Practica Biologia 2013-II (1-4)
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL QUIMICA
M A N U A L D E P R A C T I C A S
L A B O R A T O R I O DE
B I O L O G Í A
CH 061
SEMESTRE ACADEMICO 2013-1
PILAR GARCÍA AVELINO
Jefe de Prácticas
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
2
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA BIOLOGÍA (CH 061)
Cronograma de Practicas de Laboratorio de BIOLOGÍA - CH 061
LABORATORIO Fecha de ejecucion
Entrega de Informe
CLASE INTRODUCTORIA AL LABORATORIO
10 y 11 de setiembre
1. Reconocimiento de Biomoléculas 17 y 18 setiembre 24 y 25 set.
2. Extracción de ADN 1 y 2 octubre 9 oct.
EXAMENES PARCIALES 14 ó 16 octubre* NO HAY
LABORATORIO
3. Amilasa salival 22 y 23 octubre 29 y 30 oct.
PRACTICA CALIFICADA 1: Análisis de un artículo científico
30 octubre
EXPOCIENCIA 5 al 8 noviembre NO HAY
LABORATORIO
4. Hongos ambientales 12 y 13 noviembre 19 y 20 noviembre
PRACTICA CALIFICADA 2 Bioseguridad y Laboratorios: 1, 2, 3
25 de noviembre En la clase de
TEORIA!
EXÁMENES FINALES 09 ó 11 diciembre* NO HAY
LABORATORIO
EXÁMENES SUSTITUTORIOS 16 ó 18 diciembre* NO HAY
LABORATORIO
En la fecha de realización de los laboratorios se entregaran los preinformes correspondientes. * Las fechas definitivas de los exámenes parcial, final y sustitutorio serán definidas por el Dr. Guy Carvajal
Prof. Pilar García Avelino
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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PRESENTACION DEL MANUAL DE PRÁCTICAS
El propósito del Laboratorio es familiarizar al estudiante con la metodología de trabajo de la biología, proporcionarle un ambiente donde tenga oportunidad de encontrarse con sustancias e instrumentos que le motive a experimentar.
Considerando al laboratorio como un lugar donde el trabajo en equipo se facilita, da lugar a un proceso de constante integración, comunicación, investigación, construcción de ideas, surgimiento de nuevas preguntas, donde las actividades experimentales propician la reorganización de conocimientos y facilitan el alcanzar un aprendizaje significativo.
Para logra tales fines, se propone esta guía que, como material de apoyo didáctico, reforzara el proceso constante de enseñanza aprendizaje, requiriendo la participación y guía del profesor.
Material necesario para trabajar por alumno:
Individualmente: un mandil, gafas de seguridad, guantes, plumón marcador, toalla, cuaderno
de apuntes.
Por equipo: El que se indique para cada práctica.
INSTRUCCIONES GENERALES.
1. Busca conceptos, antecedentes previos a la realización de las prácticas.
2. Construye la hipótesis de trabajo, antes de solicitar su material.
3. Lee cuidadosamente los experimentos antes de ejecutarlos.
4. Recurre a tus libros de texto y/o consulta para aclarar dudas después de realizadas las
practicas, o consulta al profesor responsable.
5. Al efectuar cada uno de los pasos del desarrollo experimental, observa minuciosamente
y anota los cambios ocurridos.
6. Al concluir el desarrollo experimental, resuelve el cuestionario para su futura revisión.
7. Elabora tus conclusiones.
PRECAUCIONES PARA EL DESARROLLO DE CADA EXPERIMENTO
Las medidas oportunas y la compresión de las prácticas a seguir, hará del laboratorio un
lugar seguro como cualquier ambiente de clases.
Para ello deberán tenerse en cuenta, en forma general las siguientes precauciones:
1. Observa donde dejas el material caliente, cerciorándote que este frio antes de tomarlo
con la mano.
2. Cuando calientes un tubo de ensayo, no lo apuntes hacia ti o hacia tus compañeros,
pude proyectarse su contenido.
3. Si cae sobre ti o en tu ropa un material corrosivo, lávate inmediatamente con
abundante agua, e infórmalo al profesor del curso.
4. Nunca pruebes una sustancia.
5. Al detectar el olor de un liquido, no coloques la cara sobre la boca del recipiente, con
tu mano abanica hacia ti el aroma.
6. Antes de usar un reactivo lee dos veces la etiqueta de su contenido.
7. Los tubos de ensayo no pueden calentar ser por el fondo sino por las paredes, para
evitar su expulsión del contenido.
8. No arrojes cuerpos sólidos en los lavaderos, no viertas directamente los ácidos.
9. Rotula tu material de trabajo, así te será fácil identificarlos.
10. Cuando trabajes con el mechero mantén tu cabello recogido.
11. Nunca emplear papel para encender el mechero.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA BIOLOGÍA (CH 061)
PRESENTACION DEL INFORME
No olvidarse de indicar el grupo de laboratorio (incluido horario) que pertenecen: A1, A2, B1, B2, C1, C2
I. Resumen (1 p)
¿Qué teorías lo sustentan? En relación al desarrollo de los experimentos.
II. Objetivos específicos (1 p) Tema central de estudio para cada experimento desarrollado
III. Observaciones experimentales, datos y resultados (para c/experimento) (3 p) Durante el desarrollo del experimento: Qué se observó? Qué datos hubieron? ¿Cuáles fueron los resultados?¿Qué reacciones se dieron? Se indican los resultados tal y como se dieron durante la investigación. Se debe describir los pasos ejecutados durante la experimentación
Se pueden presentar los datos en tablas, gráficas, o figuras, debidamente numeradas IV. Discusión de las observaciones experimentales, datos y resultados (3 p)
¿Se obtuvieron los resultados correctos según la teoría? ¿Si, no? ¿Qué sucedió? Es la etapa que encadena los resultados obtenidos por la investigación. Se relaciona, interpreta y discute los resultados. Se pone a prueba la capacidad analítica y de autocrítica del investigador. La discusión pone el toque personal al trabajo.
V. Conclusiones (2 p) ¿Qué significan los resultados? Las conclusiones están relacionadas con los objetivos. Es el análisis del cumplimiento de cada uno de los objetivos de la práctica
VI. Cuestionario (1.5 p) Preguntas relacionadas al tema
VII. Bibliografía (0.5 p)
¿Qué autores se consultaron para fundamentar la investigación? ¿Qué fuentes han sido consultadas (libros, artículos, tesis? REVISAR: Referencias Bibliografías al estilo Vancouver, en: http://www.unap.cl/p4_biblio/docs/Normas_VANCOUVER.pdf
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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PREINFORME DEL LABORATORIO Nº 1
RECONOCIMIENTO DE BIOMOLECULAS
Nombre del Alumno: Calificación
Grupo:
Fecha:
Recuerde que el PREINFORME debe de entregarlo de manera individual, el día de realización del laboratorio,
se presenta en hojas A4 bond, que tiene un peso máximo de 4 ptos. sobre la nota del Laboratorio.
