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CINÉTICA ENZIMÁTICA
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
E + S SE E + P
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
• Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.
• Unidades del Metabolismo
• Regulan la vel. de las reac. quím. espontáneas (DG-).
• No promueven reacciones no-espontáneas (DG +).
• Incrementan la Vel. de reacción 103 a 1012 veces sin
afectar el sentido de la reacción.
• No forman parte del producto de la reacción.
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PROPIEDADES GENERALES• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
– De 106 to 1012 veces vs sin enzima.
– Aún más rápido que los catalizadores químicos.
• CONDICIONES DE REACCIÓN– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)
– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5
– Presión atmosférica normal
• CAPACIDAD DE REGULACIÓN– Por concentración de sustrato
– Por concentración de enzima
– Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)
– Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)
– Por regulación alostérica
• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN– Interacción estereoespecífica con el sustrato
– No hay productos colaterales
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
ALTA
ESPECIFICIDAD
DE REACCIÓN
INTERACCIÓNESTEREO
ESPECÍFICA CON SU
SUSTRATO
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Los Substratosse acercan a la Enzima
(sitio Activo)
Enzima
Substratos
HO-
H-
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Cambia la configuración de la enzima
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Los reactivos interaccionan
con la enzima (sitio activo)
La unión del sustrato produce un cambio conformacional
de la enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica.
Substrato
de glucosa
Sitio de enlace
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Se realiza la reacción
catalítica
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
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Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Actividad enzimática finales del siglo XIX.
En 1882: complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática.
En 1913: Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una
ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#mm
[ET] = [E] + [ES]
Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]
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Leonor Michelis y Maud Menten (1913)
Tiempo
Co
nc
en
t.
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E + S ESK1
K-1
ES E + PK2
K-2
[Et ] = Concentración de E total libre y combinada
[ES]
[Et ] – [ES] = Concentración de E libre
[S] normalmente > a [Et ] de tal forma [ES] es despreciable Vs [S]
1.- Vel. de formación ES = K1 ( [Et ] – [ES] ) [S]
La deducción comienza por considerar
las Velocidades de Formación y de Descomposición de ES
La velocidad de formación de ES a partir de E + P es muy pequeña y puede despreciarse
[ES]
[E] + [S]K1 =
K1 ( [E] + [S] ) = [ES]
2.- Vel. de descomposición de ES = K-1 [ES] + K2 [ES]
3.- Estado estacionario.
Vel. de formación de ES = vel. de descomposición. La [ES] se mantiene constánte
4.- Separación de las constantes de velocidad
K1 ( [Et ] – [ES] ) [S] = K-1 [ES] + K2 [ES]
K1 [Et ] [S] – K1 [ES] [S] = (K-1 + K2) [ES]
K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES]Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
K1 [Et ] [S] = K1 [ES] [S] + (K-1 + K2) [ES]
K1 [Et ] [S] = ( K1 [S] + (K-1 + K2) ) [ES] simplificando
K1 [Et ] [S]
K1 [S] + (K-1 + K2) [ES] =
5.- Definición de la velocidad inicial (Vo) en función de [ES]
La Vel. Inicial de acuerdo con la Teo. de M-M, está determinada por la
vel. de descomposición del [ES], K2 ,
ES E + PK2
K-2
Vo
K2
[ES] =
[Et ] [S]
[S] + (K-1 + K2)
K1
[ES] =
Vo = K2 [ES]
[ES]
[ES]
K2 [Et ] [S]
[S] + (K-1 + K2)
K1
Se puede simplicar:
Vo = Definiendo KM
Cte. De Michaelis-Menten como(K-1 + K2)
K1
Vmax como K2 [Et] que es la Vel. Cuando todo el
enzima disponible E, se halla presente en forma de ES.Vmax [S]
[S] + KM
Vo =Ecuación de Michaelis-Menten o Ecuación de Velocidad
para una reacción de un solo S catalizada por un E.
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ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN Vo = Vmax [S]
Km + [S]
1
2 Vo = Vmax
De la ecuación de M-M se deduce una rel. numérica importante
Cuando la Vo es la mitad de la Vmax
Vmax Vmax [S]
2 KM + [S] =
1 [S]
2 KM + [S] =
KM = 2 [S] – [S]
KM = [S]
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Vo =Vmax [S]
KM + [S]
E E-S E
S P
Velocidad: cantidad de producto formado en una unidad de tiempo
S E P
100 1000 100
1000
1000
1000
1000
1000
1000
250 250
500 500
750 750
1000 1000
2000 1000
3000 1000
Vmax
(mM) mU (mM/ min)
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Cinética enzimática en función de la concentración
de sustrato
KM
1
2 Vo = Vmax
KM = [S]
Vmax
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Catalasa H2O2 25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5
Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
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• La KM es inversamente proporcional con la
actividad de la enzima.
