7/24/2019 Prctica 2 Determinacin de Proteinas Con Coomassie r250 en Papel Filtro Final

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UNIVERSIDAD AUTONMA

DEL ESTADO DE MORELOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

PROFESORA: Dra. Ma. Del Carmen Beltrn Nez

EQUIPO 2: Daz Villeda Karina Vianey

Posadas Garca Odalys Grisell

Jimnez ngel Roberto

MATERIA: Fsico-qumica de macromolculas

GRUPO: BE-51

FECHA: 01/marzo/2016

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CICLO ESCOLAR ENERO-JUNIO 2016

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DETERMINACIN DE PROTENAS CON COOMASSIE R250

EN PAPEL FILTRO

OBJETIVO.-

Determinar la concentracin de protena de las muestras problema de

manera semicuantitativa (a ojo), con la ayuda de una curva estndar

(empleando una protena patrn BSA,Suero-albmina bovina), a partir de

la observacin en papel filtro con Coomassie R250.

OBJETIVOS PARTICULARES.-

Identificar (investigar), las diferencias entre los dos colorantes

existentes de Coomassie; Coomassie G250 (utilizado en el mtodo deBradford) y Coomassie R250 (utilizado en la determinacin de

protenas por papel filtro). Con dicha prctica, se pretende corroborar que la determinacin de

protenas solubles por este mtodo, puede llegar a ser inclusive,

igual de confiable que por el mtodo de Bradford. Llevar a cabo, la manipulacin correcta del equipo, material del

laboratorio y de las instalaciones, as como el uso correcto de los

reactivos a disposicin.Acatar el protocolo de seguridad, con la utilizacin del equipo de

proteccin necesaria, como bata, guantes, googles, etc.

FUNDAMENTO.-

En muchas circunstancias, el volumen total de muestra es mnimo, por lo

que no se dispone de cantidades suficientes para realizar una

determinacin de la concentracin de protena en paralelo por mtodos

espectrofotomtricos convencionales. Se han propuesto varios mtodos

para tratar de resolver este problema, pero la mayora de los mismos son

relativamente poco sensibles y/o laboriosos.

El fundamento de la determinacin de protenas en papel filtro con

Coomassie R250, que aqu se describe, es un procedimiento utilizado

frecuentemente para la valoracin semicuantitativa de protenas en

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fracciones cromatogrficas, las cuales permiten la determinacin de la

concentracin de protena dentro de un rango 0.1-1 mg/mL, un rango

similar al abarcado por el ensayo de Bradford, el ms utilizado en la

actualidad, aunque el pequeo volumen requerido permite la deteccin de

cantidades de protena tan pequeas como 0.2-2 g.

INTRODUCCIN.-

La determinacin de protenas en los laboratorios de investigacin clnica ybiomdica se realiza en general mediante espectrofotometra UV-V, o bienanalizando la absorbancia de la solucin proteica, o bien mediantepruebas colorimtricas, de las cuales las ms empleadas son las delbiuret, el ensayo de Lowry, el ensayo de Bradford, entre otras.

La reaccin del biuret para la determinacin de protenas fue uno de losprimeros mtodos desarrollados para el anlisis colorimtrico de lasmismas y se usa todava hoy extensamente en aplicaciones que requierenrapidez pero no una elevada sensibilidad. Se basa en el complej amientodel cobre en una disolucin alcalina con el enlace peptdico de lasprotenas, y tambin con los residuos de tirosina. Su principalinconveniente, es el gran nmero de sustancias que interfieren con lamisma, entre ellas numerosos tampones utilizados frecuentemente enbiologa (Tris, Hepes, Pipes, Mes, etc.).

El ensayo de Lowry ha sido la tcnica ms empleada para la determinacinde protenas hasta hace relativamente poco tiempo. Es una ampliacin delprocedimiento del biuret en la que se forma un complejo de cobre-protenaen solucin alcalina, que a su vez reduce un reactivo fosfomolbdico-fosfotngstico para dar un color azul intenso. A pesar de ser una tcnicasensible (0.005 a 0.1 mg/mL) y muy especfica, presenta variasdesventajas que la han desplazado: Los reactivos utilizados son inestables;la cintica de la reaccin es lenta, y numerosas sustancias interfieren con

la reaccin.

