1. PSD se refiere a un método de detección y medida

de las masas de fragmentos de iones que se forman

a partir de un ión precursor seleccionado.

2. Los fragmentos de iones se forman principalmente

por descomposición unimolecular después que los

iones precursores están completamente acelerados

(después que dejan la fuente de iones, en el tubo de

vuelo, de ahí el nombre de post-source decay)

3. Los fragmentos de iones son separados y

detectados en el reflectrón.

Post Source Decay (PSD)

Detector

Iones de igual m/z con velocidades diferentes

Reflectron (espejo iónico): compensa la variación de energía cinética de los

iones al abandonar la fuente (100 eV a 1 keV) reflejando los iones hacia atrás

a lo largo del mismo camino de vuelo antes de detectarlos.

La trayectoria de vuelo de un ion puede ser incrementada incorporando un

“espejo iónico” o reflectron al final del tubo de vuelo. Tal dispositivo retarda y

luego revierte las velocidades iónicas para corregir diferencias menores en energía

cinética entre iones de la misma relación m/z, y así minimiza variaciones en los

tiempos de vuelo y mejora la resolución y la precisión de los valores de masa.

Laser

ReflectronFuente

Detector

lineal

Detector

reflector

La descomposión

tiene lugar en

cualquier punto del

tubo de vuelo

La descomposición tiene lugar en el tubo

de vuelo.

No.

de

iones

Energía interna

Los fragmentos se obtienen por descomposición de los iones originales, que ocurre en el tubo de vuelo, es

decir, después de que los iones salieron de la fuente.

La descomposición se debe a la energía interna del ión precursor. Sólo una pequeña fracción de los iones

precursores tiene suficiente energía para fragmentarse. Esta energía puede aumentarse usando una

intensidad del laser mas elevada.

EL FUNDAMENTO DE PSD

Cuando los iones precursores se fragmentan, la

velocidad de los fragmentos es igual a la del precursor,

por lo cual viajarán todos juntos en el tubo de vuelo.

Esto se debe a que la velocidad es determinada por la

aceleración inicial; si la energía inicial es 20 keV, las

energías de la unión química están alrededor de 10 eV,

de modo que la ruptura de una unión tendrá un efecto

mínimo sobre la velocidad.

Los aparatos usados tienen un selector de velocidad

(Bradbury-Nielsen gate), que permite seleccionar al ión

precursor y a sus fragmentos para que pasen a su

través y lleguen al reflectrón.

El ión molecular precursor intacto tiene una energía cinética traslacional KEM = ½ Mv2, siendo M su

masa y v su velocidad. Un fragmento del ión precursor tiene una energía cinética traslacional KEm =

KEM (m/M), siendo M la masa del precursor y m la del fragmento.

Estas diferencias hacen que los iones precursor e hijos sigan diferentes caminos en el reflectrón. ¿Cómo

se hace para que los fragmentos que están viajando a la misma velocidad que el precursor pero tienen

una energía cinética reducida lleguen enfocados al detector? Variando la pendiente del gradiente de

voltaje del reflectrón a través del rango de masas de los fragmentos. Esto llevaba tiempo, y se ha

solucionado en los sistemas de MALDI-ToF-ToF, que tienen un dispositivo que re-acelera los fragmentos

y iones moleculares remanentes y luego se los re-enfoca. Esto permite obtener el espectro completo de

iones a un voltaje fijo del reflectrón.

La secuenciación de péptidos usando PSD MALDI ha sido posible en principio desde

hace mucho tiempo, pero se la usaba poco por su difícil interpretación. Hubo un

avance dramático con el desarrollo de la derivatización del péptido antes de la PSD,

sulfonando el NH2 terminal.

La sulfonación dirige la fragmentación a la unión peptídica, dando los fragmentos b e y,

y neutraliza los fragmentos b, que tienen el NH2 terminal del péptido, con lo cual se

obtiene una serie única de iones y. La distancia entre dos picos adyacentes del

espectro representa un aminoácido.

