PRACTICA 1. AISLAMIENTO DE ORGANISMOS

INTRODUCCIN.

LOS MICROORGANISMOS EN EL AMBIENTE

En la naturaleza, las clulas microbianas viven asociadas a otras en conjuntos llamados poblaciones.El medio en el que se desarrolla una poblacin microbiana se denomina hbitat. En los hbitats microbianos, las poblaciones celulares raramente viven aisladas, por lo general se relacionan con otras poblaciones llamadas comunidades microbianas. En una comunidad microbiana, la diversidad y abundancia de microorganismos est controlada por los recursos (alimentos) y por las condiciones (temperatura, H, concentracin de oxgeno, etc.) que existen en el medio. El estudio de los microorganismos en sus ambientes naturales constituye la ecologa microbiana. Las poblaciones microbianas interaccionan y cooperan de varios modos, y estas relaciones pueden ser beneficiosas o perjudiciales. Por ejemplo, los productos de desecho de las actividades metablicas de algunos microorganismos pueden servir de nutrientes para otros. Los microorganismos tambin interaccionan con su ambiente fsico y qumico. Las caractersticas de los hbitats son notablemente diferentes: un factor que favorece el crecimiento de un microorganismo concreto puede ser daino para otro. En conjunto, denominamos ecosistema a todos los organismos vivos y a las condiciones fsicas y qumicas de su entorno. Existen importantes ecosistemas en los medios acuticos (ocanos, estanques, lagos, corrientes, hielo, fuentes termales) y en los medios terrestres (suelo, profundidades bajo la superficie), as como en otros organismos (plantas y animales) SIGNIFICADO DE LOS MICROORGANISMOS EN EL SUELO El papel de los microorganismos en el ambiente es doble: (1) suministran los compuestos inorgnicos con una valencia adecuada para que las plantas superiores puedan utilizarlos (ciclos del nitrgeno y del azufre) y (2) contribuyen a la continua

descomposicin y mineralizacin de la materia orgnica en putrefaccin. La actividad de los microorganismos descomponedores es fundamental para permitir el reciclaje de materia orgnica fijada en las plantas superiores: los herbvoros consumen una parte muy limitada de esta materia orgnica porque la relacin C:N de esta materia orgnica (alrededor de 200:1) es mucho mayor que la conveniente para los animales (en torno a 20:1). Otra ventaja adicional de los microorganismos es que ellos mismos se incorporan a los detritus mejorando as la relacin C:N (para los microorganismos oscila entre 6:1 y 12:1). Por otra parte, los microorganismos son indispensables para la descomposicin de materia orgnica en ausencia de aire y para la fijacin de CO2 en condiciones de metanognesis, lo que determina cambios globales importantes en los niveles de oxidacin del material orgnico en ambientes anxicos.. MICROORGANISMOS DEL SUELO. Las bacterias son el grupo ms importante de organismos del suelo, en el cual, en condiciones favorables, alcanzan nmeros extraordinariamente elevados. Existen bacterias aerbias estrictas, anaerobias estrictas y facultativas. Las aerobias estrictas, obtienen su oxgeno del aire y solo prosperan por tanto en suelos bien aireados. Las segundas no necesitan de oxgeno gaseoso, o son an perjudicadas por este, por lo que se encuentran en suelos compactos y(o con drenaje deficiente. Su actividad es mucho menor que la de las primeras Las denominadas facultativas, constituyen el grupo ms importante y actan tanto en un caso como en el otro. Las bacterias desempean un papel importante en la descomposicin de residuos orgnicos y en la formacin de humus, e incluyen organismos fijadores de nitrgeno amoniacal, en azoto ntrico (nitrificacin).

De las bacterias fijadoras de nitrgeno, viven en simbiosis con leguminosas, fijando el nitrgeno en ndulos de las races de estas. Otras no-simbiticas, obtienen la energa de la descomposicin de residuos vegetales Las bacterias son, en general, bastante exigentes en calcio y prosperan especialmente en suelos de reaccin levemente cida a levemente alcalina. Los hongos pueden alcanzar en el suelo una masa total superior a la de las bacterias. Son probablemente todos hetertrofos y en ciertas condiciones parecen ser de los organismos del suelo ms aptos para descomponer el sustrato. Algunas especies son depredadoras de protozoarios y de nemtodos. Son en general menos exigentes en calcio y ms tolerantes de la acidez que las bacterias. Ciertos hongos viven en simbiosis con las races de plantas superiores, cuyo desarrollo parecen beneficiar. Las asociaciones de hongos y races son conocidas como micorrizas Las algas incluyen especies que probablemente realizan fotosntesis y algunas fijan el nitrgeno del aire. Se desarrollan principalmente en la capa superficial de suelos anegados. Parecen desempear un papel importante en la aireacin de suelos pantanosos. En cuanto a las exigencias de calcio se aproximan ms de las bacterias que de los hongos. MATERIALES. Plantas con sistemas completos obtenidas no mayores a 48 horas Tubos con 9 ml de solucin salina estril Cajas de petri estriles Pipetas de 1 ml estriles Pipetas de 10 ml estriles Cloruro de Sodio Cloruro de Calcio Sulfato de Magnesio Nitrato de Amonio Glucosa Manitol Extracto de levadura Hidrogeno fosfato de potasio Agar PDA Agar OGY Agar-agar