El ensayo de Bradford es un mtodo rpido para la determinacin de laconcentracin de protenas. Su rango de sensibilidad va de 0.1 a 2 mg/mL(en su formulacin estndar) o de 0.01 a 0.2 mg/mL (formulacinmicromtodo). La base de la tcnica es la formacin de un complejoinsoluble azulado entre el colorante y la protena que es cuantificado

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posteriormente en base a su absorbancia a 595 nm. La posibilidad dedeterminar la concentracin de protena en micromuestras con las tcnicasespectrofotomtricas mencionadas, est condicionada al volumen mnimonecesario para realizar la lectura de la absorbancia, que es de 1.5 mL paralas cubetas estndar, 0.5 mL para las cubetas semimicro, y 0.1 mL paralas microcubetas, lo cual nos induce, a que existe una cantidad mnima demuestra requerida para la lectura.

En este procedimiento, las muestras con cantidades nfimas son aplicadasdirectamente sobre una tira de papel filtro Whatman 3MM, tras lo cual sonteidas simplemente con el colorante Azul brillante de Coomassie R-250 enmetanol-actico, y desteidas con la solucin de destincin estndar.

Papel filtro

En la seleccin de papel filtro se debe considerar la disponibilidad de unpapel estndar de calidad que sea de fuente confiable y tengacaractersticas tales como: flujo de aire, parmetros especiales para laretencin de partculas, velocidad de absorcin, calidad de filtracin ypropiedades de superficie, se fabrican de celulosa alfa al 98% se usan enaplicaciones generales de filtracin con retencin de partculas tan bajacomo 2.5 m. la variedad de filtros de papel favorece el continuo aumentode grado de puridad, dureza y resistencia qumica existen diferentes tiposde papel filtro cualitativos; con grados contra humedad, grados estndares

entre los cuales encuentran de grado 1, grado 2, grado 3, grado 4, grado 5,grado 6, grado 591, grado 595, grado 597, grado 598, grado 602. Gradosplegados los cuales ahorran tiempo por la forma, la velocidad de flujoestable por la reduccin de contacto del papel filtro. Tambin seencuentran papel filtro cuantitativos que son diseados para anlisis degravimetra, preparacin de muestras para el anlisis de instrumentos.

Diferencias entre Coomassie R250 y G250

Los colorantes de Coomassie (tambin conocidos como azul de Coomassie Coomassie Brilliant Blue), son los colorantes ms populares de tipoaninico, utilizados para la determinacin de protenas, ya queproporcionan una buena linealidad y una sensibilidad media,cuantitativamente hablando. Existen dos variantes de Coomassie;Coomassie R-250 y Coomassie G-250. Bsicamente, son dos formas

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qumicas de un compuesto llamadotrifenilmetano disulfonado, la nicadiferencia, es que la G250 presenta dos grupos de metilo adicionales.

La unin del complejo protena-colorante, se lleva a cabo a travs deinteracciones inicas entre los grupos de cido sulfnico del colorante ylas cargas positivas de los grupos amino de las protenas, formandocomplejos no covalentes a travs de interacciones de Van Der Waals.

Entre los dos, el Coomassie R250 es la variante ms utilizada, debido a ladeteccin de cantidad mnima de hasta 0.1 g de protena, esta tcnica esrelativamente barata, presenta un protocolo simple y compatible con otras

pruebas, como la espectrofotometra. Las desventajas, es que presenta unareproducibilidad baja y en ocasiones, la visualizacin de las protenaspuede ser difcil.

Por otra parte, el Coomassie G250, tambin ofrece una sensibilidadrelativamente alta, y consiste en un protocolo ms simple, ofreciendo unarpida tincin y eliminando la necesidad de decoloracin (en el caso debandas de gel), adems, la G250 se puede utilizar en la cuantificacin deprotenas solubles mediante el ensayo de Bradford, en el cual tras la unin

de las protenas con el colorante, se mide la absorbancia y a travs de unagraficacin se determina la concentracin de protena de una solucindada (como se realiz en la prctica anterior).

RESULTADOS.-

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La cantidad de protena qued seala por la concentracin observabledecoomassie R250. Se obtuvo lo siguiente.

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