Dos reactivos comunes para sulfonación son ”CAF” y

”SPITC”:

N O

O

O

O

H2N

H

Pep

R2

+H

R2

Pep

O

NHS

O

OHO

S OH

O

O RT, pH>9

NHS-ester of 3-Sulfo-

propionic acid anhydrideMass addition, +136 Da

Agrega 215 Da al N-terminal y a cadenas laterales de Lys.

•El digerido tríptico se analiza por PMF.

•Para evitar la sulfonación de los e-aminos de Lys se pueden bloquear las Lys por

reacción con imidazol, que agrega 68 Da/Lys. Esto es específico, y no afecta al N-

terminal. Si no se lo hace, se observarán después de la sulfonación sólo los péptidos

con Arg. Luego se hace la sulfonación con el reactivo.

•La mezcla de péptidos modificados se analiza de nuevo por MALDI.

•Se buscan las masas que representan péptidos con Arg o Lys terminal, o sea los que

aumentaron su masa en 136 o 204 Da (si se utilizó el CAF).

•Se pasa el aparato de MALDI a PSD y se selecciona esa masa de péptido.

•Se hace el análisis de PSD, que lleva aproximadamente 2 minutos en un TOF/TOF

MALDI.

Procedimiento experimental

Peptide mass fingerprinting de la aconitasa de Trypanosoma cruzi (- / + sulfonación)

Secuenciación por Post Source Decay (PSD) de péptidos trípticos de la aconitasa

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR PEPTIDE

MASS FINGERPRINTING (PMF)

• La muestra reducida y alquilada (en un fragmento de gel o mancha) se digiere

con una proteasa (tripsina?).

•La mezcla de péptidos resultante se analiza por MALDI-ToF-MS.

•La lista de masas de péptidos se utiliza para escanear un digerido in-silica de

una base de datos de secuencias por Internet.

•El resultado de la búsqueda se presenta como probability scores y otras

medidas de confianza.

•La homogeneidad de la muestra y la precisión de la medida son factores muy

importantes para una interpretación segura de los resultados.

1326.8

05

1173.6

52

1394.8

46

1715.9

84

873.4

71

1786.8

88

835.4

27

1751.7

97

1587.9

00

1430.8

71

914.5

55

1135.6

51

2270.0

86

1927.9

41

2071.0

08

742.4

10

1366.6

84

1522.9

32

1106.5

92

1258.7

29

940.5

05

971.5

49

1055.6

14

2306.0

46

2497.3

09

1870.9

13

2110.0

59

1993.9

65

663.8

19

1557.7

46

1657.8

11

2211.1

07

2669.2

96

2319.1

40

2375.1

23

2991.5

41

3070.5

87

2872.3

56

0

1

2

3

4

5

4x10In

tens. [a

.u.]

750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000m/z

PMF of band # 3

MDH-1

MDH-2

LAS MALATO DEHIDROGENASAS DE

TRYPANOSOMA CRUZI

MDH-1

MDH-2

EDMAN

SINTESIS QUIMICA DE PEPTIDOS

La sintesis quimica de peptidos es muy importante actualmente, pues

permite a) estudiar el plegamiento de regiones individuales de una

proteína; b) aislar, usandolos como ligandos para cromatografía de

afinidad, a receptores y otras proteínas, c) usarlos como drogas,

p.ej.: la 1-desamino-8-D-Arg-vasopresina, hormona antidiurética sin

efectos sobre la presión sanguinea; d) para generar anticuerpos

específicos.

La sintesis se realiza en fase sólida, aplicando el método

desarrollado por Merrifield, que le permitió sintetizar interferon (155

residuos) y ribonucleasa (124 residuos), ambos activos

Los aminoácidos que se introducen deben estar bloqueados en los

sitios en que no debe producirse reacción, y luego desbloquearlos

para continuar la etapa siguiente. Se efectúa con el residuo C-

terminal ligado a una resina, lo que permite eliminar facilmente

subproductos.

INTRODUCCION

A LA

PROTEOMICA

GENOMA Y PROTEOMA

GENOME: “GENes and ChromosOMEs” (Winkler,

1920): Conjunto completo de los cromosomas y

sus genes.

PROTEOM E: Conjunto completo de las proteínas

de un organismo (el conjunto de proteínas

codificadas por un genoma, Wilkins y Williams,

1994; Wasinger et al., 1995) .

