Práctica 2: Estudio microscópico de los microorganismos.Tinción simple, tinciones diferenciales y selectivas.

Debido a que la mayoría de los microrganismos son translucidos, en esta práctica se nos proporcionaron diversos microrganismos para aprender a realizar adecuadamente las preparaciones y tinciones más utilizadas que existen; tinción simple, tinciones diferenciales (de Gram y BAAR) y selectivas (de capsula y endospora). Todo esto se hizo con el fin de poder identificar y describir correctamente algunas características microscópicas de las bacterias, tales como forma, agrupación, si son BAAR positivas, la presencia de cápsula o endosporas y clasificarlas como Gram positivas o Gram negativas.

Resultados

Tinción simple

µorganismo Forma Color

Saccharomyces cerevisiae

Ovalada morado

Tinción de Gram

µorganismo Forma Agrupac. Color Gram

S. oralis Cocos Estreptoco cos

azul +

Proteus sp Bacilo corto

________ rosa _

Tinción BAAR

µorganismo Forma Color BAAR

Mycobacterium Bacilo rosa +

Tinción negativa de capsula

µorganismo Forma y color

L. mesenteroides No se pudo observar

Pulque Diplococos rosas

Tinción selectiva de endosporaµorganismo Forma Color

B. cereus bacilo Rosa y verde la capsula

Análisis de resultados

Para todas las tinciones se establece una zona aséptica limpiando el área de trabajo y prendiendo el mechero, se trabaja a un radio de 12 cm de ella, con un asa bacteriológica esterilizada se procede a tomar la muestra, si se trata de un cultivo sólido, se coloca una pequeña gota sobre el cubreobjetos antes de colocar la muestra.

Para preparar el frotis de las muestras, primero se quitó la torunda del tubo, luego se flamea la boca del tubo y se enfría el asa dentro del el mismo, se toma la muestra, si ésta es líquida se cuida de que se forme una película en el asa, se coloca sobre el portaobjetos y se hacen círculos concéntricos en el portaobjetos hasta que la muestra quede bien extendida, esta no debe ser ni muy delgada ni muy gruesa para garantizarnos que tenemos una buena cantidad de microorganismos para teñir, después se deja secar al aire libre.

En el caso de la tinción de capsula, en vez de colocar una gota de agua, se usa una gota de tinta que no tenga afinidad por alguno de los constituyentes de la capsula, para poder crear un contraste con el medio y así poder ver la capsula de los microorganismos ya que esta se verá translucida.

Una vez seco el frotis, este se fija pasándolo por el fuego del mechero por

intervalos de 2 segundos, tres veces. Esto se hace para todas las muestras

excepto las de tinción de capsula, ya que esta capsula que está constituida de polisacáridos desaparecería al pasarla por la flama.

En la tinción simple se usa un solo colorante, que es de tipo básico como safranina, azul de metileno o cristal violeta, el cual se deja actuar por un minuto.Se utilizan solamente para incrementar elcontraste, todas las células absorberán el colorante y quedan teñidas del mismo color. En nuestro caso usamos cristal violeta para teñir una muestra de Saccharomyces cerevisiae, con esta tinción conseguimos observar la forma de la levadura, la cual era ovalada y en efecto se tiño de color morado al ser absorbido y adherido el colorante debido a la reacción que se lleva a cabo entre el colorante y los componentes de la pared de estas levaduras.

Las tinciones diferenciales se usan para distinguir entre distintos tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de una tinción primaria, decoloración y tinción de contraste. Ejemplo de estas son la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia, ambas aplicadas a bacterias.

Para la tinción de Gram utilizamos dos microorganismos distintos para clasificarlos como Gram (+) o Gram (-). Esta diferencia se consigue por las diferencias que hay en la composición de las paredes celulares de estos dos tipos de bacterias, ya que esto las hará teñirse de morado o rosa según sea el caso.

S. oralis y Proteus sp fueron nuestras muestras para realizarles esta tinción. A ambas les adicionamos cristal violeta como colorante primario por 1 minuto, este hizo que todas las células se tiñeran de color morado, para afianzar el colorante se utilizó Lugol como mordente. Después se procedió a lavar

las muestras con alcohol-cetona, la pared de peptidoglicano de una Gram (+) contiene acidos teicoicos y lipoteicoicos y es gruesa, esta solo se deshidrata y adelgaza con este lavado, pero retiene el primer colorante, en cambio la pared de una Gram (-) al ser más delgada y poseer una membrana externa de lipopolisacaridos, ambas desaparecerán con el lavado y dejaran salir el colorante que estaba en el citoplasma de la célula bacteriana dejándola incolora. Como colorante de contraste se usó safranina, la cual tiñe de rosa a las bacterias que no retuvieron el cristal violeta debido a que su pared desapareció por el lavado con alcohol acetona.Se denomina Gram (+) a las células teñidas de morado y como Gram (-) a las que se tiñeron de rosa.