• Valor de KM grande, baja actividad
• Valor de KM pequeño, alta actividad
La KM
es un parámetro de
Actividad Enzimática
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Catalasa H2O2 25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5
Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
En ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM
Después de comer …. Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
H2O
Quimotripsina Ac-Phe-Ala Ac.Phe + Ala 150
H2O
Pepsina Phe-Gly Ac-Phe + Ala 0.3
H2O
Ribonucleasa Citidina 2’,3’ Citidina 3’ 7.9
fosfato cíclico fosfato
Anhidrasa Carbónica
Km de algunas enzimas
ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
Mathews C.K. y Van Holde K.E 1998. .Bioquímica 2ª. Ed. McGraw-Hill Interamericana. España. Pag 418
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Hexosa Cerebral
Azúcar Km
(mol/ L)
Cinasas
D-Glucosa 8 X 10 -6 Glucocinasa
Hexocinasa IV
D-Fructosa 2 X 10 -3 Fructocinasa
D-Manosa 5 X 10 -6 Manocinasa
D-Galactosamina 8 X 10 -5 Galactocinasa
Km
(mmol/ L)
8
2000
5
80
Km
(mmol/ L)
0.008
2.0
0.005
0.08
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ATP + Glucosa ADP + 6-fosfato de glucosa
2 Rutas
Enzimas: pueden catalizar reacciones donde hay 2 S =
Hexocinasa
•Desplazamiento Simple, los 2 S se unen a la E
A + B + E EAB C + D
•Doble desplazamiento o ping-pong
A + B + E AE BE + C
D
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Determinación Cuantitativa de la Cinética Enzimática
1. La reacción global
2. Procedimiento analítico para determinar el S que
desaparece o el P que aparece
3. Sí el E requiere Cofactores (iónes o coenzimas)
4. La dependencia de la actividad enzimática con la
[S] o sea la KM de la Enzima.
5. El pH óptimo
6. Un intervalo de temperatura en la que la E es
estable y muestra actividad elevada.
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Catalasa H2O2 25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5
Anhidrasa carbónica HCO3- 9.0
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
Glucosa en ayunas 95 mg/dl. 950 mg/L = 5.27 mM
Después de comer ….
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Pepsina 1.5
Tripsina 7.7
Catalasa 7.6
Arginasa 9.7
Fumarasa 7.8
Ribonucleasa 7.8
Enzima pH óptimo
Vo
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4 37 85
Temperatura oC)
Vo
10 50 100
Coenzima
Vo
10 30 50 70 100
Tiempo (min)
Vo
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1.0 Unidad de Actividad Enzimática (U):
La cantidad que transforma 1.0 mmol (10-6 M) de S /min,
a 25 0C, en las condiciones de medida óptima.
Actividad específica:
Es el no. de U de una E / mg de proteína.
Es decir: una medida de la pureza de la E.
Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable.
Número de recambio
No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo,
por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico)
Enzima No. de Recambio
Anhidrasa carbónica 36 000 000
B-Amilasa 1 000 000
B-Galactosidasa 12 000
Fosfoglucomutasa 1 240
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[S] (mM) Vo (mM/ min)
1.25 0.86
1.67 1.02
2.5 1.32
5 1.67
10 2.09
¿Vmax?
¿KM?
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y = m x + b
Transformación de la M-M. Representación Doble Recíproco
Vmax [S]
[S] + KM
Vo =
Vmax [S]
KM + [S]Vo =
1 KM + [S]
Vo Vmax [S] =
Sí se toman los recíprocos de ambos
1 KM 1 [S]
Vo Vmax [S] Vmax [S] =
Separando los componentes de numerador
+
1 KM 1 1
Vo Vmax [S] Vmax
=
Simplificando
+Ecuación de
Lineweaver-Burk
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Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.Km= 37.48
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
Vo
(mm
ol/
L m
in)
[S] mM
Michaelis Menten
S (mM) Vo (mmol/L min)
0.05 0.71
0.10 1.07
0.20 1.50
0.35 1.80
0.50 1.88
1/S 1/Vo
20.0 1.4
10.0 0.9
5.0 0.7
2.9 0.6
2.0 0.5y = 0.0494x + 0.4257
R² = 0.9991
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
-10.0 -5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0
Linewever-Burk
1/[S]
1/ V
o
1 KM 1 1
Vo Vmax [S] Vmax
= +
y = m x + b
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Gráfica de Eadie-Hofstee
Vmax [S]
KM + [S]Vo =
(KM + [S]) Vo = Vmax [S]
KM Vo [S] Vo Vmax [S]
[S] [S] [S]=
+
Vo = - KM Vo Vmax
[S]
+
y = - m x + bVo
[S]
V max
KM
Vo
Vmax
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KM Vo [S] Vo Vmax [S]=+
KM Vo Vo Vmax
[S] =+
S (mM) Vo (mmol/L min)
0.05 0.71
0.10 1.07
0.20 1.50
0.35 1.80
0.50 1.88
1/S 1/Vo
20.0 1.4
10.0 0.9
5.0 0.7
2.9 0.6
2.0 0.5
Vo/S Vo
14.200.71
10.701.07
7.501.5
5.141.8
3.761.88
y = -0.1168x + 2.3571R² = 0.9947
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Vo
Vo/S
E-H
7
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Cuando:
Vo= Vmax Todos los sitios activos están ocupados y
no hay moléculas de E libre.