1. Realice el DIAGRAMA DE FLUJO de los experimentos a desarrollar PROCEDIMIENTO,
realice un esquema de trabajo de cada experimento.
Es el plan ordenado de la forma en que se realizó la práctica para lograr el objetivo de la
misma. (2 puntos)
Ejemplo:
Se indica el proceso (…Se adiciona… se separa)
a. Identificación de azucares reductores
b. Hidrolisis de la sacarosa
c. Reconocimiento del almidón
d. Reconocimiento de proteínas
e. Reconocimiento de lípidos
2. Cuestionario:
a. Mencione algunos carbohidratos alimenticios, según la clasificación de la siguiente
tabla:
Monosacáridos (3 ej.)
Disacáridos (3 ej.)
Oligosacáridos (1 ej.)
Polisacáridos (2 ej.)
b. ¿Qué es la inversión de la sacarosa?
c. ¿Qué sucede “químicamente” al añadir lugol a las muestras positivas para la reacción?
d. ¿Cuál es la reacción que tiene lugar entre el reactivo de Biuret y las proteínas?
e. ¿Cuál es el valor de la polaridad de la acetona y el cloroformo?
3. Bibliografía: cite correctamente la bibliografía consultada
A
B
C
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA BIOLOGÍA (CH 061)
GUIA DE LABORATORIO Nº 1
RECONOCIMIENTO DE BIOMOLECULAS
INTRODUCCIÓN
En los organismos se encuentran cuatro tipos diferentes de moléculas orgánicas en gran
cantidad: carbohidratos, lípidos, proteínas y nucleótidos. Todas estas moléculas contienen
carbono, hidrógeno y oxígeno. Además, las proteínas contienen nitrógeno y azufre, y los
nucleótidos, así como algunos lípidos, contienen nitrógeno y fósforo.
Se ha dicho que es suficiente reconocer cerca de 30 moléculas para tener un conocimiento que
permita trabajar con la bioquímica de las células. Dos de esas moléculas son los azúcares
glucosa y ribosa; otra, un lípido; otras veinte, los aminoácidos biológicamente importantes; y
cinco las bases nitrogenadas, moléculas que contienen nitrógeno y son constituyentes claves
de los nucleótidos.
En esencia, la química de los organismos vivos es la química de los compuestos que contienen
carbono, es decir, los compuestos orgánicos.
El carbono es singularmente adecuado para este papel central, por el hecho de que es el
átomo más liviano capaz de formar múltiples enlaces covalentes. A raíz de esta capacidad, el
carbono puede combinarse con otros átomos de carbono y con átomos distintos para formar
una gran variedad de cadenas fuertes y estables y de compuestos con forma de anillo. Las
moléculas orgánicas derivan sus configuraciones tridimensionales primordialmente de sus
esqueletos de carbono. Sin embargo, muchas de sus propiedades específicas dependen de
grupos funcionales. Una característica general de todos los compuestos orgánicos es que
liberan energía cuando se oxidan. Entre los tipos principales de moléculas orgánicas
importantes en los sistemas vivos están los carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los
nucleótidos.
OBJETIVOS
Determinar cualitativamente los azucares reductores.
Hidrolizar la sacarosa.
Reconocer la presencia de almidón.
Reconocer cualitativamente las proteínas presentes en muestras biológicas.
Demostrar la solubilidad de los lípidos en diferentes tipos de solventes.
MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de ensayo, mechero, placas petri, vasos de precipitado, gradillas, pipetas graduadas,
propipetas, pinzas de madera, pisceta, almidón.
Reactivo de Fehling, solución de azucares, solución de almidón, acetona, cloroformo, sulfato de
cobre, hidróxido de sodio
Por grupo: un huevo, 5 ml leche, 1 papa (elementos crudos)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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IDENTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES (I)
FUNDAMENTO
Los monosacáridos (figura 1) y la mayoría de los disacáridos poseen poder reductor, que
deben al grupo carbonilo que tienen en su molécula. Este carácter reductor puede ponerse de
manifiesto por medio de una reacción redox, llevada a cabo entre ellos y el sulfato de cobre (II).
Tras la reacción con el glúcido reductor se forma óxido de cobre (I) de color rojo. De este modo
el cambio de color indica que se ha producido la reacción y que el glúcido presente es reductor.
Figura N°1. Algunos monosacáridos
Reacción de Fehling:
Es una reacción cualitativa que sirve para determinar la presencia de un azúcar reductor que
no sea sacarosa (carece de carbono anomérico y no es azúcar reductor).
El reactivo de Fehling presenta sulfato de cobre, carbonato de sodio, citrato de sodio, y agua.
En la reacción para determinar a los azucares reductores los agentes estabilizantes de la
reacción son el carbonato y citrato, el sulfato de cobre es el reactante específicamente el Cu
que va a reaccionar con los grupos químicos de aldehídos y cetonas. Que en reacciones de
oxido reducción el Cu se convierte en CuO dando un color rojo ladrillo que precipitará
posteriormente, como lo expresa la siguiente reacción (figura 2):
Figura N°2. Reacción de Fehling
PROCEDIMIENTO
- Rotular 6 tubos de ensayo, adicionar el azúcar correspondiente.
- Adicionar los reactivos en el orden señalado
- Mezclar por inversión el reactivo con cada uno de sus componentes
- Someter a la acción del calor hasta ebullición
- La reacción será positiva si en la muestra se forma un precipitado color rojo ladrillo
(CH2O), y será negativa si se queda azul o cambia a un tono de azul-verdoso.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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Tabla N°1. Azucares reductores
COMPONENTES TUBO DE ENSAYO
1 2 3 4 5 6
1.Solución de glucosa 1% 3 ml
2.Solución de maltosa 1% 3 ml
3.Solución de lactosa 1% 3 ml
4.Solución de fructuosa 1% 3 ml
5.Solucion de galactosa 1% 3 ml
6.Solución de sacarosa 0.5% 3 ml
Reactivo de Fehling A 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Reactivo de Fehling B 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1ml 1 ml
Calor: ebullición (aprox. 5´) mechero / baño maría
GRAFICAR / ESQUEMATIZAR / ANOTAR SUS OBSERVACIONES Y RESULTADOS (De las distintas muestras)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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HIDROLISIS DE LA SACAROSA (II)
FUNDAMENTO La sacarosa (figura 3) es un disacárido que no posee carbonos anoméricos libres por lo que
carece de poder reductor y la reacción con el licor de Fehling es negativa, como ha quedado
demostrado en el anterior experimento. Sin embargo la presencia de HCl y el calor, la sacarosa
se hidroliza, es decir incorpora una moléculas de agua y se descompone en los monosacáridos
que la forman: glucosa y fructuosa, que sí son reductores (figura 4).
