución fría?

– ¿En un estanque ácido?

– ¿Aguas residuales (amonia)?

– ¿Una solución altamente salina?


Una solución puede ser

• Pagar a un ingeniero genetista para que diseñe unas “super” enzimas ...– Enzimas resistentes al calor

– Subrevivan a bajas temperaturas

– Capaces de resistir ácidos, álcalis y/o sales

• Esto podría tomar años y mucho dinero


Los extremófilos llegaron primero

• La Naturaleza nos ha dado ya la solución a estos problemas– Los extremófilos tienen las enzimas que trabajan en condiciones

extremasextremas

Endolithic algae from Antarctica; Hot springs in Yellowstone National Park, © 1998 Reston Communications, www.reston.com/astro/extreme.html


Termófilos

Obsidian Pool,Yellowstone National ParkHydrothermal Vents


Termófilos

• Las aplicaciones prácticas más interesantes por mucho

– Muchos procesos industriales involucran altas temperaturas– 45 oC (113 oF) es un problema para la mayoría de las enzimas– El primer extremófilo se encontró hace 30 años– El primer extremófilo se encontró hace 30 años



Psicrófilos


Psicrófilos

• Enzimas eficientes para trabajar en el frío

– Enzimas para trabajar en alimentos que – Enzimas para trabajar en alimentos que necesitan estar refrigerados

– Detergentes para lavado en frío

Algal mats on an Antarctic lake bottom, © 1998 Reston Communications, www.reston.com/astro/extreme.html


Acidófilos

pH 0-1 of waters at Iron mountain


Acidófilos

• Enzimas usadas para incrementar la eficiencia de la incrementar la eficiencia de la alimentación animal– Las enzimas ayudan a los

animales a extraer nutrientes de los alimentos

• más eficientes y menos caros



Alcalífilose.g. Mono Lake alkaline soda lake, pH 9 salinity 8%


Alcalífilos

• Pantalones “deslavados”• Pantalones “deslavados”– Enzimas Alcalifilicas suavizan telas y liberan algunos de los

colorantes, dando una apariencia y sensación de usado

• Detergentes– Enzimas para disolver proteinas o grasas– Enzimas Alcalófilicas pueden trabajar con detergentes


Halófilos

solar salternsOwens Lake, Great Salt Lakecoastal splash zonesDead Sea


Halófilos

• Únicamente usos experimentales• Extracción de petróleo

– Los pozos petroleros son calientesy frecuentemente salados

Image from NASA, http://pds.jpl.nasa.gov/

y frecuentemente salados– Las enzimas de Halófilos son usadas en múltiples

etapas del proceso• Inyectar una substancia gomosa mezclada con arena• La goma ayuda a la arena a fluir dentro de pequeñas

fracturas• Hacer estallar la explosión• La arena mantiene pequeñas hendeduras abiertas• La enzima, activada por calor, disuelve la goma así el

petróleo puede fluir al exterior


MICRO-ORGA"ISMOS

E"ZIMAS Y OTRAS BIOMOLÉCULAS

APLICACIO"ES Y PRODUCTOS

Termófilos

(50-100 oC)

Amilasas, glicosidasas

Lipasas

Procesamiento de alimidón, glucosa, fructosa, trealosa, digestión de lactosa en leche, enzimas de sacarificación, síntesis de oligosacáridosTratamiento de aguas residuales, formulación de detergentesBlanqueo de papel

Ejemplos de enzimas y otras biomoléculas aisladas de extremófilos y sus aplicacuiones previstas

XilanasasProteasas

DNA polimerasa

Blanqueo de papelProcesamiento de alimentos, detergentes, producción de amino ácidosIngeniería genética

Psicrófilos

(0-20 oC)