A S. oralis la clasificamos como una Gram (+) ya que se tiño de color morado-azul, a parte este tipo de tinción nos proporcionó información sobre su morfología y agrupación, la cuál era en forma de coco formando cadenas (estreptococos).

Proteus sp se tiño de color rosa, lo que indica que es una Gram (-), no hubo una agrupación en específica para esta bacteria con forma de bacilo corto.

La otra tinción diferencial que se uso fue la de BAAR o de Ziehl-Neelsen, este tipo de tinción también se basa en la composición de la pared celular característica de algunas bacterias.

Mycobacterium fue el microorganismo al que le aplicamos esta tinción.Ya que estas bacterias poseen una pared celular de peptidoglicano delgada, pero sobre ella tienen una capa gruesa de ácidos micolicos y ceras constituida de arabinogalactanos, es necesario aplicar calor por un lapso de 10 minutos para ablandar estas ceras y permitir el paso del primer colorante que para este caso fue fuccina fenicada. A diferencia

de la tinción de Gram donde se utilizaba Lugo como mordente, en esta tinción se usa vapor de agua para facilitar la penetración del primer colorante. Otra característica distinta entre estas dos tinciones, es que en la BAAR se lava a la muestra con ácido clorhídrico disuelto en etanol y posteriormente se usa un colorante especial, que no es básico como en la de Gram, sino que es de carácter acido, nuestro colorante de contraste fue el azul de metileno de Loeffer, este segundo colorante tiñe de azul a todas la células que son BAAR (-), mientras que las BAAR (+) permanecen color rosa ya que retuvieron al primer colorante debido a que aunque hayan perdido su delgada pared en el lavado, su capa de ácidos micolicos y ceras lo retuvieron dentro de la celula.En ambas tinciones diferenciales, el punto crítico es el lavado para decolorar.

Mycobacterium se tiño de color rosa y es considerada una BAAR (+) y esta tinción nos permitió ver que su forma era bacilar.

Mientras que las tinciones diferenciales nos permiten distinguir entre distintos tipos de microorganismos, las tinciones selectivas nos permiten observar una estructura u organelo en específico, los más comunes son las endosporas, los flagelos y las cápsulas.Las bacterias del genero Bacillus y Clostridium se caracterizan por generan estructuras de resistencia denominadas esporas, estos organelos presentan numerosas capas que se denominan exosporio, cubierta de la espora y cortex.Para identificar si un microorganismo es esporulado se realiza una tinción selectiva de endospora.Como en las tinciones diferenciales, en esta también se utiliza un colorante primario; el verde de malaquita que en efecto tiño las esporas de nuestra muestra de B. cereus. Al igual que en la tinción de BAAR, en esta tinción se utiliza como mordente al calor generado por el vapor de agua durante 10 minutos para

ablandar las capas de la espora mientras se agrega colorante evitando que este se seque. Este colorante tiñe de verde las esporas y como colorante de contraste se usó safranina al 0.5% para teñir a las células vegetativas.

La ultima técnica que se uso fue la tinción negativa de capsula, donde se lograron observar las cápsulas de la bacteria del pulque al crear un contraste con el medio, estas estaban rodeadas de negro y eran translucidas, pero no se tiñeron debido a que las partículas de colorante no penetran la cápsula y no reaccionan con lo polisacáridos de la misma. L. mesenteroides fue la otra muestra con la que trabajaos, pero debido a una mala preparación y extendido de la muestra, no se consiguió observar su capsula. Lo mismo hubiera pasado si fijáramos la muestra con calor.

Conclusión:

Mediante la realización de estas tinciones y la preparación de un correcto frotis, se logró hacer una clasificación, observar la forma, agrupación y algunas estructuras de varios microorganismos. Así mismo, las diferentes técnicas de tinción que existen son de gran utilidad en la microscopia de campo claro ya que nos permiten teñir las células y aumentar así su contraste facilitándonos su observación y estudio.

Bibliografía Manual de prácticas de microbiología

experimental (1515), FQ, UNAM

M. T. Madigan, J. M. Martinko, J. Parker. Brock Biología de los Microorganismos, 10ª edición, Pearson – Prentice Hall, Madrid, 2004, pag: 57-59, 91-92, 96.