subcultivo de clulas en monocapa y citometria de flujo

2015

[subcultivo de clulas en monocapa y citometria de flujo]

INTRODUCCIN Una de las formas de crecimiento in vitro es el cultivo en monocapa. Cuando las clulas requieren la adhesin a un sustrato para crecer y dividirse, el crecimiento se realiza en una nica capa celular (monocapa). Esta monocapa crecer hasta alcanzar cerca del 100% de confluencia (mxima capacidad de cubrimiento de superficie); pasado esta etapa, el crecimiento se detiene por inhibicin por contacto y las clulas pueden comenzar a degenerar, despegarse y morir. No obstante, algunas variantes de clulas tumorales son capaces de apilarse y dar lugar a multicapas.CULTIVO CELULAR: Termino utilizado para denominar el crecimiento de clulas in vitro, incluyendo el cultivo de clulas aisladas. En los cultivos celulares, las clulas no estn organizadas en verdaderos tejidos.CULTIVO PRIMARIO: El cultivo iniciado a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente de un organismo. Un cultivo primario debe ser considerado como tal hasta que se subcultive (o repique) con xito por primera vez. En ese momento se considera una lnea celular. DENSIDAD DE SATURACION: El mximo nmero de clulas mantenible bajo condiciones especficas de cultivo en un recipiente. Este trmino se expresa usualmente como el nmero de clulas por centmetro cuadrado en una superficie de cultivo o el nmero de clulas por centmetro cbico en un cultivo en suspensin.EFICIENCIA DE SIEMBRA (ADHESION): El porcentaje de clulas sembradas que se adhieren a la superficie del recipiente de cultivo en un tiempo determinado. Siempre deben establecerse las condiciones bajo las cuales se realiz la determinacin. LINEA CELULAR: Una lnea celular se origina a partir de un cultivo primario en el momento del primer subcultivo exitoso. El trmino lnea celular implica que los cultivos de la misma consisten en numerosos linajes de clulas presentes originalmente en el cultivo primario. Los trminos finita o continua son usados como prefijo si se conoce el estado del cultivo. Si no, el trmino lnea es suficiente. El trmino lnea continua reemplaza al trmino lnea establecida. MEDIO QUIMICAMENTE DEFINIDO: Una solucin nutritiva para cultivo de clulas siendo conocida la estructura qumica de cada componente. Aunque se sabe que an los compuestos qumicos puros pueden tener algunos contaminantes, se deben usar compuestos qumicos de alta calidad con datos analticos, si es posible, de los contaminantes.PASAJE (REPIQUE): La transferencia o trasplante de clulas, con o sin dilucin, de un recipiente de cultivo a otro. Se entiende que siempre que las clulas se transfieren de un recipiente a otro,.una cierta porcin de stas se pierde y que por lo tanto, se produce la dilucin de las clulas en forma deliberada o no. Este trmino es sinnimo del trmino subcultivo. PASAJE NUMERO (REPIQUE NUMERO): El nmero de veces que las clulas en cultivo han sido subcultivadas. En la descripcin de este proceso debe establecerse la relacin o dilucin de las clulas a fin de determinar la edad relativa del cultivoLos criterios para el subcultivo de clulas en monocapa son los siguientes Densidad del cultivo. Las clulas deben ser subcultivadas tan pronto como alcancen confluencia de otra manera saldran del ciclo y tardaran mas tiempo en recuperarse al ser resembradas. Agotamiento del medio Tiempo desde el ultimo subcultivo Citometra de flujo es un trmino general que hace referencia a una medida rpida de partculas que se mueven en un flujo. Esta tcnica fue diseada para la valoracin de una o ms propiedades de clulas individuales en suspensin, de forma secuencial en el tiempo. La informacin se obtiene a travs del uso de varias propiedades pticas de las partculas, de un rango de tamao entre 1 y 150 11m. Los aparatos diseados para estas mediciones provocan el paso consecutivo de clulas individuales suspendidas en un fluido apropiado a travs de una zona delimitada de anlisis, dnde se lleva a cabo este anlisis a medida que la clula atraviesa dicha zona.PARMETROS QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRA DE FLUJO La citometra de flujo permite medir diferentes parmetros de una clula. Parmetros nucleares Parmetros citoplsmicos Parmetros de superficie Parmetros extracelulares

Objetivos:Comprender los fundamentos en los que se basa la citometra de flujo.Analizar citometras

MATERIALES Clulas en mocapa Medio de cultivo PBS Tripsina Alcohol al 70%Contenedor de desechos Azul de tripanoPipetas graduadas (5 a10 ml) 1ml, 200 l y 20 l Pipetas pasteur Tubos de 15 ml Centrifuga Incubadora a 37C Cmara de Neubawuer Papel absorbente Microscopio invertido Clitmetro de flujo

PROCEDIMIENTO 1. Examinar cuidadosamente el cultivo, con la finalidad de observar su morfologa, o posible contaminacin 2. Tomar la caja en el rea de trabajo estril y remover el medio, adicionar PBS y lavar la monocapa, retirar el PBS con ayuda de la pipeta. Este paso se realiza con la finalidad de eliminar trazas de suero que puedan inhibir la accin de la tripsina 3. Agregar la tripsina, asegurndose de que la monocapa quede cubierta. Colocar la incubadora por minutos, o hasta que las clulas se muestren redondas No incubar ms de lo necesario.4. Agregar medio y dispersar las clulas mediante repetido pipeteo sobre la superficie de la monocapa 5. Finalmente mezclar la suspensin celular (opsional : transferir la suspensin celular a tubos falcon de 15ml y centrifugar, resuspender las clulas en 1 ml de medio. Realizar el conteo celular) y contar las clulas con un hemocitometro a 4000 reboluciones por minuto por 5 minutos 6. Diluir la suspensin celular a una adecuada concentracin para su resiembra 7. Colocar nuevamente las clulas

RESULTADOS caractersticas delas lneas celulares Las clulas HaCaT son una lnea celular establecida procedente de queratinocitos humanos inmortalizados espontneamente a partir de su incubacin a temperaturas altas y concentraciones bajas de Ca2+ en el medio de cultivoEsta lnea celular conserva la gran mayora de las caractersticas de queratinocitos humanos primarios, manteniendo una adecuada sntesis de queratinas, as como un fenotipo epidrmico prcticamente normal, incluso despus de ms de 300 subcultivos Las clulas HaCaT presentan una morfologa poligonal, son atumorignicas tras su inyeccin en ratones atmicos y poseen una notable estabilidad cromosmica