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Efecto neuroprotector combinado de aminoguanidina y dapsona en
modelo in vitro de infarto cerebral y diabetes mellitus.
Trimestre de Investigación II.Efecto de la Aminoguanidina y Dapsona
Q.F.B. Juventino III Colado Velázquez
Actividades Realizadas
Prueba de diferentes concentraciones de aminoguanidina, 250, 500 y 1000mM.
Efecto de Aminoguanidina en animales normales y diabéticos.
Efecto de Dapsona en animales normales y diabéticos.
Material y Métodos
Ratas Wistar Macho (n=6) 200-250 gramos con ciclos de luz-oscuridad invertidos a las que se permitió acceso ad libitum a agua y alimento.
Inducción de diabetes a animales con STZ 66.0 mg/kg intraperitoneal. 90 días de diabetes.
Se midió la glucosa con un glucómetro Bayer Contour TS Se consideraron diabéticos los animales con
concentraciones de glucosa mayores a 25 mmol/L de glucosa.
Los animales se sacrificaron por decapitación, se extrajo el cerebro de los animales haciendo un corte longitudinal dejando descubierto el corpus striatum, el cual fue cuidadosamente removido y posteriormente rebanado utilizando el método descrito por McIlwain.
Material y Métodos
Las rebanadas de corpus striatum fueron incubadas en tubos de ensayo (4 rebanadas por tubo) conteniendo solución Krebs-Ringer conteniendo NaCl 118 mM, KH2PO4 1.2 mM, KCl 4.7 mM, CaCl2 2.5 mM, MgSO4 1.17 mM, Glucosa 5.6 mM y Tris 25 mM. En un baño a temperatura de 37ºC, burbujeando 95% O2 y 5% de CO2.
Todos los procesos experimentales y manejo de los animales se realizaron de acuerdo a los protocolos establecidos por el Comité de Ética de Animales del Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía de México.
Material y Métodos
Las rebanadas de corpus striatum obtenidas de los animales, se sometieron a los siguientes tratamientos:Control Aminoguanidina
500uMIsquemia Isquemia + Aminoguanidina
500uM
Dapsona 1.2 uM Isquemia + Dapsona 1.2uM
O2/CO2
n=6
O2/CO2
n=6
O2/CO2
N2 20min
O2/CO2 30 min
n=6
O2/CO2
N2 20min
O2/CO2 30 min
n=6
Material y Métodos
Una vez terminados los tratamientos. Dependiendo de la determinación se tomaron las muestras.
Para Espectrofotometría, se tomaron 2mL del buffer Krebs en el que se incubaron las rebanadas, y se pusieron en viales eppendorf, de los cuales se tomaron las alícuotas para la reacción de Griess.
Material y Métodos
Para cuantificar los nitritos se realizó una determinación espectrofotométrica (540 nM).
Modificación de la reacción de Griess. Permite cuantificar nitritos
Reducción de los nitratos a nitritos utilizando solución saturada de VCl3.
Reactivos Griess: Sulfanilamida 2% en 5% HCl, NEDD 0.1% en agua.
Curva de Calibración con NaNO2 - 200 M, 100 M, 50 M, 25 M, 12.5 M, 6.25 M, 3.125 M.
Material y Métodos
200 L Muestra/Estándar + 100 L SULF + 100 L NEDD + 200 L VCl3 .
Se incubaron las muestras por 30 min a 37ºC.Se procedió a leer en espectrofotómetro a 540
nm.Como Blanco se utilizó el medio de disolución.
