PROCEDIMIENTO TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS
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PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE TÉCNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS PROTOCOLO DE TÉCNICAS Nº Resolución: 1238 26 Agosto de 2011 ______________________________________________________________________ HOSPITAL SANTIAGO ORIENTE DR. LUIS TISNE BROUSSE Avda. Las Torres Nº 5150 – Comuna Peñalolen – Fono 4725200 – www.hsoriente.cl 86 ELABORADO POR REVISADO POR APROBADO POR NOMBRE TM FABIOLA NUÑEZ TM ANGIE CALFUMAN DRA. FANCY GAETE TM JANNETTE AMARO TM ANGIE CALFUMAN TM RAUL JARA TM FABIOLA NUÑEZ DR JULIO MONTT VIDAL CARGO TECNOLOGO MEDICO ENCARGADA CALIDAD TECNOLOGO MEDICO JEFE DE LA UNIDAD JEFE LABORATORIO TECNOLOGO MEDICO TECNOLOGO MEDICO TECNOLOGO MEDICO ENCARGADA CALIDAD DIRECTOR FECHA 2009 2011 2011 FIRMA
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PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE
TÉCNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS PROTOCOLO DE TÉCNICAS
Nº Resolución: 1238 26 Agosto de 2011
______________________________________________________________________ HOSPITAL SANTIAGO ORIENTE
DR. LUIS TISNE BROUSSE Avda. Las Torres Nº 5150 – Comuna Peñalolen – Fono 4725200 – www.hsoriente.cl
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ELABORADO POR REVISADO POR APROBADO POR
NOMBRE TM FABIOLA NUÑEZ TM ANGIE CALFUMAN
DRA. FANCY GAETE TM JANNETTE AMARO TM ANGIE CALFUMAN
TM RAUL JARA TM FABIOLA NUÑEZ
DR JULIO MONTT VIDAL
CARGO
TECNOLOGO MEDICO ENCARGADA CALIDAD TECNOLOGO MEDICO
JEFE DE LA UNIDAD JEFE LABORATORIO
TECNOLOGO MEDICO TECNOLOGO MEDICO TECNOLOGO MEDICO ENCARGADA CALIDAD
DIRECTOR
FECHA 2009 2011 2011
FIRMA
PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE
TÉCNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS PROTOCOLO DE TÉCNICAS
Nº Resolución: 1238 26 Agosto de 2011
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Control de Cambios
Versión Descripción Fecha 1 Creación NOVIEMBRE 2009 2 Revisión OCTUBRE 2010 3 Revisión AGOSTO 2011
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PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE TECNICAS
INMUNOHISTOQUIMICAS
Los patólogos, luego de revisar un caso específico, pueden requerir la realización
de técnicas inmunohistoquímicas para efectuar un diagnóstico certero de la
patología de un paciente, o como rutina en marcadores tumorales (ejemplo
receptores hormonales y HER2). Para ello eligen la lámina H/E más representativa
del caso, tratando en lo posible que exista un control interno positivo y completan
una solicitud de biopsia con los datos del paciente, diagnóstico preliminar, fecha
de solicitud y técnica que se desea realizar más los códigos que requiere la
prestación. Esta solicitud es dejada en el buzón de técnicas ubicado en el
laboratorio de la UAP.
El tecnólogo de turno:
1. Debe registrar esta solicitud en el libro de “Solicitud de Técnicas
Inmunohistoquímicas”
2. Buscar el taco que corresponda a la lámina.
3. Realizar los cortes necesarios en portaobjetos cargados positivamente,
asegurándose de identificar la lámina con el número correspondiente al
taco.
4. Procurar contar con un control para la técnica deseada. Si hay más de un
caso con la misma solicitud de IHQ, se realiza un control por tanda a
realizar.
5. Verificar si la técnica puede realizarse en el inmunotincionador automático o
de lo contrario debe realizar la técnica manualmente.
6. Asignar un nuevo número al caso cuando corresponda, mantener un
registro y estadística de las técnicas IHQs. El nuevo número debe ir escrito
en el portaobjetos sobre el número original, sin borrarlo, usando plumón o
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etiqueta hecha a mano. En caso de que el portaobjetos lleve etiqueta del
inmunotincionador automático, pegar la etiqueta en la zona esmerilada sin
borrar el número original.
7. Realizar la técnica según protocolo del anticuerpo a estudiar.
8. Entregar a una de las secretarias la solicitud de técnica que contiene los
datos anteriormente mencionados más el nuevo número del caso, la fecha
de realización de la técnica y las iniciales del TM de turno, para que la
ingrese al sistema del hospital.
9. Verificar si la técnica resultó exitosa corroborando al microscopio el o los
controles de ésta. Si la técnica es satisfactoria, se adjunta a la solicitud
previamente ingresada al sistema del hospital por parte de las secretarias y
se prosigue al punto 8, si no, debe repetirse volviendo al punto 1.