KM= [S] Sí... ½ Vmax.
KM representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse
a la mitad de la E disponible y producir la mitad de la Vmax.
KM representa la concentración del sustrato en una célula.
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Gracias
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Inhibidores Enzimáticos
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
E E-S E
S
P
Velocidad: cantidad de producto formado en una unidad de tiempo
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60
Vo
(mm
ol/
L m
in)
[S] mM
Michaelis MentenS (mM) Vo (mmol/L min)
0.05 0.71
0.10 1.07
0.20 1.50
0.35 1.80
0.50 1.88
1/S 1/Vo
20.0 1.4
10.0 0.9
5.0 0.7
2.9 0.6
2.0 0.5
1 KM 1 1
Vo Vmax [S] Vmax
= +
y = m x + b
Vo = V max [S]
Km + [S]
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Inhibidores
Reactivos químicos específicos que pueden
inhibir a la mayor parte de las enzimas.
INHIBIDORES
Irreversibles
Reversibles
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Inhibidor Irreversible
• Inhibición permanente
• Unión irreversible por medio de enlaces covalentes.
• Modificaciones químicas de los gps. catalíticos.
• Modificada la enzima, está siempre inhibida.
Para distinguirlo de los reversible se someten a
diálisis y si no se separan: enzima e inhibidor, éste es
permanente.
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Diálisis
S + E SE E + P
E + I EI EI
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Inhibidor Irreversible
Acetilcolinesterasa
Acetilcolina
Acetato + Colina
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Inhibidor Irreversible
Acetilcolina
Acetato + Colina
Fluorofosfato de di-isopropilo (DFP)
Enz
Enz
Acetilcolinesterasa
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Inhibidor Irreversible Fluorofosfato de di-isopropilo (DFP)
1914- 1918
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Inhibidor Irreversible
Acetilcolinesterasa
Tripsina
Elastasa
Fosfoglucomutasa
Cocoonasa (larvas de gusanos de
seda)
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)
Plaguicidas de tipo organofosforados y carbamatos
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Fluorofosfato de di-isopropilo (DFP) Serina
Cisteína
HistidinaIodoacetamida
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• La unión del inhibidor y la enzima es reversible.
• Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad.
Hay 3 tipos:
Competitiva
No Competitiva
Acompetitiva (Alostérica)
Inhibidor Reversible
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Antibióticos
Insecticidas
Hervicidas
Venenos
Diferentes Medicamentos
Dolor
Inflamación
Infecciones virales
Cáncer
Inhibición
enzimática
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Inhibición Competitiva
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Vmax igual
KM diferente
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Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico
Sulfas Infecciones microbianas
Antihipertensores: Captopril y Enalopril
Alopurinol Controla la gota
Fluoruracilo Cáncer
Inhibidores Competitivos
Inhibidor de la Angiotensina. Polipéptido sanguíneo
produce vasoconstricción, aumento de presión arterial
Análogo Inhibe Xantina-oxidasa
Hipoxantina xantina ácido úrico
Inhibe Dihidropteroato sintetasa
precursores de ácido fólico
CK, Cad. Resp.
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El inhibidor NO se une al sitio activo
Inhibición No Competitiva
NO se puede revertir con un exceso de sustrato
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Vmax diferente
KM igual
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Cinéticas de Inhibición Competitivo
Vmax igual
KM diferente
No competitivo
Vmax diferente
KM igual
No inhibitor
1
V
1/[S]0
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Inhibición acompetitiva
I
El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora
La subunidad catalítica
une al sustrato y
cataliza la reacción
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S (mM) Vo (mmol/L min) Vo (mmol/L min)
0.05 0.71 0.43
0.10 1.07 0.71
0.20 1.50 1.05
0.35 1.80 1.41
0.50 1.88 1.60
1/S 1/Vo 1/Vo
con Inhib.
20.0 1.4 2.3
10.0 0.9 1.4
5.0 0.7 1.0
2.9 0.6 0.7
2.0 0.5 0.6
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Hay enzimas que no obedecen la
ecuación de Michaelis-Menten.
Cinética no es Michaeliana.
Enzimas alostéricos,
pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a
la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de
reacción.
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.
Gracias
Dra. Leticia Bucio Ortiz. Depto. Ciencias de la Salud. DCBS. UAM-Izt. México.