Alcohol Hipoclorito Balanza analtica Incubadoras 25C - 37C PROCEDIMIENTO. Obtencin de la planta. Inicialmente se debe recolectar la informacin del sitio de donde se va a obtener la muestra, la informacin correspondiente a humedad, rango de temperatura, caractersticas de la planta en situ con el fin de establecer parmetros iniciales de estudio. En el momento de la obtencin de la planta esta debe realizarse con sumo cuidado para no afectar el sistema radicular ni areo, le sistema radicular se debe proteger envolvindolo en una bolsa limpia y cuidando su transporte, la planta debe tener un periodo de obtencin no mayor a 48 horas, ya que mayor tiempo puede influenciar en el comportamiento de los microorganismos presentes puede ser mantenido a 5C. Aislamientos de Microorganismos Para los aislamientos de microorganismos se siguieron los protocolos especficos de acuerdo al grupo funcional al que pertenece cada uno: Solubilizadores de roca (MSR), fijadores biolgicos de nitrgeno (FBN) y formadores de micorrizas (HFM) Microorganismos solubilizadores de roca.Se us el medio desarrollado por Kim et al,(1997) y modificado por Osorio & Habte, (2001) compuesto as: 1.0 g de NaCl, 0.2 g de CaCl2.2H2O, 0.4 g de MgSO4.7H2O, 1.0 g de NH4NO3, 10 g de glucosa, 7.0 g de agar-agar y 3.5 g de solucion de fosforo. Para aislar los MSR de la rizosfera se prepararan diluciones seriales de suelo desde 10-2 hasta 10-8 con agua desionizada y estril. De cada dilucin se transfieren aspticamente alcuotas de 1.0 mL a cajas de petri con 15 mL del medio de cultivo mencionado. En el caso de los microorganismos provenientes de las races, estas se lavaran con agua desionizada y estril, luego se transfieren a cajas de petri con 15 mL del medio de cultivo mencionado. Para lograr una adecuada homogeneizacin en cada uno de los medios de cultivo inoculados con las

diluciones de suelos o con los fragmentos de las races, estos se agitaran en un vrtex durante 20 s y se verti cada cajas de petri se incubara a 25C/48 72 hrs Para la seleccin inicial de los microorganismos se consideraran las colonias que muestren mayor abundancia y rpido crecimiento, adems, se tuvo en cuenta que presentaran zonas de clara dominancia a su alrededor. De cada una de las colonias individuales seleccionadas se realizara aislamientos para obtener colonias puras que sern empleadas para la siguiente prctica. Bacterias simbiticas fijadoras de nitrgeno (N2): Se utilizar el medio BYMA (Caldo Levadura Manitol Agar) compuesto por: 0.1 g de NaCl, 0.2 g de MgSO4.7H2O, 0.5 g de KH2PO4, 0.5 g de levadura, 10 g de manitol, indicador de rojo congo y 20 g de agar-agar por litro. Los aislamientos se realizaran a partir de de ndulos activos de los sistemas radiculares de las plantas estudiadas, las cuales debern haber sido previamente esterilizadas mediante imbibicin por 30 segundos en hipoclorito de sodio al 5%, imbibicin en alcohol al 70% v/v por un lapso de tiempo de un (1) minuto y por ltimo lavados con abundante agua destilada y estril. Luego los ndulos deben ser macerados y esparcidos con un asa metlica estril en la superficie del medio de cultivo utilizando inicialmente rojo congo como indicador, las cajas de petri se incubaran a 25C/48 72 hrs Microorganismos infectantes del tallo: Se utilizar el medio BYMA; el medio nutritivo (Agar nutritivo), amidon 2 g/lt, 0.1 g de NaCl, 0.2, 0.5 g de levadura, 10 g de glucosa. Agar PDA y OGY. Los aislamientos se realizaran a partir de de regiones del tallo de plantas estudiadas, las cuales debern haber sido previamente esterilizadas mediante imbibicin por 30 segundos en hipoclorito de sodio al 5%, imbibicin en alcohol al 70% v/v por un lapso de tiempo de un (1) minuto y por ltimo lavados con abundante agua destilada y estril. Luego los segmentos de corte del tallo se pesaran (1 gr) y se mezclaran con 9 ml de

agua desionizada esteril, esta mezcla deben ser macerada y esparcidos mediante la tcnica de siembra por profundidad en cada medio de cultivo, las cajas de petri se incubaran a 25C/48 72. Hongos formadores y no formadores de micorriza se aislaron mediante la extraccin de esporas a partir del suelo rizosfrico, se prepararan diluciones seriales de suelo desde 10-2 hasta 10-8 con agua des ionizada y estril. De cada dilucin se transfieren aspticamente alcuotas de 1.0 mL a cajas de petri con 15 mL del medio de PDA y OGY y se lleva a incubacin a 25C/48 72 hrs. Posteriormente se debe determinar el nmero de esporas por gramo de suelo y separar los crecimientos por morfotipos con el fin de ser empleados para la siguiente practica. RESULTADOS. Los estudiantes deben realizar la tabla de informacin in situ, el conteo y la caracterizacin de microorganismos de acuerdo a diferencias macroscpicas detectables. BIBLIOGRAFIA Daza Paulo. Aislamiento de microorganismos de la rizosfera de Leucaena leucocephala y evaluacin de su uso potencial en la rehabilitacin de suelos degradados. Universidad Nacional de Colombia. 2010 W.D. Grant y P.E. Long. Ecologia, microbiana. Microbiologa ambiental. Captulo 1. Ed. ACRIBIA, Universidad de Navarra. Fecha consulta Abril 2012. Disponible en http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/51habitats%20de%20los%20microorganismos.htm

ANONIMO; Microbiologa de los organismos. Cap 6. Microorganismos ambientales naturales. Pearseon Education. Fecha consulta Abril 2012. Disponible en http://www.mailxmail.com/curso-microbiologia-organismos-1-2/microorganismos-ambientes-naturales.