Precipitación

Procesos de Bioseparación

Guillermo Garibay Benítez

Generalidades La precipitación es un método importante de

purificación de proteínas y ácidos nucleicos.

En bioseparaciones la precipitación implica la conversión selectiva de un componente específico disuelto en una mezcla compleja a una forma insoluble utilizando métodos físicos o físico-químicos.

La forma insoluble es obtenida como un precipitado (normalmente un sólido sencillo de precipitar) el cual es separado de los componentes disueltos por técnicas de separación sólido-líquido como la centrifugación.

Factores utilizados para la precipitación de macromoléculas biológicas

1. Enfriamiento2. Ajuste de pH3. Adición de solventes tales como acetona y

etanol4. Adición de sales anti-caotrópicas como

sulfato de amonio y/o sodio sulfato5. Adición de sales caotrópicas tales como

guanidina hidrocloruro y/o urea6. Adición de reactivos bioespecíficos como en

la inmunoprecipitaciónAgente Caotrópico: sustancia que aumenta la solubilidad en agua de las sustancias no polares y por ende tiende a desnaturalizar las proteínas (Voet D. et al, 2 edición, 2009, Fundamentos de Bioquímica: la vida a nivel molecular)

Efecto de la temperatura en la solubilidad de proteínas

Perfiles de solubilidad de dos proteínas (A y B)

Efecto del pH en la solubilidad de proteínas

Las sales anti-caotrópicas tales como el sulfato de amonio y el sulfato de sodio, exponen las zonas hidrófobas de las proteínas, removiendo la capa de agua que cubre estas zonas en solución.

Como resultado los residuos hidrófobos de una proteína pueden interactuar con otros residuos que formaran agregados y se precipitaran.

Las sales pueden reducir la solubilidad de las proteínas cubriendo los grupos cargados, los cuales mantienen a las proteínas aparte en la solución.

Cuando las cargas electroestáticas de las moléculas de proteína son cubiertas, las moléculas interactúan entre ellas, forman precipitados y precipitan.

Precipitación de proteína utilizando un agente anti-caotrópico

Las tres sales más comúnmente utilizadas en precipitación son: sulfato de amonio [(NH4)2SO4,] sulfato de sodio (Na2SO4) y cloruro de sodio (NaCl).

Algunas sales caotrópicas: urea, guanidina hidrocloruro

Estas sales actúan rompiendo enlaces de hidrogéno intra-moleculares e interacciones hidrofóbicas en proteínas.

Se utilizan principalmente para replegamiento de proteínas, particularmente en el procesamiento de cuerpos de inclusión.

Las sales caotrópicas se utilizan en purificación de ADN y ARN ya que precipitan proteínas pero dejan a los ácidos nucleicos sin afectar

Precipitación utilizando solventes orgánicos Los solventes orgánicos precipitan proteínas y otras

macromoléculas reduciendo la constante dieléctrica del medio en el cual están presentes. La ecuación para precipitación de proteínas por solventes es:

Donde: S = solubilidad de la proteína (Kg-mol/m3) Sw = solubilidad de la proteína en agua (Kg-mol/m3) A = una constante e = constante dieléctrica del medio (-) ew = constante dieléctrica del agua (-)

Constante dieléctrica del agua a 25° (ew) = 78 Constante dieléctrica del etanol a 25° = 24.3

Una proteína tendrá menor solubilidad en una mezcla etanol-agua que el agua por si sola

Ejemplo La solubilidad de ovoalbumina en agua es de

390 kg/m3. Cuando 30 mL de etanol son añadidos a 100 mL de una solución de ovoalbumina en agua a 50 mg/mL, se encuentra que 33% de la proteína precipita. ¿Cuanta proteína precipitara si 100 mL de etanol son añadidos a 100 mL de una solución similar de proteína a la misma temperatura? Asuma que la constante dieléctrica del medio varia linealmente con la composición volumétrica de los dos solventes.

Bibliografía Raja Ghosh, Principles of Bioseparations

Engineering, World Scientific, (2006), ISBN 981-256-892-1