Amilasas, proteasas, lipasas

Deshidrogenasa

Agentes degradadores de polímeros en detergentes

Biosensores

Alcalífilos

pH ≥ 9

Celulasas, proteasas

Amilasas, lipasas

Ciclodextrinas

Agentes degradadores de polímeros en detergentes

Aditivos de alimentos

Halófilos

3-20 % de sales

Solutos compatibles

Membranas

Medicinas

Aditivos de cosméticos


Estructura y función de las extremo-enzimas

Se ha encontrado que muchas enzimas termofílicas son sustancialmente estabilizadas a altas temperaturas por altas presiones. presiones. Este efecto parece correlacionarse con la hidrofobicidad interna y/o rigidez estructural de la proteína.Estudios a altas presiones han ayudado a elucidar la importancia de la interacciones hidrofóbicas y la flexibilidad interna en la estabilización de la proteína. Significativa activación por presión ha sido observada también para algunas proteínas termofílicas


Protección de la enzima

• Los termófilos extremos contienen enzimas (extremoenzimas) que están equipadas para trabajar a altas temperaturasaltas temperaturas

• Las extremoenzimas mantienen su estructura 3-D junta doblándose apretadamente

• Los termófilos también contienen una pequeña cantidad de glicina.

• Glicina: un aminoácido que ayuda a la proteína a ser flexible


¿Pueden las propiedades de las extremoenzimasser referidas a sus características estructurales específicas?

• Pueden las propiedades de lasextremoenzimas ser únicamente explicadas en términos de:

• Puentes de hidrógeno

• Uniones salinas

• Interacciones hidrofóbicas

• Composición de amino ácidos

• Composición de la estructura secundaria

• Rigidez de la cadena principal

• Estabilidad del núcleo

• Cargas superficiales

• etc…...


Dihidrofolato reductasa Halofílica(archaeon Haloferax volcanii) del Mar Muerto

• La estructura contiene unincremento en el número de puentes salinosde puentes salinos

• La superficie de lamolécula esta cubierta con residuos acídicos

• Concuerda con otras estructuras halofílicas:

• Malto deshidrogenasa y2Fe-2S ferredoxina


Comparación de dihidrofolato reductasa halofílicacon mesofílica

• Halofílica mesofílica


Alfa-amilasa Psicrofílica

La alfa-amilasa adaptada al frío tiene:

• Pocas uniones salinas

• Interactions aromáticas reducidas dentro del núcleo hidrofóbico

• Reducción en número de Pro y Arg

• Reducción de hidrofobicidad

• Incremento en el número deinteracciones con el solvente

• Estructura reducida, adaptada para actividades a bajas temperaturas


Thermophilic subtilisin

Thermophilic subtilisin tiene:Thermophilic subtilisin tiene:

• 276 enlaces H en comparación a 259 paramesofílicos

• 7 uniones salinas encomparación a 2 paramesofílicos


Comparación entre subtilisin termofílica y mesofílica

• Termofílica mesofílica

• Subtilisn tiene las propiedades de una enzima termoestable promedio


Thermophilic rubredoxin

Rubredoxin representa una pequeñaenzima termofílica (solamenteenzima termofílica (solamente54 aa) la cual es estable hasta 110°C.

Contiene 6 nuevos enlaces H y unanueva unión salina comparado con la enzima mesofílica


Comparación de rubredoxin termofílica y mesofílica

• Termofílica mesofílica


Gliceraldehido - 3 - fosfato deshidrogenasa termofílica

GPD es una enzima GPD es una enzima tetramérica

El enrollamiento y estabilidad del tetrámero es manejado por entropia. 120 nuevos enlaces H han sidoformados, pero no nuevas uniones salinas


Aldehido Ferredoxin Oxidoreductasa


Resumen de los cambios establecidos en termofílicos

Intercambio de los cinco principales residuos

En hélices:

• Gly a Ala

• Asp a Gln

• Phe a Leu

• La densidad de enlaces hidrógeno al solvente se incrementa

• El incremento de la densidad de nitrógeno (R) y oxígeno sobre la superficie = el incremento de la interacción electrostática• Phe a Leu

• Val a Ala

• Lys a Arg

En hebras:

• Val a Ile

• Gly a Ala

• Ser a Thr

• Lys a Arg

• Leu a Ile

interacción electrostática

• Evidencia de doblamiento por entropia

• La densidad de enlaces hidrógeno internos se incrementa

• Las uniones salinas se incrementaron en 30% de los casos

• Incremento en hélices y hebras, mientraspuentes-β, vueltas y enrollamientos son reducidos

• Gly a Ala y Lys a Arg son las mutaciones principales

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