La secuenciación de los genomas se hizo posible con la

introducción de los métodos de secuenciación del ADN, a partir

del establecimiento del método utilizando dideoxynucleótidos

por Frederick Sanger, en 1975, que le permitió secuenciar el

genoma completo del bacteriófago X174, con 5,375 pares de

bases, en 1977. La primera secuenciación completa del genoma

de un organismo de vida libre fué la de Haemophilus influenzae

(1.8 Mb), en 1995. El Human Genome Project comenzó en

1990 y se completó en 2003; la estimación del número total de

genes en el genoma humano es de entre 20,000 y 25,000. Al 8 de

Abril de 2019 la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

(KEGG) registraba ya 491 genomas eucarióticos completos,

además de 5092 genomas de bacterias y 287 de Archaea.

DETERM INACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LOS GENES

Determinación de las características químicas, bioquímicas y

biológicas de las proteínas.

1) Estructura molecular .

2) M odificaciones post-traduccionales.

3) Capacidad de unir ligandos.

4) Velocidad de síntesis y degradación. Concentracion

intracelular .

5) Especificidad de tejido, célula y organela.

6) Especificidad de sexo.

7) Especificidad de estadío de desarrollo embrionario, post

natal y de envejecimiento.

Se estima en 252 el número de tipos celulares diferentes que se encuentran

en el hombre. Todas esas células tienen el mismo DNA, pero todas

ellas presentan diferencias cuali y cuantitativas en sus proteínas. El

DNA almacena información; las proteínas hacen todo lo demás.

ADN

Transcripción

Pre-mARN

“Splicing” alternativo

mARN 1 mARN 2 mARN 3

Traducción

Proteína 1 Proteína 2 Proteína 3

Modificación

Post-traduccional

y/o Proteólisis

Prot. 1’ Prot. 1’’ Prot. 2’ Prot. 2’’ Prot. 3’ Prot. 3’’

¿HAY IGUAL NUMERO DE PROTEINAS QUE DE GENES?

Para la funcionalidad adecuada de una

proteína se requiere mucho mas que la integridad

del gen estructural que la codifica. Si este está

mutado, y el producto es inactivo, naturalmente la

proteína no será funcional. Pero puede suceder

algo parecido si el gen estructural está intacto, pero

hay mutaciones en otros genes que participan en lo

que realmente le interesa a la célula, que es la

proteína perfectamente plegada, con las

modificaciones post-traduccionales requeridas y

localizada en el compartimento subcelular correcto.

LA NATURALEZA POLIGENICA DE LAS PROTEINAS.

Gen estructural

Genes que codifican factores de transcripción. Genes que codifican chaperonas necesarias

para el plegamiento correcto.

Genes que codifican proteínas regulatorias. Genes que codifican enzimas que modifican

post-traduccionalmente a la proteína.

Genes que codifican proteínas que modifican Genes que codifican proteasas de

la estructura de la cromatina. procesamiento.

Genes que codifican proteínas de

transporte e integración a organelas.

Secuencias regulatorias en el ADN Genes que codifican proteasas

(“enhancers”) que degradan a la proteína

Proteína madura,

correctamente localizada,

en la concentración necesaria

DESAFIOS TECNICOS DE LA PROTEOMICA.

1) Si suponemos alrededor de 22,000 genes en el genoma

humano, y que cada gen da origen a entre 3 y 6 o más

proteínas, el número total de proteínas en un organismo

superior puede variar entre 50,000 y 500,000.

2) Las proteínas tienen una heterogeneidad mucho mayor que

los ácidos nucleicos. La composición y secuencia de

aminoácidos de una proteína determina: a) su masa molecular;

b) su carga total a diferentes valores de pH; c) su

hidrofobicidad; d) su forma, es decir el plegamiento de la

proteína nativa. Esto a su vez determina la solubilidad de las

proteínas en diferentes solventes, su comportamiento en los

métodos de separación y purificación, y su vida media in vitro.

La diversidad de propiedades fisicoquímicas es muchísimo mayor

que la de los ácidos nucleicos.

