Práctica 1 bio mol
-
Upload
pedro-mejia -
Category
Documents
-
view
226 -
download
0
description
Transcript of Práctica 1 bio mol
UNIVERSIDAD ANÁHUAC MÉXICO NORTE
PRÁCTICA 1
EXTRACCIÓN DE ADN
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
DR. ERNESTO RODRÍGUEZ AYALA
PEDRO ARTURO MEJÍA ROSALES
NRC 10347 SECCIÓN 1
HUIXQUILUCAN, ESTADO DE MÉXICO A 1 DE SEPTIEMBRE 2010
2
EXTRACCIÓN DE ADN
Introducción
El Ácido Desoxirribonucleico, comúnmente referido simplemente como
ADN, es una doble cadena, cada una constituida por una secuencia de
nucleótidos y dispuestas a manera de doble hélice o helicoidal. La molécula de
ADN es considerada ampliamente como la molécula de la vida ya que es en ella
donde se almacena todo el material genético, es decir, es de alguna manera el
instructivo general para todo lo que somos y cómo funcionamos ya que es un
código específico con el cual nuestro organismo por medio de los ribosomas
construye las proteínas, responsables de la mayoría de los procesos que ocurren
en el cuerpo además de hacernos únicos ya que cada persona posee un ADN que
aunque parecido no es el mismo y esto nos otorga la variabilidad entre cada
individuo.
El código que compone al ADN es el resultado del emparejamiento de las
cuatro bases nitrogenadas de los nucleótidos: la adenina, timina, guanina y
citosina. La adenina se complementa únicamente con la timina, mientras que la
guanina sólo se pega a la citosina. La célula mediante los mecanismos de
replicación, transcripción y traducción logra expresar el ADN en proteínas con
diversas funciones cada una. Sin embargo no toda la cadena de ADN codifica a
una proteína, sólo ciertas partes, a esas zonas es a lo que se les llama genes.
Pero el ADN no se encuentra simplemente disperso dentro de la célula, sino
que se condensa con ayuda de ocho proteínas que se llaman histonas, esto hace
que se forme un nucleosoma. Eventualmente los mismos nucleosomas también se
van condensando entre ellos y forman los cromosomas, los cuales se encuentran
dentro del núcleo de la célula, rodeado de una membrana hecha de fosfolípidos y
el núcleo y los demás componentes citoplasmáticos como proteínas, enzimas,
mitocondria, ribosomas y demás a su vez están limitados por la membrana
plasmática que igual está formada por fosfolípidos, proteínas, carbohidratos y
colesterol.
3
Objetivo
Mediante el procedimiento no orgánico de proteinasa K and salting out, de una
muestra de células se extraerá y observará ADN, además de aprender y explicar
los distintos mecanismos para lograrlo.
Material
4 Microtubos transparentes con 1 ml de tampón de lisis
1 Microtubo azul rotulado como “prot”
1 Microtubo rosa rotulado como “sal”
4 Tubos transparentes de rosca sin tapa
4 Tapas de rosca de colores
8 Escobillas para citología
4Tubos de fondo redondeado de 5 ml
4 Trozos de parafilm
4 Pipetas de plástico
1 Gradilla de corcho para tubos eppendorf
1 Rotulador de tinta indeleble
1 Contenedor de residuos
Métodos
Colecta y ruptura de células
1. Coger un microtubo transparente con 1 ml de tampón de lisis para ti, y rotularlo
con las iniciales de quien donará las células, utilizando el rotulador de tinta
indeleble.
2. Tomar la primera escobilla, y con suavidad pásala a lo largo del interior la
mejilla derecha y por el espacio situado entre la mejilla y la encía durante 1
minuto. Raspar la mucosa con firmeza, pero sin dañarse.
3. Introducir la escobilla con las células de la mucosa en el tubo que contiene el
tampón de lisis. Girar la escobilla para liberar las células de la escobilla en el
4
tampón. Frotar las cerdas de la escobilla contra el borde del tubo para transferir la
mayor cantidad posible de células en el tubo. Tirar la escobilla al contenedor de
residuos.
4. Usando una segunda escobilla limpia, raspar suavemente las células del interior
de la mejilla izquierda, entre la mejilla y la encía, por el paladar, y debajo de la
lengua durante 1 minuto.
