Tissue-arrays en oncología

Hospital USP-San Jaime15 de Diciembre de 2006

Sesión Plataforma de Oncología

Jerónimo Forteza Vila

PPPP

PPPP

PPPP

PP PPPP PP

PP

PPPP

PPPP

PPPP

PP PPPP PP

PP

DABDAB

INMUNOHISTOQUINMUNOHISTOQUÍÍMICAMICA

EGFR en carcinoma de EGFR en carcinoma de pulmpulmóónn no no microcmicrocííticotico

InmunohistoqúímicaInmunohistoqInmunohistoqúíúímicamica

HibridaciHibridacióónn in situin situ

FISH

Cromosoma 17

Centrómero

17 p11.1-q11.1

Gen HER-2

17 q11.2-q12

Sonda CEN 17CEN 17 Sonda HER2HER2

FISH con FISH con gengen HERHER--2/neu 2/neu amplificadoamplificado

Determinación del estado del HER2/neuDeterminaciDeterminacióón del estado del HER2/n del estado del HER2/neuneu

Centrómero

Gen HER2 amplificado

BIOCHIPS DE VIDRIO: HIBRIDACIÓN Y LECTURA

BIOCHIP(6.000-20.000

CLONES)

CÉLULAS “A” CÉLULAS “B”

ADNcMARCADOS

MEZCLA DE ADNc

HIBRIDACIÓN

GEN 1

GEN 2

GEN 3

AD

Nc1

AD

Nc3

AD

Nc2

A> BA=B A<B

LECTURA

EXTRACCIÓN DE ARN Y RETROTRANSCRIPCIÓN

NO ANO B

Cedido por Dr. Xose Bustelo (CICS)

CUIDADOS DEL PACIENTE CON CANCER

A Gene-Expression Signature as a Predictor of Survival in Breast Cancer

Marc J. van de Vijver, M.D., Ph.D., Yudong D. He, Ph.D., Laura J. van 't Veer, Ph.D., Hongyue

Dai, Ph.D., Augustinus A.M. Hart, M.Sc., Dorien W. Voskuil, Ph.D., George J. Schreiber,

M.Sc., Johannes L. Peterse, M.D., Chris Roberts, Ph.D., Matthew J. Marton, Ph.D., et al

CONCEPTO MICROARRAYSNovedosa técnica de Biología Molecular consistente en la realización de un perfil genómico para una muestra en cuestión mediante la detección por medio de unas sondas dispuestas ordenadamente en una microcuadrícula conformando así un ARRAY.Esta estructura será hibridada posteriormente con la muestra determinando el perfil en cuestión con lectura por inmunofluorescencia

UTILIDAD

Susceptibilidad genéticaFactores pronósticos molecularesFarmacogenómicaQuimioresistenciaEnfermedad mínima residual

VENTAJAS

Elevado número de eventos moleculares capaces de ser analizados simultáneamenteCantidad de muestra necesaria muy pequeñaAlta sensibilidad (se dice similar a una PCR)Procedimiento rápido (una vez que ya se ha diseñado el array)

CONSIDERACIONES DE LA TÉCNICA

1. Análisis racional del problema que se pretende abordar

2. Diseño de las sondas (toda la información obtenida dependerá de ello)

3. Soporte físico del array (depende del análisis a realizar)

4. Equipo para la producción del microarray5. Hibridación6. Lectura e interpretación

DESVENTAJAS

Elevado coste del equipoCoste de síntesisDiseño de array laborioso: Es necesario planificar meticulosamente tanto las secuencias a introducir como la utilidad de las mismas, y realizar una simulación previa informatizada del proceso de hibridaciónAnálisis informático de los resultados complejo

“El análisis de un gran número de tejidos tumorales con técnicas convencionales de patología molecular es pesado y lento. Recientemente los autores desarrollaron la tecnología del ‘microarray’ tisular que hace posible estudiar hasta 1000 tumores en una única preparación, la cual puede ser analizada por hibridación in situ con fluorescencia (FISH), hibridación in situ para ARN, o inmunohistoquímica.”

Tissue Microarrays: What Will They Bring to Molecular andAnatomic Pathology?

Holger Moch, Juha Kononen, Olli-P. Kallioniemi, and Guido Sauter

Advances in Anatomic Pathology (2001) 8: 14-20

“Los microarrays tisulares han llegado a convertirse en uno de las más prometedoras herramientas para el patólogo molecular, y tendrá muchas aplicaciones en investigación del cancer, al igual que en otros campos de la patología.”

Tissue Microarrays: What Will They Bring to Molecular andAnatomic Pathology?

