“PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO PARA BIOQUÍMICAS E

IDENTIFICACION DE LOS GRUPOS BACTERIANOS”

GRUPOS BACTERIANOS:Los principales grupos bacterianos son los

siguientes:

• Las clamidias: son bacterias de crecimiento intracelular obligado. Su diámetro es de 250 a 500 nm, y a diferencia de los virus poseen ADN y ribosomas que les permiten sintetizar sus propias proteínas. Las especies de Clamidias que producen patología en el ser humano son Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae y su asociación es con enfermedades de transmisión sexual, infecciones respiratorias y enfermedad ocular.

• Las rickettsias: son pequeñas bacterias pleomórficas que se comportan como parásitos intracelulares obligados, se mantienen en la naturaleza mediante un ciclo que incluye mamíferos como reservorios e insectos como vectores y tienen una distribución geográfica irregular, causando enfermedad cuando se producen las adecuadas circunstancias de proximidad a los animales reservorios o de pobreza y hacinamiento. La rickettsias pueden afectar a todo tipo de pacientes, por tanto, no son patógenos oportunistas, y, salvo Coxiellaburnetti, todas ellas producen vasculitis y lesiones en la piel, pudiendo ser descartadas cuando éstas no existen.

• Los micoplasmas: son los microorganismos más pequeños capaces de una existencia independiente, representando la forma de vida libre más pequeña. A diferencia del resto de las bacterias, carecen de pared celular y su membrana es rica en esteroles. Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis y Ureaplasmaurealyticum son los patógenos más frecuentes en el hombre, y han de ser considerados fundamentalmente en síndromes respiratorios y en patología de transmisión sexual.

• Las espiroquetas: son microorganismos pertenecientes a la familia Treponemataceae, bacterias helicoidales cuyos géneros más significativos son Leptospira, Treponema y Borrelia. Pueden afectar a sujetos previamente sanos, y sólo en determinados contextos debemos pensar en ellas.

• Las bacterias clásicas o eubacterias: constituyen una de las causas más importantes de infección. Debe pensarse en enfermedad bacteriana prácticamente en casi todo tipo de infección, pero muy especialmente ante cuadros agudos y de rápida evolución. Las infecciones bacterianas pueden ser atribuibles fundamentalmente a bacterias grampositivas y a bacterias gramnegativas.

• Bacterias altas: Este grupo de bacterias formado por los géneros Nocardia, Mycobacterium y Actynomices tienen como propiedad más característica su ácido-alcohol resistencia y la tendencia a producir cuadros clínicos de instauración lenta e insidiosa caracterizados por la producción de lesiones granulomatosas con tendencia a la cavitación y a la fistulización. La nocardiosis y la tuberculosis pueden afectar tanto a pacientes sanos como a inmunodeprimidos, y tienen una preferencia por la participación respiratoria.

PRUEBAS BIOQUIMICAS:• Las pruebas bioquímicas son una serie de

análisis clínicos que sirven a la Medicina como apoyo a la hora de diagnosticar infecciones por bacterias. Consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

PRUEBAS IMVIC:• Se compone de cuatro pruebas; su finalidad es

identificar un organismo del grupo de los coliformes. La presencia de estos indica contaminación fecal.

• Agar Citrato.- La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio; es una prueba útil en la identificación de enterobacterias.

• Indol.- La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. La prueba estudia la capacidad de degradar el triptófano con producción de Indol y metabolitosindólicos.

• Rojo Metilo.- Estudia la fermentación ácido mixta con producción de ácidos estables en el tiempo. Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

• Vogues Proskauer.- Se determina la vía de fermentación descrita en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.

AGAR CITRATO DE SIMMONS:

PRUEBA DE CITRATO• Principio: Esta prueba sirve para determinar

si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.

• Objetivo: El citrato es parte del grupo de pruebas indol- rojo de metilo- voges-proskauer-citrato (IMViC)para la identificación de la familia Enterobacteriaceae, de microorganismos gramnegativos relacionados y de bacterias no fermentadoras.

• Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter, arizona y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi, listeria son incapaces de crecer con esos nutrientes.

PROCEDIMIENTO Preparación del medio( Agar citrato de

simmons): En un matraz erlenmeyer medir 100 ml de agua purificada y agregar 2.24g del medio. Poner tapón de algodón envuelto en gasa y dejar rehidratar por 15 minutos.

• Calentar hasta su punto de ebullición sin dejar de agitar.

• Dejar enfriar sin solidificación.

