INSTITUTO TECNOLGICO DEL VALLE DE MORELIA CARRERA: INGENIERIA EN AGRONOMA ASIGNATURA: MICROBIOLOGA GRADO Y GRUPO: 34 ASESOR: PION FLORES JAIME ALUMNO: OSEGUERA HUERAMO FELIPE

INSTITUTO TECNOLGICO DEL VALLE DE MORELIA

CARRERA: INGENIERIA EN AGRONOMA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGA

TEMA: PREPARACIONES PARA MICROSCOPIA, TIPOS, TECNICAS Y PRESERVACIN.

2.2 Preparaciones para microscopa.En todos los microscopios, la calidad de imagen depende de tres factores.

El aumento es la amplificacin de un objeto.

El contraste es diferencia de la intensidad luminosa.

Una buena resolucin significa ser capaz de percibir dos puntos adyacentes de una imagen como separados uno del otro. El poder de resolucin de un microscopio se puede aumentar usando lentes de aumento de mayor tamao, iluminando el espcimen con una luz de menor longitud de onda, o usando aceite de inmersin.

PREPARACION Y TINCION DE LA MUESTRAAumentar la resolucin Acentuar caractersticas morfolgicasConservar la muestra

PREPARACION (FIJACION)En este proceso se fijan en su posicin las estructuras internas y externas de la clula.Mata al microorganismo y se fija al portaobjetosPor calor: Preservar morfologa general pero no las estructuras internas.Qumica: Proteger la sub-estructura fina y la morfologa de los microorganismos delicados.

Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.

La forma ms simple de preparar un microorganismo para un examen microscpico es hacer una preparacin en fresco o in vivo.

Una preparacin en fresco simple (entre porta y cubre) consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos, despus colocar el portaobjetos y el cubreobjetos.

El inconveniente de la observacin en fresco es que no permite aumentar el contraste de la preparacin.

Preparacin en gota pendiente: Se utiliza para la observacin in vivo .Consiste en depositar una gota de la suspensin microbiana en el cubreobjetos aprovechando la tensin superficial del agua, se gira el cubreobjetos cuidadosamente y se coloca sobre un portaobjetos excavado.La ventaja de esta ltima tcnica, es que la preparacin no se evapora y puede ser observada durante un tiempo ms largo.Si se desea, puede usarse parafina o vaselina en el cubreobjetos para hacer la muestra mas hermtica.

Los frotis.En ocasiones, la concentracin de clulas en una muestra puede ser muy elevada, o por su naturaleza encontrarse muy aglutinadas.

Para extenderlas sobre un portaobjetos y poderlas observar bien se preparan los frotis.

Para realizar un frotis, ya sea de sangre, suspensin celular, suspensin de cultivo bacteriano, etc.

Tcnica de la tincin de Gram.Gracias a esta tincin, veremos a las bacterias divididas en dos grupos, las Gram +, que aparecen con un intenso color morado debido al colorante violeta de genciana, y las Gram -, que parecen teidas de un dbil tono rosado debido al colorante safranina.

Esta diferenciacin es debida a que las Gram + quedan teidas por el violeta de genciana, sin perder el colorante en la decoloracin alcohlica.

Por el contrario, las Gram no han quedado teidas por el violeta de genciana y lo pierden en la decoloracin.

2.2.1 Tipos Un microscopio optico utiliza la luz visible como fuente de iluminacin. Posee dos sistemas de lentes; lente ocular y lente objetivo.

Los microscopios pticos compuestos estn provistos de varios objetivos:

Dbil seco: 10xFuerte seco: 40xObjetivo de inmersin: 100x

Un microscopio ptico ordinario produce un campo de iluminacin claro que pasa a travs del espcimen y se observa de forma brillante.

Un microscopio electrnico posee un poder de resolucin mayor al ptico.

El microscopio electrnico de transmisin (MET) utiliza un chorro de electrones en lugar de luz visible para definir el objeto.

Produce aumentos de 200 000x en comparacin con los 1000x para un microscopio ptico.

El microscopio electrnico de barrido (MEB) bombardea la superficie del espcimen con un rayo de electrones de tal manera que produce imgenes tridimensionales.

Las muestras para el MEB deben ser congeladas y desecadas al vaco y despus recubiertas con un metal pesado.

El MEB se utiliza generalmente para visualizar clulas enteras, pero la criofractura y el criograbado tambin permiten observar estructuras internas.

Comparativa de la composicin bsica de un microscopio ptico (izquierda), electrnico de transmisin (centro) y electrnico de barrido (derecha)

Microscopa ptica normal: El material a observar se colorea con colorantes especficos que aumentan el contraste y revelan detalles.

Microscopa de campo brillante: Se observa sin coloracin. La luz pasa directamente y se aprecian detalles naturalmente coloreados

Microscopa de campo oscuro: Produce una imagen iluminada del objeto sobre un fondo oscuro. Se emplea para observar organismos vivos en preparaciones sin teir.

Tipos de microscopa

Microscopia de fluorescencia: El contraste se aumenta por medio de la fluorescencia.

El microscopio debe modificarse con filtros especiales para iluminar la preparacin con luz ultravioleta de longitud de onda corta.

(Esta es la propiedad que tienen algunos materiales de absorber luz de una determinada longitud de onda y devolverla con una longitud de onda mayor).

Microscopa en contraste de fase: El contraste se debe a que los diferentes materiales absorben diferentes cantidades de luz.

Se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las clulas sin colorear.

Puede utilizarse con clulas vivas sin teir, es una buena tcnica para observar detalles pequeos y estudiar el movimiento celular.