Curva de Calibración
0 50 100 150 200 2502.1
2.3
2.5
2.7
2.9
3.1
3.3
3.5
f(x) = 0.00600739107611549 x + 2.18921666666667R² = 0.99950958370665
Concentración de NaNO2 mM
Ab
so
rba
ncia
x1
0-1
Resultados Aminoguanidina
Tukey's Multiple Comparison Test P value
Control vs Control + Isq P < 0.001
Control vs 250 uM P < 0.001
Control vs 500 uM P > 0.05
Control vs 1000 uM P < 0.05
Control + Isq vs 250 uM P < 0.001
Control + Isq vs 500 uM P < 0.001
Control + Isq vs 1000 uM P < 0.001
250 uM vs 500 uM P < 0.001
250 uM vs 1000 uM P < 0.001
500 uM vs 1000 uM P < 0.01
Resultados Aminoguanidina
Tukey's Multiple Comparison Test P value
Control vs Amino P > 0.05
Control vs Isq P < 0.001
Control vs Isq + Amino P > 0.05
Amino vs Isq P < 0.001
Amino vs Isq + Amino P > 0.05
Isq vs Isq + Amino P < 0.001
Resultados Aminoguanidina
Tukey's Multiple Comparison Test P value
Control vs. Amino P < 0.05
Control vs. Isq P < 0.001
Control vs. Isq+Amino P < 0.05
Amino vs. Isq P < 0.001
Amino vs. Isq+Amino P < 0.001
Isq vs. Isq+Amino P < 0.001
Resultados Aminoguanidina
Source of Variation
% of total variation P value
Interaction 3.43 P<0.0001
Tipo de Rata 16.57 P<0.0001
Tratamiento 72.46 P<0.0001
Resultados Dapsona
Tukey's Multiple Comparison Test P value
Control vs. Dapsona P > 0.05
Control vs. Isq P < 0.001
Control vs. Isq + Dap P < 0.001
Dapsona vs. Isq P < 0.001
Dapsona vs. Isq + Dap P < 0.001
Isq vs. Isq + Dap P < 0.001
Resultados Dapsona
Tukey's Multiple Comparison Test P value
Control vs. Dapsona P > 0.05
Control vs. Isq P < 0.001
Control vs. Isq + Dap P < 0.001
Dapsona vs. Isq P < 0.001
Dapsona vs. Isq + Dap P < 0.001
Isq vs. Isq + Dap P > 0.05
Resultados DapsonaSource of Variation
% of total variation P value
Interaction 0.87 P=0.0581
Tipo de Rata 17.31 P<0.0001
Tratamiento 71.99 P<0.0001
Discusión
La disminución de la dosis de aminoguanidina, da como resultado una reducción significativa en la cantidad de nitritos cuantificados.
El incremento de la dosis, reduce la cantidad de nitritos cuantificados a niveles menores que el control.
La dosis de 500 mM de Aminoguanidina se compara con el control.
Discusión
Los experimentos con aminoguanidina en animales no diabéticos dieron resultados muy semejantes a los obtenidos en experimentos previos.
La aminoguanidina en animales diabéticos disminuye la cantidad de nitritos producidos aún en muestras no sometidas a isquemia.
En ambos casos, la aminoguanidina reduce la cantidad de nitritos producidos por muestras sometidas a isquemia a niveles semejantes a los controles.
Discusión
La adición de dapsona 1.2mM no muestra ninguna influencia en muestras no sometidas a proceso de isquemia, tanto en muestras de animales diabéticos como no diabéticos.
La dapsona presenta un pequeño efecto en tejidos sometidos a isquemia, tanto en muestras de animales diabéticos como no diabéticos.
La razón para esta pequeña actividad de la dapsona puede encontrarse en el mecanismo de acción que se ha postulado, que es el de antioxidante.
Discusión
IsquemiaHipoxia -> Alteraciones de la homeostasis -> iNOSLiberación de citocinas.
ReperfusiónEntrada de O2 -> Especies reactivas de oxígeno (O2
-)
Interacción de O2- con NO -> ONOO-
Peroxidación lipídica -> Muerte celularLa aminoguanidina actua directamente sobre
la iNOS.Dapsona tiene efecto antioxidante previniendo
la formacion de especies reactivas de oxígeno.
Discusión
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