Figura N° 3. Sacarosa
Figura N° 4. Disacáridos: (a) reductor, (b) no reductor
PROCEDIMIENTO
- Mezclar por inversión el reactivo con cada uno de sus componentes, ver la tabla 3.
- Someter a la acción del calor hasta ebullición
Tabla N°2. Componentes de la hidrolisis de la sacarosa
COMPONENTES Muestra sacarosa
Solución de sacarosa 0.5% 3 ml
Ácido clorhídrico HCl 1M 1 ml
Calentar al mechero 5’
Enfriar
Hidróxido de sodio NaOH 1M 1 ml
Reactivo de Fehling A 1 ml
Reactivo de Fehling B 1 ml
Calor: ebullición mechero
baño maría
- La reacción será positiva si en la muestra se forma un precipitado color rojo ladrillo
(CH2O), será negativa, si la hidrolisis no se ha realizado correctamente, apareciendo
una coloración verde en el tubo de ensayo.
GRAFICAR / ESQUEMATIZAR / ANOTAR SUS OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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RECONOCIMIENTO DE POLISACARIDOS: ALMIDÓN (III) FUNDAMENTO
El almidón es un polisacárido vegetal formado por dos componentes: la amilosa y la
amilopectina. Esta prueba usa como reactivo el lugol, se basa en la especificidad del almidón
cuando está presente en solución, la cual da un color azul en presencia del Yodo. El lugol
presenta: yoduro de potasio y yodo, más agua (solución de Lugol). El yodo de la solución
tiene afinidad por los enlaces α 1-4 y α 1-6 de la moléculas de almidón, esta interacción del
yodo por dichos enlaces producen el cambio de coloración no por una reacción química sino
por una reacción de adsorción o fijación de iodo en la superficie de la molécula de amilosa, lo
cual solo ocurre en frio (a temperatura ambiente) La amilosa en disolución coloidal y en
presencia de iodo se colorea de azul toma color azul, la amilopectina da una coloración rojo
violácea.
Figura N° 5. Fragmento de la molécula del almidón (amilopectina)
En el círculo un monómero de glucosa.
PROCEDIMIENTO
- Colocar los componentes indicados en la tabla 4, adicionar el reactivo de lugol y
observar los primeros cambios de coloración.
Tabla N° 3. Reconocimiento del almidón
COMPONENTES TUBO DE ENSAYO
1 2 3
Solución de almidón 2% 1 ml
Papa rallada 1 ml
Albúmina 1 ml
Reactivo de Lugol 3 gotas 3 gotas 3 gotas
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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- Mezclar por inversión y anotar los resultados, será positivo si se torna azul, violáceo.
- Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color.
- Enfriar el tubo de ensayo en agua fría, observar como a los 2-3 minutos reaparece el color azul
GRAFICAR / ESQUEMATIZAR / ANOTAR SUS OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS (IV) FUNDAMENTO Las proteínas son macromoléculas formadas por la unión de muchos aminoácidos (figura 6) por
enlace peptídico (estructura primaria). Además pueden darse uniones por enlaces débiles de
distinta naturaleza que hacen que la proteína adquiera una conformación tridimensional
característica (estructura terciaria) ver la figura 7. Las variaciones de pH, temperatura o
concentración salina pueden destruir esos enlaces débiles de manera que la proteína pierde
su conformación y se dice que se desnaturaliza.
Figura N°6. Unidad de la proteína:
aminoácido
Figura N°7. Estructura de las proteínas
Las proteínas debido al gran tamaño de sus moléculas forman con el agua soluciones
coloidales que pueden precipitar formándose coágulos al ser calentadas a temperaturas
superiores a 70°C o al ser tratadas con soluciones salinas, acidas, alcoholes, etc.
Una de las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven para su
identificación, cabe resaltar la reacción de Biuret (figura 8). Esta reacción los producen los
péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ello se debe a la presencia del enlace
peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los aminoácidos
Reacción de Biuret (figura 8)
Se debe a los componentes que presenta: el hidróxido de sodio y sulfato de cobre (II); el cual el
agente denaturante de las proteínas es el hidróxido y el reactante es el sulfato de cobre. Las
proteínas después de ser denaturadas facilitan la interacción del Cu con los pares de
electrones sin compartir del grupo amino del péptido mediante enlaces de coordinación con la
formación de un complejo coloreado púrpura – violáceo, cuya intensidad depende de la
concentración de proteínas.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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Figura N°8. Complejo de cobre formado en la reacción de Biuret
PROCEDIMIENTO
- Rotular tres tubos de ensayo, en el primero agregar 2 ml de albúmina (huevo), en el
segundo tubo 2 ml de leche, y en el tercero 2 ml de la solución de almidón.
- Añadir 0.5 ml de hidróxido de sodio (NaOH) al 5%, y 0.5ml de sulfato de cobre
(Cu2SO4) al 1% a cada tubo.
Tabla N°4. Ensayos de proteínas
COMPONENTES TUBO DE ENSAYO
1 2 3
Albúmina (huevo) 2 ml
Caseína (lácteo) 2 ml
Sol. almidón 2 ml
NaOH 5% 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
Rvo. Biuret: Cu2SO4 1%
0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
- Observe la formación del color violeta en los tubos que presentan proteínas, siendo
Biuret (+), de no haber un cambio de color será Biuret (-).
GRAFICAR/ESQUEMATIZAR SUS OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS (V)
FUNDAMENTO
Los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en
pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso que es transitoria, pues al
dejarlo en reposo desaparece por la reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que por
su menor densidad se sitúa sobre el agua. Las grasas son solubles en disolventes orgánicos.
En este experimento el reconocimiento de lípidos será por la prueba de solubilidad,
identificando el comportamiento de las moléculas de aceite con el agua, las cuales no se
homogenizan, debido a que estas presentan características diferenciales, mientras que el agua
es polar, el aceite es no polar, esto hace que microscópicamente se note que el aceite forme
micelas en solución acuosa. Donde las colas hidrofóbicas de las moléculas de aceite se
“esconden” del agua adoptando la forma de micelas.
PROCEDIMIENTO
Tabla 8. Reconocimientos de lípidos por solubilidad
COMPONENTES TUBO DE ENSAYO
1 2 3
Aceite 1 ml 1 ml 1 ml
Agregar por las paredes del tubo cada componente:
Agua destilada 2 ml
Acetona 2 ml
Cloroformo 2 ml
- Rotular los tubos y en cada uno de ellos adicionar 1 ml de aceite
- Luego por las paredes de cada tubo adicionar: 2ml de agua para el primer tubo, 2ml de
cloroformo para el segundo tubo y cloroformo para el tercer tubo
- NO HOMOGENIZAR! Hacer la primera observación.