10. Registrar el nuevo número en el sistema computacional SisGB.
11. En las láminas que no poseen el control de la técnica, indicar con un lápiz
negro en la parte inferior del portaobjetos, el número de la lámina que sí lo
posee.
12. Registrar en libro “Solicitud técnicas inmunohistoquímicas” la fecha de
entrega y el nuevo número asignado.
13. Realizar la entrega de las láminas de IHQ junto a su H/E y la solicitud al
patólogo correspondiente.
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PROTOCOLO MANUAL DE INMUNOHISTOQUÍMICA PARA HER-2
HERCEPTEST (KIT DAKO)
1. Cortes de 3-4 µm. Secar a 60ºC por 1 hora o a 37ºC toda la noche.
2. Desparafinar cortes en 2 baños de xilol por 5 minutos cada uno. (Usar Xilol
nuevo)
3. Hidratar en: 2 baños de alcohol 100º por 3 min c/u 2 baños de alcohol 95º por 3 min c/u Baño de agua corriente por 30 segundos
4. Recuperación Antigénica en baño termorregulado: Diluir 1:10 solución recuperadora (epitope retrieval solution 10X, Dako). Precalentar la solución recuperadora, hasta que alcance los 90-95ºC. Constatar la Tº interior del copling y colocar los portaobjetos en solución recuperadora.
5. Incubar por 40 min a 95-99ºC.
6. Dejar enfriar por al menos 20 minutos a Tº ambiente (20ºC)
7. Lavar en buffer (1:10) 2 veces por 3 min c/u.
8. Demarcar zona de tejido con lápiz hidrófobo y mantener cortes en buffer de
lavado (Wash Buffer RTU).
9. Bloqueo de peroxidasa por 5 minutos a Tº ambiente (20ºC) (Kit Dako).
10. Realizar 2 lavados de 3 min c/u con buffer de lavado.
11. Incubación con Ac primario: por 30 min a Tº ambiente (Kit Dako).
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12. Realizar 2 lavados de 3 min c/u con buffer de lavado.
13. Incubar con reactivo de visualización por 30 min a Tº ambiente (Kit Dako).
14. Realizar 5 lavados de 2 min c/u con buffer de lavado.
15. Revelar con solución buffer – sustrato más DAB: 1 gota cromógeno en 1
ml de buffer DAB (Kit Dako).
16. Lavado abundante en agua destilada
17. Contraste: Hematoxilina 3 minutos Lavado agua corriente 1 minuto Alcohol ácido 1% por 1-2 segundos Lavado agua corriente 1 minuto Acido Bórico 2% (bórax) 1 minuto Deshidratar en 2 baños de alcohol, uno 95º y otro de 100º. Aclarar en 3 baños de Xilol. Montaje con medio hidrófobo.
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PROTOCOLO EN INMUNOTINCIONADOR (immunostainer)AUTOMÁTICO BENCHMARK PARA HER-2
HERCEPTEST (KIT DAKO)
1. Realizar cortes de 3-4 µm en portaobjetos con carga positiva (Superfrost
Thermo). Secar a 60ºC por 1 hora o a 37ºC toda la noche.
2. Generar etiquetas con el número nuevo asignado al caso. La etiqueta
señala: Número Caso, Anticuerpo y clon, Patólogo solicitante, TM
responsable. Además lleva su código de barras que indicará a la máquina
qué protocolo debe seguir.
3. Orientar y pegar las etiquetas en la zona esmerilada procurando que quede
centrada y alineada con los bordes.
4. Abrir la compuerta de la máquina y colocar los portaobjetos. Debe contar el
total de láminas ya que al ejecutar el programa, se le preguntará este
número. Cerrar la compuerta.
5. Colocar los reactivos necesarios:
a. Kit revelado libre de biotina
b. Kit de contraste
c. Anticuerpo HER2-herceptest (PREP-KIT)
6. Asegurarse que los líquidos necesarios para el proceso estén a nivel
aceptado.
a. EZ-PREP (reactivo desparafinante libre de xilol)
b. LCS (liquid cover slip, aceite protector de tejido)
c. Buffer
d. CC2 (líquido para recuperación a pH 6)
7. Comenzar proceso en botón “EJECUTAR” en programa VENTANA.
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8. El programa VENTANA le entregará el tiempo que demorará el proceso
completo.
9. Una vez terminado el proceso abrir la compuerta de la máquina y extraer
los portaobjetos, con mucho cuidado, colocándolos en un carro de tinción.
10. Lavar las láminas con abundante agua corriente en movimiento, para
eliminar el aceite que las cubre (LCS),con detergente antigrasa disuelto en
agua
11. Deshidratar manualmente en dos baños de alcoholes de 99° o 100°
12. Aclarar en 3 baños de Xilol cuidando de no mojar las etiquetas ya que se
deshace el pegamento.