• Depositar 3ml del medio en un tubo de ensaye

• Meter al autoclave a 121°C( 15 libras de presión) durante 15 minutos.

• Dejar que el medio solidifique en posición inclinada.

Cultivar un microorganismo en el agar. Crecimiento a partir de un cultivo puro de 18 a 24 horas en agar con hierro de Kliglert u otra medio adecuado; no se recomiendan las suspensiones en caldo.

Los cultivos se incuban hasta por 4 días a temperatura de 35 a 37°C

• incubadora es un dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora mantiene la temperatura, la humedad y otras condiciones en grado óptimo

INTERPRETACIÓN• Positivo (+): Crecimiento con un intenso

color azul en el pico de flauta.

• Negativo (-): Los microorganismos no crecen y el medio conserva su color verde.

• Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

AGAR DE HIERRO KLIGLER

USO:• El Agar Hierro de Kligler es un medio

empleado para la diferenciación de cultivos puros de bacilos Gram negativos en base a su capacidad para fermentar la dextrosa y la lactosa y a la producción de sulfuro de hidrógeno.

PREPARACIÓN:• Suspender 52 g del medio en un litro de

agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto.

• Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar en posición inclinada.

PROCEDIMIENTO:• 1. Tomar una colonia bien aislada a partir de

un medio sólido.

• 2. Inocular los tubos inicialmente por picadura en el fondo del tubo (de 3 a 5 mm) y posteriormente por estría en la superficie.

• 3. Incubar los tubos con las tapas flojas a 35-37°C durante 18 a 48 horas.

• 4. Leer los tubos para la producción de ácido en el fondo y la superficie, así como la producción de gas y sulfuro de hidrógeno.

SIEMBRA:• Este medio se siembra a partir de un

cultivo puro. Debe sembrarse tanto por estría en la superficie inclinada como por picadura en la columna vertical. Se recomienda utilizar tubos con tapones que permitan el acceso del aire o si son roscados dejarlos flojos ya que si no se dificulta la reoxidación del indicador. Este medio no permite la diferenciación entre los organismos de los géneros Salmonella, Shigella y Proteus.

RESULTADOS:• 1. Una superficie alcalina y un fondo ácido

(rojo/amarillo) indica fermentación solo de la dextrosa.

• 2. Una superficie y fondo ácido (amarillo/amarillo) indica la fermentación de dextrosa y lactosa.

• 3. Una superficie y fondo alcalino (rojo/rojo) indica que no hubo fermentación de ninguno de los carbohidratos.

• 4. La presencia de burbujas o fracturas en el medio indica la producción de gas.

• 5. La presencia de un precipitado negro indica la producción de sulfuro de hidrógeno.

PRIMEROS AUXILIOS:Ojos Lavar el ojo con abundante agua.

Obtenga atención médica si el dolor o enrojecimiento persisten.

Piel Lave la piel con agua y jabón.

Ingestión Lave la boca con agua. Haga que la persona afectada beba 1-3 vasosde agua para diluir lo digerido.

Inhalación Retire de la exposición. Si no se siente bien consulte a un médico.

MEDIO MIO:

MEDIO MIO

Medio usado para la identificación de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina

decarboxilasa y producción de indol.

PREPARACIÓN:Formula(en gramos por

litro):

Dextrosa 1.0

Extracto de levadura 3.0

Peptona 10.0

Tripteina 10.0

Clorhidrato de L-ornitina 5.0

Agarm2.0

Purpura de bromocresol 0.02

Suspender 31g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicionhasta completa disolucion. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121 C

pH final: 6.5 0.2

CARACTERÍSTICAS:• Medio de cultivo semisólido, altamente nutritivo

debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y tripteína. Además, la tripteínaaporta grandes cantidades de triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realización de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la detección de la enzima ornitina decarboxilasa, el púrpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color púrpura y en medio ácido es amarillo. Por su composición, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.

• La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas allá de la línea de inoculación

• La reacción positiva a la ornitina está dada por un color púrpura del medio. Debido a la fermentación de la glucosa se reduce el pH produciendo una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresolvire al amarillo

• El indol, es producido a partir del triptofanopor los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa

RESULTADOS1-Movilidad:

-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de lalínea de siembra.-Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.

2-Ornitina decarboxilasa:

-Resultado positivo: color púrpura.-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un colorvioláceo en la superficie del medio.