3) Los valores de pI de las proteínas varían entre menos de 3 y

más de 12, con dos grandes agrupamientos, uno alrededor de 5.5

y el otro alrededor de 8.5. Los ácidos nucleicos tienen un rango

estrecho de pI, en la zona ácida.

4) Los ácidos nucleicos son muy solubles en soluciones acuosas,

en tanto que muchas proteínas son muy hidrofóbicas, y por ello

insolubles en agua. Se estima que más del 15 % de las proteínas

totales nunca entrarán en un gel de 2D-PAGE por su extrema

hidrofobicidad.

5) La masa molecular de las proteínas varía entre unos pocos

miles y varios millones de Daltons, y su tamaño no puede

predecirse con certeza a partir de la secuencia de aminoácidos

derivada de la secuencia de DNA, por las modificaciones post-

traduccionales.

6) La concentración de las proteínas varía dentro de un rango

muy amplio, probablemente mayor que el rango de los mRNAs.

La diferencia en concentración de proteínas abundantes y raras

en los flúidos corporales es mayor que 12 órdenes de magnitud.

LAS HERRAM IENTAS PARA EL ESTUDIO DEL

PROTEOM A

La técnica clásica, y hasta hace unos pocos años, la

principal utilizada, es la separación de las proteínas por

electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida,

seguida de identificación de dichas proteínas por

secuenciación o, en general actualmente, por espectrometría

de masa, después de hidrólisis enzimatica parcial.

Actualmente lo mas utilizado para estudios amplios de

proteómica son otras combinaciones de técnicas, por ejemplo

cromatografía de alta resolución (HPLC) combinada con

espectrometría de masa, o electroforesis capilar tambien

combinada con espectrometría de masa. Este tipo de técnicas

permite la identificación de proteínas en mezclas complejas,

previa hidrólisis enzimática parcial.

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Electrophoresis 2000, 21, 2610-16

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS

BIDIMENSIONAL EN EL ESTUDIO DEL PROTEOMA.

Ventajas:

Excelente resolución: pueden identificarse a veces hasta 10,000

proteínas en un solo gel. Es una técnica capaz de analizar

simultáneamente miles de proteínas.

Desventajas:

1)Pueden ser necesarios varios geles, corridos en diferentes

condiciones de rango de pH y de concentración de acrilamida, para

resolver las mezclas muy complejas.

2) Es difícil detectar proteínas muy grandes o muy chicas, muy

ácidas o muy básicas, o proteínas de membrana (muy hidrofóbicas) .

3) Se detectan sólo las proteínas de alta y mediana abundancia en el

material en estudio. En cualquier célula, sus proteínas pueden

variar en concentración en seis órdenes de magnitud. Para ver

proteínas minoritarias, es necesario en general purificar la organela

en que se encuentran y trabajar con ese material. Tambien se

puede trabajar previa marcación radioactiva, para aumentar la

sensibilidad de detección.

EDMAN MALDI-ToF-MS

SensibilidadBajo pmole (6x1011

moléculas; 67 ng albúmina)

Bajo fmole (6x108

moléculas; 67 pg albúmin

Costo US$ 150/peptido < 1 ¢/analisis

Tiempo de análisis Overnight Pocos minutos

Número de frascos de cultivo necesarios

100-150 1

Identificación de proteínas por EDMAN vs MALDI-ToF-MS

Electroforesis diferencial en gel (DIGE).

Se marcan las dos muestras de proteína que se quieren comparar

con dos colorantes diferentes, reactivos con el amino, y diseñados

para mantener la misma movilidad relativa.

Se mezclan las dos muestras de proteínas marcadas y se las corre

en un mismo gel bidimensional.

Después de la corrida se crean dos imágenes de fluorescencia del

gel que se superponen para identificar diferencias en el patrón.

Esta técnica hace innecesario comparar geles diferentes.

Está disponible comercialmente.

El método ICAT permite medir la

expresión diferencial de proteínas.

Estructura del reactivo ICAT: ICAT

consiste de un grupo biotina para

afinidad, una región intermedia que

puede incorporar átomos de deuterio o

de hidrógeno, y un grupo terminal

reactivo de tioles para unirlo a cisteínas.