Microscopa de Nomarsky; [microscopa diferencial de contraste de interferencia (DIC) ] : Proporciona contraste por interferencia, como lo hace el contrate de fases, pero produce una imagen semejante a las tridimensionales, con ms detalle. Se usa cuando el espcimen es muy grueso para usar contraste de fases.Utiliza dos rayos de luz polarizada, fue diseado para observar relieves de especmenes muy difciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilizacin in-vitro.

2.2.2 TcnicasTINCIONESLos colorantes son compuestos qumicos utilizados para aumentar el contraste. La mayora slo son efectivos si los microorganismos han sido fijados.Un mordiente es un compuesto que recubre la estructura para hacerla mas visible.

Colorantes bsicos: iones cargados positivamente

Colorantes cidos: iones cargador negativamente

Una tincin simple utiliza un solo colorante. Una tincin diferencial consta de dos etapas, una tincin primaria y una de contraste.

La tincin de Gram es diferencial y distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, debido a distintas superficies externas.

La tincin de acido-alcohol resistencia- o de Ziehl Neelsen- es diferencial y tie las micobacterias de rojo, mientras que las otras bacterias son teidas de azul por el colorante de contraste.

La tincin de Wirtz- Conklin tie las endosporas, estructuras de reposo de algunas bacterias.

La tincin de Leifson utiliza colorantes u mordientes para teir los flagelos, apndices filamentosos por la motilidad.

La tincin negativa se utiliza para observar la cpsula, una estructura protectora de algunas bacterias.2.2.3 PreservacinMantenimiento bajo capa de aceite

Simple y efectivaConsiste en cubrir el cultivo (medio slido) con una capa de aceite mineral o vaselina.Pueden conservarse por periodos de tiempo largos (varios aos) a temperatura ambiente.Pueden ocurrir mutaciones, luego de los 3 aos de mantenimiento.Desecacin:La eliminacin del agua (deshidratacin) es un mtodo de conservacin que reduce drsticamente el metabolismo.

No todos los microorganismos sobreviven a estos mtodos de secado, por lo que se hace necesario aadir agentes protectores (leche descremada, glutamato sdico al 10%).

Es importante mantener el producto sellado (tapn de rosca o ampolla) para evitar el contacto con el aire ya que son higroscpicos.

Soportes, se suelen utilizar:

ArenaSueloGel de slicaDiscos o tiras de papelAgarDiscos de gelatinaEstos deben ser previamente secados y esterilizados por calentamiento con aire caliente seco.Congelacin:Bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste se reduce el metabolismo drsticamente hasta el caso de prcticamente anularlo con nitrgeno lquido (-196C).

La formacin de cristales de hielo (pueden romper las clulas), para evitar esto se deben utilizar:

Suspensiones que contengan el mnimo de sales posibles

Agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfxido (DMSO al 10%) que neutralizan el efecto de las sales.

Algunos recomiendan una bajada gradual de temperatura (1C/min) hasta -20C para luego enfriar rpidamente. La descongelacin debe ser rpida.

Esquema de los eventos fsicos ocurridos en el congelamiento. (hexgonos representan cristales de hielo de diferente tamao segn la velocidad de enfriamiento). Adaptado de Ciba, 1977.Crioprotectores:

Glicerol 10%DimetilsulfxidoGlucosaDextranosSacarosaLactosaExtracto de malta

Liofilizacin:Es el mtodo ms utilizado por las colecciones internacionales de cultivos de microorganismos.

Consiste en congelar rpidamente una suspensin de microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua directamente del hielo sin pasar por el estado lquido.

El sistema requiere tres componentes:

Mecanismo de congelacinBomba de vacoUna trampa de agua.

Los microorganismos lifilizados se conservan entre 0y 5C durante muchos aos. Para su recuperacin se resuspenden los organismos en el medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura adecuada.

Algas y cianobacteriasLa mayor parte de los cultivos se han mantenido como subcultivos seriados a temperaturas entre 10y 15C.Para crecer estos cultivos se necesita luz, ya que son fotosintticos. Las algas no toleran bien la liofilizacin ni la desecacin.Con relacin a la congelacin los mejores resultados se obtienen con nitrgeno lquido.

BacteriasPrcticamente se han usado todos los mtodos conocidos con buenos y malos resultados, aunque en lneas generales el mejor mtodo es la liofilizacin debido a su facilidad de transporte.VirusSe han utilizado todos los mtodos, pero obteniendo en lneas generales baja estabilidad. Se recomienda para su conservacin durante largos perodos de tiempo el nitrgeno lquido.

La mayora de los hongos pueden conservarse por desecacin en suelo.

HongosBibliografaINGRAHAM, John L y Catherine, Introduccin a la Microbiologa, Editorial Revert, S.A. Barcelona, Espaa, 1998.

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica_preparaciones_microbiologicas_18855.pdf

http://ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursos-programados/2011/especifica/microscopia-optica/microscopia-optica-y-laser-confocal-2a-ed/tema-4.pdf

http://pagina.jccm.es/museociencias/otras%20actividades%20web/material%20cnr%20web/manual%20de%20microscopia.pdf

http://www.ipb.csic.es/servicios/Microscopia/uploads/3/6/2/2/3622788/microscopia_a_grandes_rasgos.pdf

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Practica2PreparacionesYtinciones_20836.pdf

http://facultad.bayamon.inter.edu/yserrano/microbiologia%20industrial/Metodospreservacionmicroorganismos2.pdf

http://iespoetaclaudio.centros.educa.jcyl.es/sitio/upload/manual_microscopio.pdf