3-Prueba del indol:

La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad yla prueba de ornitina.-Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

Características del medio

Medio preparado: púrpura transparente a ligeramente opalescente

MEDIO SIM

MEDIO SIM:• Este medio se utiliza para comprobar la

motilidad, la formación de H2S y la producción de indol por parte de la bacteria.

• Prueba: Aminoácidos, enzimas y proteínas.

• 1.Determinar si la bacteria a través de Triptofanasas puede degradar el Triptófano a indol.

• 2. Determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos azufrados

• 3. Determinar si la bacteria es móvil.

PREPARACIÓN: Medir 100ml de agua destilada en un matraz Erlenmeyer y agregar 3g del medio. Tapar el matraz con algodón envuelto en gasa y dejar reposar de 10 a 15min.

Calentar agitando hasta su punto d ebullición y dejar enfriar.

Distribuir 4ml del medio en un tubo de ensaye y esterilizar en autoclave a 121° durante 15 minutos.

Dejar que el medio se solidifique en posición vertical.

SIEMBRA:A partir de un cultivo de 18 a 24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en línea recta.

Se incuba en un periodo de 24 horas a una temperatura de 37°.Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich.

MOTILIDADLa motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de la línea de inoculación.

La producción de H2S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento o del medio debido a la presencia del tiosulfato sódico.

Para la demostración del indol se usa el reactivo de Kovacs. Las cepas indol positivas: desarrollan un color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich. Las cepas indol negativas no tienen cambio de color.

Microorganismo Movilidad Indol Producción de ácido sulfhídrico

E. coli ATCC 25922 + + -

K. pneumoniae ATCC 700603

- - -

P. mirabilis ATCC 43071

+ - +

S. typhimurium ATCC 14028

+ - +

S. enteritidis ATCC 13076

+ - +

S. flexneri ATCC 12022

- - -

CALDO DE UREA:

USO:• Se emplea para la diferenciación de bacterias

por medio de la utilización de la urea como única fuente de carbono.

• Se utiliza solamente para la detección de la actividad de la ureasa en especies del género Proteus que dan la prueba positiva después de una incubación de 8 h. Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se consumen antes de que la bacteria muestre un crecimiento aceptable no podrá determinarse con exactitud su capacidad de hidrolizar la urea.

• Si un microorganismo es capaz de hidrolizar la urea, pero no de utilizar el amoníaco como fuente de nitrógeno, no se produce crecimiento y es posible observar un resultado falso negativo. No se recomienda para las bacterias con reacción de ureasa retardada.

• Sembrar el medio de cultivo con el cultivo puro de ensayo. Incubar 24 – 48 h a 35ºC.

PREPARACIÓN:• Rehidratar 3.87 g del medio en 100 ml de

agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Cuando se ha disuelto, esterilizar por filtración. Distribuir en tubos de ensayo en volúmenes de 0.5 a 2 ml. Es posible usar cantidades mayores, pero las reacciones son más lentas. Se puede esterilizar en autoclave de 5 a 8 libras de presión durante 15 minutos.

• ES IMPORTANTE PROTEGERLO DE LA LUZ. Conservar en refrigeración de 2º a 8º C.

CARACTERÍSTICAS• Color: Rosado

• Inhibidor: No tiene

• Indicador: Rojo de Fenol

• Sustrato Principal: Urea

• Sustrato Secundario: Extracto de levaduras, fosfato monopotasico y fosfato disódico.

• No se autoclava

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (BAAR).

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es unatécnica de tinción diferencial rápida yeconómica, para la identificación demicroorganismos patógenos, por ejemplo M.tuberculosis.

PROCEDIMIENTO:•Preparación del frotis

•Extensión de la muestra

•Fijación.

•Carbol fucsina

•Calentar hasta la emisión de vapor(Mantener el calor 10 minutos, evitar la ebullición y luego dejar enfriar).

•Lavar con agua

•Decoloración con alcohol ácido(Máximo 3 minutos y posteriormente lavar)

Tinción de contraste: azul de metileno (1 Minuto)

•Enjuagar.

•Secar

Resultado

TINCIÓN DE GRAM:

Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

TINCIÓN SIMPLE:Es una tinción sencilla en la cual la bacteriaes teñida con un solo reactivo. Es preferibleutilizar tintes básicos que contengan uncromógeno (compuesto que da color al tinte)con carga positiva, ya que la pared celular delas bacterias posee componentes con carganegativa que atraen y enlazan el cromógeno.

Esta tinción se utiliza para observar lamorfología y el crecimiento de las bacterias.

PROCEDIMIENTO