Estrategia de ICAT: Las proteínas se

cosechan en dos estados celulares

diferentes y se marcan en los residuos

de cisteína con la forma liviana o la

pesada del reactivo ICAT. Después del

marcado, las dos muestras de proteína

se mezclan y se digieren con una

proteasa, como la tripsina. Los péptidos

marcados con el ICAT pueden ser

purificados usando cromatografía de

afinidad con avidina. Siguiendo la

purificación, los péptidos marcados con

ICAT son analizados por MS para

cuantificar las relaciones entre los picos

y las proteínas se identifican por

secuenciación con MS/MS.

Isotope-coded affinity tags (ICAT)

Si bien la idea última detrás de los estudios de

proteómica es llegar algún día al conocimiento completo

de las proteínas de un organismo, lo mas frecuente

actualmente es hacer proteómicas parciales: la

proteómica de un tipo celular determinado; la proteómica

de una organela aislada; la proteómica de las proteínas

blanco de una determinada modificación post-

traduccional; las diferencias en la expresión de proteínas

antes y después de la diferenciación de un estadío a otro

en un organismo que tiene un ciclo de vida complejo; las

diferencias en la expresión de proteínas de una misma

célula antes y después de un determinado tratamiento.

Identificación de proteínas potencialmente

SUMOiladas en Trypanosoma cruzi

J.C. Bayona, E.S. Nakayasu, M. Laverriere, C. Aguilar, T.J. Sobreira, H. Choi, A.I.

Nesvizhskii, I.C. Almeida, J.J. Cazzulo, V.E. Alvarez: SUMOylation pathway in Trypanosoma

cruzi: Functional characterization and proteomic analysis of target proteins. Mol Cell

Proteomics. 10.12 (2011) 10.1074/mcp.M110.007369-1.

Se generó una linea celular transgénica de epimastigotes de T. cruzi,

que expresa una versión de la proteína SUMO etiquetada con 6xHis y

HA en el N-terminal. Las proteínas conjugadas con SUMO se

purificaron a partir de un extracto libre de células, utilizando dos

etapas cromatográficas: 1ª cromatografía de quelatos metálicos,

usando una resina con Ni, y 2ª cromatografía de afinidad, usando una

resina acoplada a un anticuerpo anti-HA. Las proteínas obtenidas se

precipitaron con acetona.

La muestra control se obtuvo de idéntica manera, usando

epimastigotes wild-type.

Cromatografía líquida en 2 dimensiones acoplada a espectrometría de masa (2D LC MS/MS)

Identificación de proteínas potencialmente SUMOiladas en

Trypanosoma cruzi

Resuspensión en UreaReducción con DTT+ Alquilación con IAADigestión con TripsinaDesalado en Columna fase reversa C18

(DSC-18, Supelco, Sigma-Aldrich)Lleva muestra a sequedadResuspende en 2% ACN/0.1%FA 20 μg proteínaColumna intercambio ionico

(SCX 5 uL opti-pak)Eluidos 0,25,50,100,200 y 500 mM NaClSistema de nano-HPLCTrap loading C18-columnTrap separation C18-column

Elución en gradiente 5–40% ACN/0.1% FA en 100 min

Análisis de péptidos en línea con un espectrómetro de masa(LTQ XL/ETD, Thermo Fisher Scientific).

Proteínas potencialmente SUMOiladas

Distribución por categoria funcional

Se identificaron 7178 péptidos en ambas muestras. Corresponden a 2686 proteínas.

236 resultaron enriquecidas en la Muestra vs. Control

Proteínas potencialmente sumoiladas

Metacaspasa 3 in vivo

Validación de proteínas SUMOiladas

Se transfectaron epimastigotes de T. cruzi con el gen de la metacaspasa 3

fusionado con una etiqueta de triple FLAG e incorporado al plásmido pTcINDEX.

Los epimastigotes se lisaron en presencia de inhibidores de proteinasas, y se

purificó la metacaspasa por cromatografía de afinidad con anti-FLAG agarosa. Se

eluyeron las proteínas con el buffer de muestra de Laemmli, y se revelaron los

Western blots con anticuerpos anti-FLAG y anti TcSUMO.