Holger Moch, Juha Kononen, Olli-P. Kallioniemi, and Guido Sauter

Advances in Anatomic Pathology (2001) 8: 14-20

Múltiples tejidos diferentes en una única matriz incorporada en un bloque de parafina

MMúúltiples tejidos diferentes en ltiples tejidos diferentes en una una úúnica matriz incorporada nica matriz incorporada en un bloque de parafinaen un bloque de parafina

Análisis inmunohistoquímicoso molecular de cientos de muestras en una sola sección

AnAnáálisis lisis inmunohistoquinmunohistoquíímicosmicoso molecular de cientos de o molecular de cientos de muestras en una sola seccimuestras en una sola seccióón n

Tissue MicroarraysTissueTissue MicroarraysMicroarrays

Valoración del gen HER2/neu en hibridación in situ cromogénica (CISH) y con fluorescencia (FISH)

Ángel Vázquez-Boquete y cols.Facultad de Medicina y Hospital Clínico-Universitario. Santiago de Compostela

Marcadores del ciclo celular y carcinoma humanos

205 pacientes (110 mujeres y 95 hombres)Carcinomas de colon, mama, pulmón y próstata (80, 73, 37 y 15, respectivamente)Tissue microarray: Estudio inmunohistoquímicopara: Ki-67, Bcl2, Bax, Ciclina D1, Ciclina D3, cDK1, cDK2, cDK6, p16, p21 y p27Análisis estadístico (SPSS)

Abdulkader I et al. Oncol Rep (2005) 14: 1527-31

Material y métodos

Marcadores del ciclo celular y carcinoma humanos

Análisis univariante:Mayor supervivencia global

P27 (p < 0,0135)P16 (p < 0,0442)Bcl2 (p < 0,0001)

El riesgo de muerte es 2,3 veces mayor en los bcl2 negativos

Bcl2 es un factor clave en el comportamiento clínico de los carcinomas con independencia del órgano afectado

Resultados

Abdulkader I et al. Oncol Rep (2005) 14: 1527-31

Risk-stratification for lymphoma patients. DLBCL

Referencia

cyclin E < 80% CDK1 > 80% SKP2 > 80% EBER - MUM1 < 80% CDK2 < 50% Bcl-6 > 50% Rb-P > 80%

Beta (peso específico)

3.035 2.650 2.457 2.249 1.483 0.964 0.937 0.646

Referencecategory

Beta (specific weight)

Referencia

cyclin E < 80% CDK1 > 80% SKP2 > 80% EBER - MUM1 < 80% CDK2 < 50% Bcl-6 > 50% Rb-P > 80%

Beta (peso específico)

3.035 2.650 2.457 2.249 1.483 0.964 0.937 0.646

Referencia

cyclin E < 80% CDK1 > 80% SKP2 > 80% EBER - MUM1 < 80% CDK2 < 50% Bcl-6 > 50% Rb-P > 80%

Beta (peso específico)

3.035 2.650 2.457 2.249 1.483 0.964 0.937 0.646

Referencecategory

Beta (specific weight)

Referencecategory

Beta (specific weight)

Logistic regression analysisfailure versus failure-free.

8 / 21Cyclin E CDK1 SKP2 EBER MUM1 CDK2 Bcl-6 Rb-P

z = -7.0865 + 3.0352*Cyclin E + 2.6502*CDK1 + 2.4572*SKP2 + 2.2494*EBER + 1.4833*MUM1 +

0.9639*CDK2 + 0.9367*Bcl-6 + 0.6458*Rb-P

1

(1+e-z)p =

The model can predict thecategory to which a given

patient belongs

Risk-stratification for lymphoma patients. DLBCL

+

Integration of protein-expression-based scoreand IPI in a predictive multivariate model

The predictive capacity of the integrate final model was slightly higher in each one of the quartiles. Moreover, the separation into groups with different outcome was better.

Biological score + IPI

Time (months)

806040200

Pro

babi

lity

of s

urvi

val

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

p

Risk-stratification for lymphoma patients. DLBCL

The protein expression-based scorewith 8 markers complements the

information obtained from the use ofthe IPI, allowing patients to be

assigned to different risk categorieswith unprecedent accuracy.

PET Y CANCERPET Y CANCER18F18F--FDGFDG

Mayor captación en tumores vs no tumorMayor captación en tumores indiferenciadosCorrelación con:

EstadioMicroinvasiónProliferación celularRespuesta a la QTSupervivencia

Nuevo proyecto tissuearrays

PET Y MICROARRAYPET Y MICROARRAYEN CANCER DE PULMONEN CANCER DE PULMON

Correlación con factores de proliferación, apoptosis, necrosis y proliferación vascular

After “The Anatomy Lecture of Dr. Nicolaes Tulp” – Rembrandt, 1632(Courtesy of Dr. Carlos Cordón, New York, USA)