- Mezclar por inversión cada tubo, dejar en reposo por 5 minutos
- Anotar las observaciones respectivas.
Tabla 9. Resultados de la solubilidad de los lípidos
Muestra Aceite
+ agua destilada Aceite
+ acetona Aceite
+ cloroformo
Soluble
GRAFICAR/ESQUEMATIZAR SUS OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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INFORME DEL LABORATORIO Nº 1
RECONOCIMIENTO DE BIOMOLECULAS
1 Resumen (1p)
Nombre del alumno (Apellidos, Nombre)
Pre informe (4 p)
Informe (12 p)
Desempeño (4 p)
Nota
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
16
2 Objetivos específicos (1p)
3 Datos y observaciones experimentales (4 p)
Experimento N° 1: Identificación de Azucares Reductores
Tabla N°1. Resultados de azucares reductores
GLÚCIDO glucosa maltosa lactosa fructuosa galactosa sacarosa
Reductor
Importante: Es necesario indicar la formación de precipitado y la cantidad con un signo (+++).
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
17
Experimento N° 2: Reconocimiento del Almidón
Tabla N°2. Resultado de reconocimiento del almidón
Muestra almidón papa Clara de huevo
Reacción al lugol
Experimento N° 3: Reconocimiento de polisacáridos: Almidón
Tabla N°3. Resultado de reconocimiento del almidón
Muestra almidón papa huevo
Almidones?
Importante: Es necesario indicar la intensidad del color con un signo (+++).
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
18
Experimento N° 4: Reconocimiento de Proteínas
Tabla N°4. Ensayos de proteínas
Muestra albúmina caseína almidón
Proteínas
Importante: Es necesario indicar la intensidad del color con un signo (+++).
Experimento N° 5: Reconocimiento de Lípidos
Tabla N°5. Resultados de la solubilidad de los lípidos
Muestra Aceite
+ agua destilada Aceite
+ acetona Aceite
+ cloroformo
Soluble
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
19
4 Discusión de observaciones, datos y resultados (3 p)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
20
5. Conclusiones (2 p)
6. Cuestionario (1.5 p)
1. ¿Qué azúcares son reductores?
2. ¿Qué función tiene el ácido clorhídrico?
3. Al trabajar con el lugol ¿Por qué se da el cambio de coloración después de sometido al
calor? Fundamente su respuesta.
4. ¿Qué es la desnaturalización?
5. ¿Qué la provocado que la desnaturalización en la muestra?
6. ¿Cuál de las muestras empleadas tiene mayor cantidad de proteínas?
7. ¿Qué es una emulsión transitoria?
8. ¿Qué es una emulsión permanente?
9. ¿Con cuál de los solventes orgánicos fue soluble el aceite?
10. En nuestro sistema digestivo que enzima se encarga de solubilizar las grasas que
consumimos?
7. Bibliografía (0.5 p)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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ANEXO 1
PREPARACION DE REACTIVOS
LABORATORIO: RECONOCIMIENTO DE BIOMOLECULAS
a. Soluciones de azucares ó glúcidos al 1%
Glucosa, maltosa, lactosa, fructuosa, galactosa, sacarosa, almidón.
Se pesa 1 gramo de un glúcido y se disuelve en 100 ml de agua destilada, agitando
hasta disolverse por completo.
Se vierte en un frasco limpio y se rotula, indicando la fecha de preparación.
Así para cada uno de ellos.
Para el caso del almidón, debe emplearse agua destilada caliente y agitación constante
b. Solución de almidón al 2%
Se pesa 2 gramos de almidón y se disuelve en 100 ml de agua destilada caliente y en
agitación constante.
c. Hidróxido de sodio al 5%
Se pesa 5 gramos de NaOH y se disuelve en 100 ml de agua destilada.
d. Reactivo de Fehling
Solución A: solución al 3% de sulfato cúprico cristalizado
Pesar 30 g de sulfato cúprico Cu2SO4 y aforar en un litro con agua
destilada
Solución B: solución al 15% de sal de Rochelle (tartrato de sodio y potasio) en
solución acuosa al 5% de hidróxido de sodio NaOH.
Preparar un litro de hidróxido de sodio al 5% (50 grs en 1 L) y adicionarle
150 g de tartrato de sodio y potasio
e. Solución de lugol: yodo/yoduro de potasio
Adicionar 2 g de yoduro de potasio y1 g de yodo a 80 ml de agua destilada, agitar hasta
solubilizar los reactivos Aforar 100ml de agua.
f. Reactivo de Biuret
Solución A: 17.3 g de sulfato de cobre Cu2SO4 en 100 de agua destilada caliente
Solución B: 17.3 g de citrato sódico Na2CO3y 100 g de bicarbonato de sodio anhidro
NaHCO3 en 800 ml de agua destilada caliente.
Se mezclan ambas soluciones, se enrazan a un litro y se ponen en un matraz cubierto
para evitar la acción de la luz. El reactivo se guarda en un frasco color ámbar.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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PREINFORME DEL LABORATORIO Nº 2
EXTRACCION DE ADN ANIMAL
Nombre del Alumno: Calificación
Grupo:
Fecha:
Recuerde que el PREINFORME debe de entregarlo de manera individual, el día de realización del laboratorio,
se presenta en hojas A4 bond, que tiene un peso máximo de 4 ptos. sobre la nota del Laboratorio.
1. Realice el DIAGRAMA DE FLUJO de los experimentos a desarrollar PROCEDIMIENTO,
realice un esquema de trabajo de cada experimento.
Es el plan ordenado de la forma en que se realizó la práctica para lograr el objetivo de la
misma. (2 puntos)
Ejemplo:
Se indica el proceso (…Se adiciona… se separa)
2. Cuestionario:
¿Qué es el ADN basura? ¿Qué es código genético? ¿Cuántos genes tiene el hombre? ¿Hay espacio vacío entre los átomos en una doble hélice de ADN?
3. Bibliografía: cite correctamente la bibliografía consultada
A
B
C
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
23
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA BIOLOGÍA (CH 061)
GUIA DE LABORATORIO Nº 2
EXTRACCIÓN DE ADN ANIMAL
INTRODUCCIÓN El ADN es una cadena de nucleótidos, es un polinucleótido. Esta
cadena está formada por muchas unidades de nucleótidos unidas entre
sí, por un enlace peptídico, y cada nucleótido está formado por un
azúcar (desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adenina
(A), timina (T), citosina (C) ó guanina (G)) y un grupo fosfato que actúa
como la unión de nucleótidos. Ver la figura 1.