5. Introducir la escobilla en el mismo tubo de antes, y girar la escobilla para liberar
la mayor cantidad posible de células en el tubo. Después tirar la escobilla.
6. Cerrar el tubo y suavemente voltearlo 5 veces para mezclar los componentes.
Eliminación de proteínas
1. Coger el tubo rotulado como “prot” y añadir 1 gota de la solución de proteasa
(35 µl si utilizas una micropipeta) al tubo que contiene tu extracto celular. Cerrar el
tubo y voltearlo suavemente 5 veces para mezclar los componentes.
2. Poner el tubo con el extracto celular en la gradilla de corcho del puesto de
trabajo, y colocar las muestras en el baño a 50 ºC durante 10 minutos para dejar
que la proteasa actúe.
Hacer visible el ADN
1. Sacar el microtubo del baño y añadir 2 gotas (70 µl con micropipeta) del tubo
rotulado como “sal”. Cerrar el tubo y voltearlo suavemente 5 veces para mezclar
los componentes.
2. Rotula con tus iniciales un tubo de 5 ml de fondo redondeado y pasa el
contenido de tu microtubo a este tubo.
3. Coger una pipeta de plástico y llenarla con alcohol frío.
4. Inclinar el tubo de fondo redondeado 45 º y lentamente añadir el alcohol,
dejando que caiga con cuidado por la pared interna del tubo. Se forman dos capas
(superior e inferior).
5
5. Dejar el tubo de 5 ml en posición vertical en la gradilla, a temperatura ambiente
y en reposo, durante 5 minutos.
6. A los 5 minutos mirar el tubo, especialmente en la zona de unión de la capa de
alcohol y de la capa del extracto celular. Anotar las observaciones.
7. Sellar la boca del tubo con un trozo de Parafilm, tapar la boca con el pulgar e
invertir lentamente el tubo 5 veces para mezclar los componentes. Buscar la
presencia de un material fibroso, blanco o claro.
Desarrollo
Se eligieron a dos miembros de cada equipo para colectar el ADN
Primero cada persona tomó un microtubo, el cual había que rotularse con el
nombre de cada uno
Con una pipeta de plástico se vertieron 3 ml de agua semidestilada en el
microtubo
Se tenía que tomar el contenido del microtubo, pero sin tragar, sólo
haciendo buches asegurándose de pasar el agua especialmente en el área
entre las mejillas y la encía, para luego escupir el agua, ahora con la saliva,
de regreso al interior del microtubo
Ya con la saliva en el microtubo se le agregaron 2 ml de tampón de lisis con
otra pipeta
Se volteó el microtubo 5 veces para mezclar
Con pipetas diferentes se agregaron 5 gotas de solución de proteasa al
microtubo
Se volteó 5 veces
Hecho lo anterior se colocaron todos los microtubos en una gradilla y luego
se sumergieron en un baño de 50°C por 10 minutos
Pasado este tiempo se sacaron y se dejaron a temperatura ambiente por
otros 10 minutos
Se tomaron los microtubos y se colocaron en una posición de 45°C, y
posteriormente con la última pipeta se vertieron cuidadosamente 2 ml de
6
alcohol, evitando que la pipeta tuviera contacto con las paredes del
recipiente y que el alcohol cayera por la pared lentamente.
Después de esto se observaron dos fases en el microtubo y se volteó 1 vez,
se observó el cambio ocurrido y luego se volteó 4 veces más para que
finalmente se hiciera visible el ADN
Diagrama de flujo
7
Resultados
En primer lugar se observó la saliva normal, con su consistencia viscosa
Después de agregar el tampón de lisis se notó la presencia de burbujas,
algo de espuma y se notaba un tanto espesa y turbia
Al agregar las gotas de proteasa y después de meterla al baño caliente y
posteriormente enfriarla, ocurrió un cambio: la saliva se hizo un poco más
transparente, y se hicieron presentes pequeñas partículas por todo el tubo
Cuando se agregó el alcohol se pudo observar la presencia de dos fases: la
superior y más transparente que correspondía al alcohol y la inferior que
era la saliva ya tratada con el tampón de lisis y la proteasa
Al voltear el tubo la primera vez se veía claramente la primera reacción del
alcohol con la saliva, se veían como delgados hilos transparentes flotar en
el centro
Para acabar se volteó de nuevo 4 veces y fibras de ADN se hicieron
visibles, eran muchas, estaban por todo el tubo y tenían burbujas pegadas
a ellas
8
Discusión
El experimento como ya se ha mencionado, consistió en separar a las
moléculas de ADN de los demás componentes celulares, pero para esto se usaron
las propiedades de los mismos componentes para poder degradarlos y así
obtenerlo.
