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Detección de los Patógenos I METODOS DE ANALISIS

M.Cs. Mercedes Iriarte P. CASA – UMSS

Enumeración de Microorganismos

• Medidas cuantitativas • Cualitativo (presence/absence)

• Para Bacteria: CFU=Unidad Formadora de Colonia

• Para Viruses: PFU =Unidad Formadora de placa

• Para Parásitos (y algunas bacterias) conteo celular

usando microscopia

• MPN : Número Más Probable (método estadístico para estimar las concentraciones con múltiples ensayos en diluciones para la extinción [0])

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Medida del crecimiento microbiano

• Métodos indirectos

– Actividad metabólica

– Peso seco

– Turbiedad

Cultivo/Métodos estandar para la detección de patógenos en el medio ambiente

• Virus

– Concentración/separación

– Cultivo celular (una linea celular, no detecta todas)

– Identificacion por PCR

• Bacteria

– Concentración/separación

– Medio de enriquecimiento

– Medio selectivo

– Test Bioquímico, serologia, immunoquímica

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BACTERIAS EN UNA PLACA EN AGAR COLONIAS FORMANDO UNIDADES UFC

Bacterias necesitan incubación para formar UFC en 24 a 48 horas

Salmonella, E. coli, Staphylococcus aureus, Streptococos faecalis

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Métodos basados en el crecimiento: Organismos

indicadores fecales para medida de la calidad del agua

Coliformes fecales

En agar y colonias

por FM

E.coli en agar y

colonias por FM

Coliformes

totales

NMP

Filtración de

100 ml de

muestra de

agua

Total coliforms

En agar y colonias

por FM

E.coli

NMP

Número Mas Probable

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cccc

Coliformes totales

Coliformes

termotolerantes

INDICADORES CLASICOS DE CONTAMINACION

Relación entre coliformes totales, termotolerantes y E. coli

Escherichia coli

Métodos de coliformes Totales

Método de filtración por membrana (FM) - Un total de 100 ml

de muestra en uno o más filtros; por ejemplo, 1 filtro con

100 ml ó 4 filtros con 25 ml cada uno.

Método de fermentación en tubos múltiples (FTM) o del

número más probable (NMP) - 10 tubos con 10 ml cada uno

ó 5 tubos con 20 ml cada uno.

Método de presencia-ausencia (PA) - 100 ml en 1 botella.

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VENTAJAS DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Proporciona recuentos directos.

Es más preciso (se obtienen resultados más

reproducibles) que la prueba de TM o NMP.

Rápido y fácil de realizar.

Analiza mayores volúmenes de muestras con bajas concentraciones de organismos.

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Interfieren los altos niveles de turbiedad.

Los coliformes debilitados pueden sobrevivir

mejor en la prueba de TM o NMP.

Las altas concentraciones de no coliformes

interfieren en el recuento.

Efecto del tipo de filtro de membrana.

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Métodos rápidos: Colilert (Ausencia/Presencia)

• Su formulación es específica para crecimiento de coliformes y

E. coli en agua dulce o tratada. Está basada en la tecnología de

substrato definido (DST).

• Enzima ß-galactosidasa. Bacteria coliforme metabolizará al

ONPG formando una coloración amarilla.

• E. coli - enzima ß-glucoronidasa. Si está presente en la

muestra, metabolizará al MUG, produciendo fluorescencia.

Conteo directo al microscopio

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CRECIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO CELULAR CELULAS no infectadas y células en tejido de mono

infectadas

Crecimiento puede tomar varias semanas para algunos virus

FAGOS (colifagos)

Microfotografía electrónica

Siembra en placa en agar

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INFECCION DEL VIRUS UNIDAD FORMADORA DE PLACA PFU CULTIVO CELULAR, CON AGAR DE RECUBRIMIENTO TEÑIDO PARA MOSTRAR DONDE HAY LISIS CELULAR

Metodos para la Detección de Patógenos

• Protozoarios

• Concentración o elución

• Purificación

• Centrifugación diferencial

• Separación Inmuno Magnetica

• Tinción con anticuerpos monoclonales

• Observación bajo la luz UV

• Observación de características

• Forma y tamaño

• Estructuras internas

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Volumen (típico) de muestra de agua

• Bacterias indicadoras y patogénicas • 100 to 1000 ml

• Viruses • Aguas negras 1-5 litros • Residual tratada 40 litros • Agua superficial 400 litros • Aguas subterraneas y de bebida 400 a

2000 litros

• Protozoarios • Residual tratada 4 liters • Agua superficial 10 a 100 litros • Agua de consumo 10 a 100 litros

Concentración de viruses del agua

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Elución de los virus, reconcentracion, filtracion de bacterias, tratamiento con antibióticos, listo para qPCR o cultivo celular

1M

DS

filte

r

Cartri

dge

housin

g

1.5% beef

extract

(pH9.5)

Viral particles

were eluted

from 1MDS

filter using

1.5% beef

extract (pH 9.5)

Dr, Xagoraraki, MSU

Sample/retentate reservoir

Ultrafilter (MWCO 30kDa)

Peristaltic pump

Filtrate/waste

Retentate

Feed

sistema de ultrafiltración de bajo costo con filtros de fibra porosa desechables - De exclusión por

tamaño

- Amplia gama de

virus se puede

recuperar en una

única muestra de

agua

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Muestreo de aerosol • Impingers • Impact- Anderson

Aerosol • Filters • High volume fluid

samplers • Electrostatic

participators • Settling plates

• Efficacy affected by

• Collection media • Relative humidity • Desiccation

Tipos de Fómites

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Algodón Laminado Dinero Poliéster

Cerámica Acrílico Acero Inox Vidrio

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Muestreo de Fómites

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A: Sample

B: Filter inlet

C: Filter outlet

D: Peristaltic pump

E: Flow meter

F: To waste

Graphic representation of the primary concentration step

Cryptosporidium y Giardia del agua

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Giardia y Cryptosporidium

- EPA 1623 (EPA 2005), kit Dynabeads GC-Combo de Dynal Biotech, tinción IFA (Cryptosporidium/Giardia de Merifluor)

concentración

- Separación inmunomagnética

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Separación Inmunomagnética de Cryptosporidium parvum oocysts

oocysts IMS beads captured oocysts

Perlas: superparamagnético, recubierto con una cubierta de polímero delgada (contenido de hierro: 20%)

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Observación al microscopio de epifluorescencia

Quistes de Giardia sp.

Ooquistes de Cryptosporidium sp.

Las estructuras son marcadas con anticuerpos específicos con marcadores fluorescentes

Conteo al microscopio de quistes de parásitos Giardia y ooquistes de Cryptosporidium. Microscopio de fluorescencia. Estados medioambientales

Huevos de helmintos

• Método modificado en el Centro de Aguas y Saneamiento Ambiental bajo la versión del Estándar Métodos de México (Secretaria de Comercio y Fomento Industrial 1999).

- Comprende: Procesos de coagulación, sedimentación, flotación, decantación y técnica bifásica (para recuperar los huevos y realizar el conteo).

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Procedimiento: - sedimentación (8 hrs. o una noche)

- Eliminación del sobrenadante

- Centrifugación

- Lavados sucesivos

- Lavado a través de tamices de diferentes tamaños

• Homogenización del concentrado

• ZnSO4.7 H2O (etapa

bifásica)

• Limpieza de la muestra

• Lavado a través de un tamiz de 160 µ

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• Lavados sucesivos a través de tamices

ayuda con una brocha

suave.

- Viabilidad: incubación de la muestra tratada por 15 dias a 25°C

Observación al microscopio

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