La secuencia del ADN se especifica nombrando sólo la secuencia de
sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo
de la cadena, es decir, el ordenamiento de los nucleótidos, es la que
codifica la información genética.
El ADN se presenta como una doble cadena de nucleótidos, en la que
las dos hebras están unidas entre sí por enlaces. El ADN forma el gen,
que es la unidad básica de la herencia.
Figura 1. Estructura del ADN
El ADN tiene algunas propiedades por las que es importante en la evolución:
1) Almacena información,
2) Es una molécula estable, por lo que no cambia (muta) con mucha frecuencia.
3) En ocasiones ocurren pequeños cambios en el ADN que dan lugar a la variación
necesaria para que se produzca la selección natural.
En las plantas, los animales y los hongos, el ADN se encuentra mayormente en el núcleo de las
células. Para extraer el ADN de las células vegetales hay que romper la fuerte pared celular
exterior, emulsionar los lípidos de la membrana plasmática y la envoltura nuclear.
La extracción del ADN celular es una etapa clave en muchos procedimientos de biología
molecular y aplicaciones de ingeniería genética. El método varía dependiendo de la célula o
tejido desde donde se necesita extraer el DNA, sin embargo, cualquier protocolo tiene las
siguientes etapas básicas:
Primero las células deben ser homogenizadas, lisadas (rotas) para liberar el núcleo (si está
presente). El núcleo también debe ser roto para liberar el DNA. En este punto el DNA debe ser
protegido de enzimas que podrían degradarlo (nucleasas). Una vez que el DNA es liberado.
Debe ser precipitado con alcohol (etanol) para purificarlo y concentrarlo. Dependiendo de las
aplicaciones posteriores, puede ser necesario someter el DNA a etapas de purificación
adicionales. Usualmente el DNA extraído se analiza mediante electroforesis en geles de
agarosa y/o espectrometría UV.
OBJETIVOS
Lograr la extracción y visualización de ADN de una muestra animal.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
24
MATERIALES Y REACTIVOS
Vasos de precipitado de: 500, 250 y 100 ml; probetas de 100 y 50 ml, 2 pipetas graduadas de
10 ml, 1 propipeta,1 pisceta, 1 pipeta pasteur, 2 tubos de ensayo de 15 ml, 1 gotero, 1 gradilla,
1 varilla de vidrio, 1 embudo, gasa, papel filtro, hielo, shampoo de color claro,
cloruro de sodio 2M, alcohol a bajas temperaturas (muy frio: 0° C), azul de metileno.
Por grupo: gasa, alcohol de 96° C muestra animal: hígado de pollo
FUNDAMENTO
El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular, disperso y replegado, unido a proteínas
para formar la cromatina. Para extraerlo es necesario homogenizar el tejido y romper las
células para separar el núcleo, al lograrlo se libera el ADN, se debe separar de las proteínas y
precipitarlo para extraerlo de la solución. Se visualizara como un agregado de fibras
blanquecinas que se podrán adherir a una varilla de vidrio.
EXTRACCION DE ADN ANIMAL
PROCEDIMIENTO
A cada paso indicado, escriba la finalidad
1. Triturar una porción de hígado de pollo (20 grs) con 50 ml de agua destilada fría en un mortero, añadir 1 gramo de arena fina, seguir homogenizando.
2. Filtrar 1 vez el homogenizado en una gasa contenido sobre un embudo en la probeta de 50 ml, para obtener la “suspensión”
3. En un vaso precipitado de 50 ml colocar 5 ml de la suspensión, adicionar 5 ml de NaCl 2M frio y agitar. Este vaso deberá estar contenido en otro vaso precipitado de 500 ml que contenga hielo.
4. Añadir 1 ml de detergente (shampoo en solución fría) y remover suavemente con la varilla
de vidrio, mezclando, y evitando la formación de espuma. Repetir el procedimiento 3 veces
dejando reposar un minuto cada vez. Si de forma espuma retirarla con la pipeta pasteur.
Trasvasar el material contenido en el vaso precipitado de 50 ml a un tubo de ensayo
grande.
5. Añadir 10 ml de alcohol frio, inclinando el tubo de ensayo y dejando resbalar muy lentamente el alcohol por la pared, para formar una capa sobre la solución. Dejar reposar, no mover, evitando que se mezclen ambas soluciones. Porque?
6. El ADN aparecerá poco a poco lentamente en la interfase de agua-alcohol en forma de grumos blancos. Se favorece la precipitación y recolección así se va recogiendo mediante la varilla de vidrio o un hisopo largo, introduciéndola lentamente bajo la interfase y haciéndola girar suavemente mientras se extrae. Así se conseguirá que se adhiera a la varilla unas hebras blancas, poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto, retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado.
7. Tomar una muestra de ADN, depositarlo sobre un portaobjetos y teñir con azul de metileno durante 3 minutos. Secar la lámina y observarla al microscopio. Describir la muestra al microscopio.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
25
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INFORME DEL LABORATORIO Nº 2
RECONOCIMIENTO DE BIOMOLECULAS
1. Resumen (1p)
Nombre del alumno (Apellidos, Nombre)
Pre informe (4 p)
Informe (12 p)
Desempeño (4 p)
Nota
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
26
2. Objetivos específicos (1p)
3. Datos y observaciones experimentales (4 p)
Experimento: EXTRACCION DE ADN ANIMAL
3.1 Triturar una porción de hígado de pollo (20 grs) con 50 ml de agua destilada fría
en un mortero, añadir 1 gramo de arena fina, seguir homogenizando.
3.2 Filtrar 1 vez el homogenizado en una gasa contenido sobre un embudo en la
probeta de 50 ml, para obtener la “suspensión”.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
27
3.3 En un vaso precipitado de 50 ml colocar 5 ml de la suspensión, adicionar 5 ml de
NaCl 2M frio y agitar. Este vaso deberá estar contenido en otro vaso precipitado
de 500 ml que contenga hielo.
3.4 Añadir 1 ml de detergente (shampoo en solución fría) y remover suavemente con
la varilla de vidrio, mezclando, y evitando la formación de espuma. Repetir el
procedimiento 3 veces dejando reposar un minuto cada vez. Si de forma espuma
retirarla con la pipeta pasteur. (Trasvasar el material contenido en el vaso
precipitado de 50 ml a un tubo de ensayo grande)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
28
3.5 Añadir 10 ml de alcohol frio, inclinando el tubo de ensayo y dejando resbalar muy
lentamente el alcohol por la pared, para formar una capa sobre la solución. Dejar
reposar, no mover, evitando que se mezclen ambas soluciones. Porque?