Lo primero que se hizo fue obtener las células, y esto se hizo durante los
buches de agua semidestilada ya que el epitelio de la cavidad oral siempre está en
constante renovación, por lo que hay descamaciones frecuentes. Lo siguiente fue
agregar el tampón de lisis cuyo componente principal era detergente, el cual tiene
la particular propiedad de hacer que los lípidos se micelicen. Para esto hay que
recordar que tanto la membrana plasmática como la nuclear están compuestas
más que nada de fosfolípidos, por ende el detergente ayudó a remover las
membranas vertiendo todo su contenido al medio.
En ese momento se puede decir que el ADN está libre, pero también lo
están todas las demás proteínas de la célula, incluidas las DNAsas, que degradan
el ADN. Es aquí donde participa la proteasa, para degradar éstas enzimas dañinas
a la molécula, librarnos de cualquier otros elementos proteicos que no conciernen
a esta práctica y otra cosa muy importante, desenrollar al ADN ya que lo que la
mantiene tan condensada son las proteínas conocidas como histonas. La razón
por la cual se metieron los microtubos al baño de agua caliente es simplemente
porque la proteasa sólo se activa en un ambiente de 50°C. Es importante señalar
aquí que la sal iba ya incluida junto con la proteasa y lo que hizo fue que la carga
positiva del sodio se pegó a la carga negativa del grupo fosfato del ADN, con lo
que se neutralizó y ayudó a que se separara de las demás moléculas
replegándose en ella misma.
Hasta aquí entonces se puede explicar el cambio en la consistencia, la
saliva era ya más transparente porque habíamos separado a los componentes de
las células, tanto lípidos como proteínas, y las pequeñas partículas que se podían
ver flotando eran los restos de membranas. Finalmente lo que se pasó con el
9
alcohol fue que deshidrató a la molécula de ADN, y por ello precipitó, es lo que se
pudo observar al voltear la primera vez. Ya después de agitar bien se pudieron ver
bien las delgadas fibras de ADN.
Cuestionario
1. Imagina que estás intentando explicar la diferencia entre cromosomas, genes y
ADN a tu hermano o hermana que es un par de años más pequeño que tu.
ADN: Es como el instructivo de lo que somos y cómo somos. Pero no hay que
confundirse, sólo son los pasos a seguir, con éste instructivo haces tú un molde
(de ARN) y posteriormente y con ayuda de utensilios (ARNt, ribosomas, etc.) ya
tienes como el producto (proteínas)
Genes: Tu instructivo tiene como muchas cosas que sólo son de relleno, no las
necesitas para “cocinar” tus proteínas, pero las partes esenciales, las que a
fuerzas necesitas, ésos son los genes, partes del ADN que codifican una proteína
Cromosomas: El ADN es tan grande que la célula necesita compactarlo
muchísimo para que se pueda guardar más fácilmente, a la condensación del ADN
se le llama cromosoma.
2. ¿Contiene una célula hepática los mismos cromosomas que una célula de la
mucosa bucal? Sí, la diferencia está en cuáles cromosomas son los que se
expresan en cada una
3. Si quisieras aislar una copia del gen que codifica una proteína encontrada en el
estómago, ¿podría estar ese gen en las células de la mucosa bucal? Razona tu
respuesta. Sí estaría pero como se mencionó en la respuesta anterior no se
expresa, está la instrucción pero si esa proteína no la necesito, entonces no la
produzco, aún cuando ambas son mucosas tienen requerimientos distintos.
4. Indica los compartimentos celulares, incluyendo la membrana celular, el
citoplasma y el núcleo.