3.6 El ADN aparecerá poco a poco lentamente en la interfase de agua-alcohol en
forma de grumos blancos. Se favorece la precipitación y recolección así se va
recogiendo mediante la varilla de vidrio o un hisopo largo, introduciéndola
lentamente bajo la interfase y haciéndola girar suavemente mientras se extrae.
Así se conseguirá que se adhiera a la varilla unas hebras blancas, poco a poco
se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto,
retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará
adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
29
3.7 Tomar una muestra de ADN, depositarlo sobre un portaobjetos y teñir con azul
de metileno durante 3 minutos. Secar la lámina y observarla al microscopio.
Describir la muestra al microscopio.
4. Discusión de observaciones, datos y resultados (3 p)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
30
5. Conclusiones (2 p)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
31
6. Cuestionario (1.5 p)
a. Explique, cómo se puede determinar la concentración del ADN. b. Presente un diagrama de flujo de la extracción de ADN en una muestra de sangre, piel o cabellos? c. ¿Cómo se puede preservar el ADN después de haberlo extraído? d. ¿Cuál es la diferencia de extraer ADN animal, vegetal y bacteriano? (señalarlas) e. ¿Cuál es la importancia de estudiar el ADN en muestras arqueológicas? Y en la actualidad?
7. Bibliografía (0.5 p)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
32
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA BIOLOGÍA (CH 061)
PREINFORME DEL LABORATORIO Nº 3
AMILASA SALIVAL
Nombre del Alumno: Calificación
Grupo:
Fecha:
Recuerde que el PREINFORME debe de entregarlo de manera individual, el día de realización del laboratorio,
se presenta en hojas A4 bond, que tiene un peso máximo de 4 ptos. sobre la nota del Laboratorio.
1. Realice el DIAGRAMA DE FLUJO del experimento a desarrollar: PROCEDIMIENTO
Es el plan ordenado de la forma en que se realizó la práctica para lograr el objetivo de la
misma. (2 puntos)
Ejemplo:
Se indica el proceso (…Se adiciona… se separa)
2. Cuestionario:
a. ¿Qué es la amilasa salival?, ¿Cuál es su función?
b. ¿Cuáles son las propiedades de las enzimas?
c. ¿Qué es anabolismo?
d. ¿Qué es catabolismo?
3. Bibliografía: cite correctamente la bibliografía consultada
A
B
C
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
33
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA BIOLOGÍA (CH 061)
GUIA DE LABORATORIO Nº 3
AMILASA SALIVAL
INTRODUCCIÓN
Propiedades del almidón.
El almidón es el polisacárido de reserva más abundante en vegetales y constituye la principal
fuente de nutrición glucídica para la humanidad. Los almidones están constituidos por una
mezcla de dos componentes:
a-amilosa: cadena lineal de unas 200 unidades de D-glucosa unidas por enlaces α(1-4)
amilopectina: cadena lineal de D-glucosas unidas por enlaces tipo α (1-4) con numerosas
ramificaciones α (1-6). El polímero contiene unas 1000 unidades de glucosa.
La proporción en que se mezclan la a-amilosa y la amilopectina para formar el almidón
depende de la especie vegetal en que aparece el almidón. La α -amilosa se disuelve fácilmente
en agua, adquiriendo una estructura secundaria característica, de forma helicoidal, en la que
cada vuelta de hélice comprende seis unidades glucosa.
Esta estructura secundaria, en la que los grupos hidroxilo que dan hacia afuera, permite que el
iodo, al penetrar en el interior del helicoide, confiera a la disolución una coloración azul violácea
intensa característica que permite la identificación positiva de trazas de almidón. Como esta
coloración no es resultado de ninguna interacción covalente, el calentamiento origina la
desestabilización del helicoide y la pérdida de color, que se recupera al enfriar lentamente la
disolución. La variación en el pH tiene un efecto análogo.
Estructura repetitiva de la amilosa.
Hidrólisis del almidón.
El almidón puede hidrolizarse por medios químicos o enzimáticos. La ebullición con ácidos o
álcalis hidroliza aleatoriamente los enlaces glucosídicos entre unidades de glucosa, dando
polisacáridos de longitud intermedia denominados dextrinas, cada vez menores hasta la
obtención de unidades de glucosa individuales.
Los compuestos que se obtienen en la hidrólisis del almidón y el color que producen con el iodo
son los siguientes:
Almidón (azul).
Amilodextrinas (violeta).
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
34
Eritrodextrinas (rojo).
Acrodextrinas (incoloro*).
Maltosa (incoloro*).
Glucosa (incoloro*).
* Tener en cuenta el ligero color amarillo propio del iodo.
El almidón también puede hidrolizarse enzimáticamente.
Uno de los enzimas que hidrolizan el almidón es la amilasa, que se halla presente en el jugo
pancreático y la saliva. Este enzima ataca al azar los enlaces α(1-4) del interior de la cadena.
Así, rinde finalmente unidades de glucosa libre y maltosa. La amilasa no ataca los enlaces
α(1-6), base de las ramificaciones de la amilopectina.
Estos enlaces pueden ser hidrolizados por otro enzima desramificador. La ptialina o amilasa
salival es una proteína enzimática presente en la saliva. Como todo enzima, la acción que
ejerce sobre su sustrato (almidón) depende de una serie de parámetros: pH, temperatura,
concentración de enzima...
OBJETIVOS
Ver el efecto del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática.
Ver el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
COMPARAR y DISCUTIR los resultados de la actividad de la amilasa a los diferentes
pH. Deducir el pH en el cual la enzima es más activa.
PROCEDIMIENTO
I. OBTENCIÓN DEL ENZIMA.
1. Tras enjuagar la boca, se mastica un trozo de papel de filtro para estimular la salivación. Los
líquidos segregados se van pasando a un embudo con un filtro humedecido colocado sobre un
tubo de ensayo, hasta recoger la suficiente cantidad de saliva para realizar la práctica.
2. La saliva así obtenida se diluye 1:10 con agua destilada, obteniendo así la preparación de
enzima base.
II. EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD AMILASA SALIVAL.
1. Tomar tres tubos de ensayo y añadir respectivamente:
1 2 3
ClH 0.1 N 2 ml NaOH 0.1 N 2 ml Agua destilada 2 ml
Almidón 2% 2 ml Almidón 2% 2 ml Almidón 2% 2 ml
Saliva diluida 1:10 2 ml Saliva diluida 1:10 2 ml Saliva diluida 1:10 2 ml
2. Agitar bien y medir rápidamente el pH de cada tubo. Para medir el pH, se toma una gota de
la disolución con una varilla limpia y seca y se humedece con ella un trocito de papel
indicador de pH, comparando el color obtenido con el de la escala.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
35
Los tres tubos se colocan en un baño de agua termostatizado a 37ºC durante 15minutos,
dejando que la amilasa vaya hidrolizando al almidón. Una vez transcurridos los 15 minutos,
se sacan los tubos y se efectúan las pruebas del iodo y de Benedict
Prueba del iodo o del lugol: permite identificar la presencia de almidón que con este reactivo
da un color azul-violeta característico. Tomar 1 ml de muestra de cada uno delos tubos y
añadirle unas gotas de la disolución de iodo iodurada. Si la actividad enzimática de la
amilasa no se ve afectada, catalizará la hidrólisis del almidón y por tanto la prueba del iodo
será negativa.
Prueba de Benedict: permite identificar a los azúcares reductores, obtenidos por hidrólisis del
almidón, que con esta prueba dan una coloración rojiza (el almidón no tiene poder reductor).
Tomar 1 ml de muestra de cada uno de los tubos y seguir el protocolo para la reacción de
Benedict en la práctica de azúcares.
III. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA VELOCIDAD ENZIMÁTICA.
1. Preparar 8 tubos: cuatro de ellos con 2ml de almidón 2% y los otros cuatro con 2 ml de
saliva diluida 1:10.
2. Colocar dos tubos, uno conteniendo almidón y la otra saliva, a cada una de las cuatro
temperaturas siguientes (marcar cada pareja de tubos según la temperatura a la que se
ensaya):
en baño de hielo (OºC, si se añade un poco de agua al hielo enfría más;
cuidar que los tubos no vuelquen)
a temperatura ambiente (20ºC)
en baño a 37ºC
a ebullición en baño María* (100ºC).
3. Mantener así los tubos durante 15 minutos para que alcancen la temperatura del
experimento.
4. Añadir al tubo que contiene el almidón el contenido del tubo que tiene la saliva, agitar bien y
dejar que siga a su temperatura correspondiente. Empezar a contar el tiempo (los tubos
deben mantenerse bien inmersos en los respectivos baños para que la acción de la amilasa
tenga lugar a las temperaturas indicadas).
Transcurridos 0, 2, 4, 6 y 8 minutos coger una muestra de 0,5 ml de cada tubo y ponerla en
la placa de pocillos.
* En el caso del baño María basta con 5 minutos.
5. Añadir a cada muestra unas gotas de reactivo de iodo. Una vez realizada la prueba
ANALICE los distintos cambios de color observados y la razón de estos.
Cuando el almidón está hidrolizado no produce ningún cambio de color a la solución de iodo
(punto acromático). El tiempo necesario para alcanzar tal punto da idea de la actividad de la
enzima. La inversa de dicho tiempo equivale a la velocidad de la reacción enzimática.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
36
UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA
BIOLOGÍA (CH 061)
INFORME DEL LABORATORIO Nº 3
AMILASA SALIVAL
1. Resumen (1p)
Nombre del alumno (Apellidos, Nombre)
Pre informe (4 p)
Informe (12 p)
Desempeño (4 p)
Nota
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
37
2. Objetivos específicos (1p)
3. Datos y observaciones experimentales (3 p)
Experimento II: EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD AMILASA SALIVAL
Tabla N°1 Resultados del efecto del pH sobre la actividad
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
pH
Prueba de Lugol
Benedict
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
38
Experimento II: EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD AMILASA SALIVAL
Tabla N°2 Resultados de la temperatura óptima para la actividad de la enzima
0º C Ambiente:
º C 37º C 100º C
0´
1´
2´
4´
6´
8´
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
39
4. Discusión de observaciones, datos y resultados (3 p)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
40
5. Conclusiones (2 p)
6. Cuestionario (1.5 p) a. ¿Qué es y qué hace un enzima?
b. El enzima empleado en esta práctica se denomina:
c. Su sustrato es:
d. ¿Cuáles son las funciones de la enzima trabajada?
e. ¿Cuál es la estructura molecular de la enzima trabajada?
f. ¿Qué reactivo se emplea para la identificación del almidón? Explicar
brevemente como actúa.
7. Bibliografía (0.5 p)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
41
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FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA
BIOLOGÍA (CH 061)
PREINFORME DEL LABORATORIO Nº 4
CONTROL MICROBIOLOGICO AMBIENTAL
Recuerde que el PREINFORME debe de entregarlo de manera individual, el día de realización
del laboratorio, se presenta en hojas A4 bond, que tiene un peso máximo de 4 ptos. sobre la
nota del Laboratorio.
1. Realice el DIAGRAMA DE FLUJO del experimento a desarrollar: PROCEDIMIENTO
Es el plan ordenado de la forma en que se realizó la práctica para lograr el objetivo de la
misma. (2 puntos)
Ejemplo:
Se indica el proceso (…Se adiciona… se separa)
2. Cuestionario:
a. Defina las 11 siguientes palabras: hongo, levadura, colonia, micelio, hifas, esporas,
cepa, agar, microbiota, aerobiosis, unidades formadoras de colonias (UFC)
b. ¿Cuál es la composición del agar Sabouraud?
c. ¿En qué condiciones se favorece el crecimiento de hongos?
3. Bibliografía: cite correctamente la bibliografía consultada
REVISAR: Referencias Bibliografías al estilo Vancouver, en:
http://www.unap.cl/p4_biblio/docs/Normas_VANCOUVER.pdf
A
B
C
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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GUIA DE LABORATORIO Nº 4
CONTROL MICROBIOLOGICO AMBIENTAL
INTRODUCCION
Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en el agua,
en la superficie de los objetos e incluso sobre nuestra piel. La evaluación de la calidad
microbiológica del ambiente nos indica la cantidad de microorganismos que están presentes en
un área determinada. Los microorganismos generalmente no están flotando en el aire sino que
se encuentran sobre partículas inertes, por ejemplo polvo, gotas de agua, etc. que le sirven
como medio de transporte, las cuales pueden depositarse sobre las superficies; es por ello que
mientras más limpia es un área, menor será el número de microorganismos presentes en el
aire de la misma.
Cuando se trabaja en microbiología de alimentos es importante determinar el grado de
contaminación ambiental. Las condiciones higiénicas del lugar de trabajo (utensilios,
superficies, etc.) y del propio manipulador van a depender en parte el número y tipo
de microorganismos del alimento.
Análisis del aire: El aire, además de partículas en suspensión, es portador de bacterias o sus
esporas. Por ello puede ser causa tanto de contaminación de alimentos y superficies como de
infecciones en el hombre (patologías respiratorias, etc.). Existen diferentes métodos que
permiten evaluar la calidad microbiológica del aire.