10
5. ¿En qué compartimento celular esperas encontrar tu ADN? En el núcleo
6. ¿Por qué es necesario un intermediario como el ARNm para pasar de la
información del ADN a la síntesis de las proteínas? Porque no se puede usar
directamente el ADN, volviendo a la metáfora de la receta no se puede entregar la
receta original de un platillo maestro, si lo hiciera ya no podría hacer más, así
también el ADN, no puede estar saliendo y entrando al núcleo cada que se ofrezca
7. ¿Cuál crees que será el siguiente paso en el aislamiento del ADN de tus
células? (ésta pregunta estaba en la sección de colecta de células): El siguiente
paso sería romper la membrana plasmática para así estar más cerca del ADN.
8. Una vez que las membranas se han roto, el ADN queda libre en la solución, al
igual que otras moléculas celulares. Haz un listado de las moléculas que junto con
el ADN esperas encontrar en la célula.: Glucosa, lípidos, sales, proteínas y
enzimas.
Núcleo
Mitocondria
Plasmalema
Citoplasma
Aparato de
Golgi
Retículo endoplásmico
rugoso
11
9. ¿Qué método o agente crees que se puede usar para eliminar esas moléculas
que no nos interesan? El detergente para los lípidos y la proteasa para las
proteínas principalmente.
10. ¿Qué proteínas podrían estar asociadas al ADN en la célula? Principalmente
las histonas y proteínas escafoides (responsables de la compactación), y también
DNAsas
11. La proteasa utilizada en este protocolo tiene un funcionamiento óptimo a 50
ºC. ¿Crees que esta enzima se ha aislado de E. coli? Razona tu respuesta. Una
pista: ¿Dónde vive E. coli? La E. Coli es una enterobacteria, entonces mi
conclusión es que no pudo haberse aislado de e. coli, porque el intestino nunca
está a 50°C
12. A menudo para ablandar la carne (de un filete, por ejemplo) ésta se golpea.
Sabiendo que ese filete es tejido muscular rico en proteínas procedente de una
vaca, ¿puedes pensar en una explicación de por qué esto funciona? Porque lo
único que esto haciendo al darle de golpes es cambiando su morfología pero su
estructura molecular sigue siendo la misma, ya que se rompen las fibras de la
carne pero las proteínas siguen estando presentes con la misma estructura.
13. Relaciona los resultados de la izquierda con los pasos de laboratorio de la
derecha:
Recoger las células A. Pasar un cepillo por el interior de
la mejilla A
Disolver las membranas B. Añadir proteasa, incubar a 50
ºC D
Precipitar el ADN C. Añadir una solución de
detergente B
Romper proteínas D. Añadir alcohol frío sobre el extracto
celular C
12
Hacer al ADN menos soluble en agua E. Añadir sal E
Conclusiones
Se cumplió en objetivo de la práctica lo que ayudó a una mejor comprensión
de la estructura y propiedades tanto de la célula como del ADN. Éste aunque está
presente en todas las células eucariontes no es tan fácil de accesar, por ser una
molécula con tanta importancia, ya que el funcionamiento tanto del organismo
como la continuidad de la especie, depende de éstos pequeños hilos en doble
hélice. Se encuentra tan bien protegida y regulada que está separada de todos los
organelos celulares por medio de los fosfolípidos y proteínas de la membrana
nuclear.
El ADN es definitivamente uno de los descubrimientos más importantes de
toda la historia, sino es que el más importante, es la razón por la cual los avances
en la medicina se están enfocando hoy en día a tratar los padecimientos pero
desde un punto de vista molecular, ya no sólo se van contra los signos y síntomas
sino que quieren ir más allá aún.
Es por esto es que el estudio del ADN durante la carrera de medicina es
crucial, para entender muchas de las enfermedades que se ponen frente a los
médicos hay que entender su composición a niveles que hace unos años hubieran
sido imposibles de imaginar y así dar tratamientos más adecuados y eficaces a los
pacientes.
Bibliografía
Fauci, A; Braunwald, E; Kasper, D; Hauser, S; Longo, D y Jameson, J.
(2008) Harrison: Principios de Medicina Interna. China: McGraw-Hill