Técnica: Sedimentación en placa
La técnica de sedimentación por gravedad permite determinar la carga microbiana de un
ambiente problema. Este tipo de control es característico de la evaluación de la calidad
microbiológica de zonas estériles en la industria alimentaria, farmacéutica y en estudios de la
microbiota en ambientes naturales. Esta técnica consiste en exponer placas con un medio
nutritivo sólido al ambiente durante un periodo determinado, los microorganismos suspendidos
en el polvo o aerosoles sedimentan sobre la superficie de este medio.
Pasado el tiempo de toma de muestra ambiental, la placa debe mantenerse cerrada y se
incubara en las condiciones que favorezcan el tipo de microorganismos que deseemos
estudiar, en temperatura ambiente y en aerobiosis, pues estas son las condiciones que
prefieren los microorganismos ambientales.
OBJETIVO
Evaluar la calidad microbiológica del aire de un área determinada.
Caracterizar (macroscópicamente) y contabilizar las colonias fúngicas.
Observar microscópicamente la diversidad de colonias fúngicas.
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
43
MATERIALES Y REACTIVOS
Muestras: HONGOS
Lugar de muestreo: lugares seleccionados en la facultad (indicados en la placa Petri).
Placa Petri con medio de cultivo: agar Sabouraud (libre de microorganismos).
Asas de siembra, laminas portaobjetos, lamina cubreobjetos, azul de lactofenol, microscopio.
PROCEDIMIENTO
1. Destapar 1 placa de agar Sabouraud, durante 30 minutos en el lugar cuyo nivel de
contaminación se desee examinar, lugar seleccionado e indicado en la placa.
2. Tapar la placa y encintar con parafilm
3. Incubar durante 48 horas, a 25 ± 2 ºC.
4. Efectuar la observación y calcular el número de microorganismos que caen por cm2
durante 1 minuto.
5. Realizar una caracterización de los hongos que han crecido en las placas (diferenciar: la
colonia: color, volumen (elevada o plana), estructura (algodonosa o costrosa), filamentos
(presencia o ausencia), tamaño…
6. Preparación de una muestra sobre la lámina portaobjetos: colocar una tira de cinta
adhesiva sobre el micelio, con el fin de que las hifas y las esporas queden adheridas a ella.
Se coloca una gota de: azul de lactofenol y sobre ella se coloca la cinta adhesiva, para
luego observarla al microscopio.
7. Identificar el tipo de hongo (ver el anexo).
GRUPO TIEMPO DE EXPOSICION 15 MINUTOS
LUGAR DE EXPOSICION DE LA PLACA
1 Aula de clases R1-125
2 Aula de clases del cuarto piso
3 Laboratorio 33
4 Sala de computo
5 Biblioteca
6 Baño de damas
7 Baño de caballeros
8 Pasillo del segundo piso (escuelas)
9 Pasillo del tercer piso (of. profesores)
10 Pasillo del cuarto piso (aulas)
CALCULO DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS POR CM2
Para calcular la cantidad de microorganismos que cayeron en la placa por unidad de tiempo:
Contar el número de colonias en la placa. Este número se expresa como ufc (unidades formadoras de colonias), ya que varios microorganismos podrían estar juntos y al multiplicarse sólo se verá una colonia.
Calcular el área de la placa (A): A = πr2
Para una placa de 9 cm de diámetro el área es: A = 3,14 x 4,52 cm2 = 63,62 cm
2
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
44
Calcular el número de microorganismos que caen en el área por unidad de tiempo. Se puede expresar en: ufc/ placa/min; ufc/ cm
2/min; ufc/área total/min.
Ejemplo Se expone una placa de 9 cm de diámetro en un área durante 30 minutos. Se incuba 24 horas a 32,5 +/- 2°C y se cuentan 25 colonias. Calcular el número de: ufc/placa/min y ufc/cm
2/min.
Calculo: 25 ufc………….30 min
X ……………. 1 min X = 0,833 ufc/placa/min
Si deseamos expresar los valores en ufc/cm2/min
0,833 ufc……….63,62 cm2
X………….. 1 cm2
X = 0,0131 ufc/cm2/min
Es importante asegurarse al momento de comparar los resultados,
que éstos estén expresados en los mismos parámetros
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
45
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FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA
BIOLOGÍA (CH 061)
INFORME DEL LABORATORIO Nº 4
CONTROL MICROBIOLOGICO AMBIENTAL
1. Resumen (1p)
Nombre del alumno (Apellidos, Nombre)
Pre informe (4 p)
Informe (12 p)
Desempeño (4 p)
Nota
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
46
2. Objetivos específicos (1p)
3. Datos y observaciones experimentales (3 p)
Tabla N°1 Datos del estudio
DATOS
Área evaluada
Fecha
Tiempo de exposición
Tabla N°2 Resultados del N° de microorganismos por cm2 a las 24 horas
DATOS N° de UFC/cm2
Numero de microorganismos
Numero de Hongos
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
47
Tabla N°3 Resultados del N° de microorganismos por cm2 a las 24 horas
GRUPO
TIEMPO DE EXPOSICION 30 MINUTOS
LUGAR DE EXPOSICION DE LA
PLACA
N° de UFC
microorganismos
por cm2
N° de UFC
Hongos
por cm2
1 Aula de clases R1-125
2 Aula de clases del cuarto piso
3 Laboratorio 33
4 Sala de computo
5 Biblioteca
6 Baño de damas
7 Baño de caballeros
8 Pasillo del segundo piso (escuelas)
9 Pasillo del tercer piso (of. profesores)
10 Pasillo del cuarto piso (aulas)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
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4. Discusión de observaciones, datos y resultados (3 p)
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
49
5. Conclusiones (2 p)
6. Cuestionario (1.5 p) a. ¿Qué es esterilidad microbiológica? b. Explique la esterilización de calor seco y calor húmedo. Para que se emplea cada
uno. c. ¿Qué son los medios de cultivo? d. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo? e. ¿Cómo se reproducen los hongos? f. ¿Es importante el control microbiológico de los ambientes?
7. Bibliografía (0.5 p)
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ANEXO 4
CONTROL MICROBIOLOGICO AMBIENTAL
GUIA DE LOS PRINCIPALES HONGOS AMBIENTALES
Figura N° 1. Control microbiológico ambiental
Aspecto típico de una placa de sedimentación mostrando
la diversidad microbiana de un ambientes
Figura N° 2. Estructura de un hongo microscópico
Hifas
Manual de Prácticas: Laboratorio de Biología
51
Figura N° 3. Aspergillus tiene cerca de 200 sp.; A. niger; A. fumigatus…
Figura N° 4. Penicillium sp. 150 sp. ; P. notatum; P. chrysogenum, P. funiculosum…
Figura N° 5. Rhizopus nigricans Figura N° 6. Fusarium sp. Figura N° 7. Cladosporium sp.