13. Montaje Manual con medio hidrófobo.
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PROTOCOLO MANUAL DE INMUNOHISTOQUÍMICA PARA RE y RP
1. Cortes de 3-4 µm. Secar a 60ºC por 1 hora o a 37ºC toda la noche.
2. Desparafinar cortes en 2 baños de xilol por 5 minutos cada uno. (Usar Xilol
nuevo)
3. Hidratar en: 2 baños de alcohol 100º por 3 min c/u 2 baños de alcohol 95º por 3 min c/u Baño de agua corriente por 30 segundos
4. Recuperación Antigénica en Pascal:
Diluir 1:10 solución recuperadora (epitope retrieval solution 10X, Dako).
5. Programar Pascal para que las muestras estén por 5 min a 125ºC y por 1 min a 90ºC.
6. Dejar enfriar por 20 minutos a Tº ambiente (20ªC).
7. Lavar en Wash buffer (1:10) 2 veces por 3 min c/u.
8. Demarcar zona de tejido a estudio con lápiz hidrófobo y mantener cortes en
buffer de lavado ( Wash Buffer )
9. Bloqueo de peroxidasa por 5 minutos a Tº ambiente.
10. Lavar en Wash buffer (1:10) 2 veces por 3 min c/u.
11. Incubación con Ac primario (RE/RP): por 30 min a Tº ambiente. Los Anticuerpos primarios serán diluidos a concentración previamente acordada, en UltraPlus Ab Diluent (Labvision)
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12. Lavar en Wash Buffer 2 veces por 3 min c/u.
13. Incubar con reactivo de visualización por 30 min a Tº ambiente.
14. Lavar en Wash Buffer 2 veces por 3 min c/u.
15. Revelar con DAB: 1 gota de cromógeno en 1 ml de buffer DAB (Labvision)
16. Lavado abundante en agua destilada 17. Contraste:
Hematoxilina 3 minutos Lavado agua corriente 1 minuto Alcohol ácido 1% por 1-2 segundos Lavado agua corriente 1 minuto Acido Bórico 2% (bórax) 1 minuto Deshidratar en 2 baños de alcohol, uno 95º y otro de 100º. Aclarar en 3 baños de Xilol. Montaje con medio hidrófobo.
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PROTOCOLO EN INMUNOTINCIONADOR (immunostainer)
AUTOMÁTICO BENCHMARK PARA RE (SP1) y RP (1E2) VENTANA
1. Realizar cortes de 3-4 µm en portaobjetos con carga positiva (Superfrost
Thermo). Secar a 60ºC por 1 hora o a 37ºC toda la noche.
2. Generar etiquetas con el número nuevo asignado al caso. La etiqueta
señala: Número Caso, Anticuerpo y clon, Patólogo solicitante, TM
responsable. Además lleva su código de barras que indicará a la máquina
qué protocolo debe seguir.
3. Orientar y pegar las etiquetas en la zona esmerilada procurando que quede
centrada y alineada con los bordes.
4. Abrir la compuerta de la máquina y colocar los portaobjetos. Debe contar el
total de láminas ya que al ejecutar el programa, se le preguntará este
número. Cerrar la compuerta.
5. Colocar los reactivos necesarios:
a. Kit revelado libre de biotina
b. Kit de contraste
c. Anticuerpo RE (SP1) ó RP (1E2) ambos VENTANA
6. Asegurarse que los líquidos necesarios para el proceso estén a nivel
aceptado.
a. EZ-PREP (reactivo desparafinante libre de xilol)
b. LCS (liquid cover slip, aceite protector de tejido)
c. Buffer
d. CC1 (líquido para recuperación a pH 8)
7. Comenzar proceso en botón “EJECUTAR” en programa VENTANA.
8. El programa VENTANA le entregará el tiempo que demorará el proceso
completo.
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9. Una vez terminado el proceso abrir la compuerta de la máquina y extraer
los portaobjetos, con mucho cuidado, colocándolos en un carro de tinción.
10. Lavar las láminas con abundante agua corriente en movimiento, para
eliminar el aceite que las cubre (LCS),con detergente antigrasa disuelto en
agua
11. Deshidratar manualmente en dos baños de alcoholes de 99° o 100°
12. Aclarar en 3 baños de Xilol cuidando de no mojar las etiquetas ya que se
deshace el pegamento.
13. Montaje Manual con medio hidrófobo.
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PROTOCOLO MANUAL INMUNOHISTOQUÍMICA PARA CD-10
1. Desparafinar cortes de 3-4 µm en 2 baños de xilol por 5 minutos cada uno. (Usar Xilol nuevo)
2. Hidratar en:
2 baños de alcohol 100º por 3 min c/u 2 baños de alcohol 95º por 3 min c/u Baño de agua corriente por 30 segundos
3. Lavado en agua destilada.
4. Recuperación Antigénica en baño termorregulado:
Diluir 1:10 solución recuperadora (EDTA)
5. Incubar por 40 minutos a 90-95ºC.
6. Luego se deja enfriar por 20 minutos a Tº ambiente.
7. Lavar en agua destilada por 1 minuto.
8. Demarcar zona de tejido a estudio con lápiz hidrófobo y mantener cortes en buffer de lavado (wash buffer RTU)
9. Bloqueo: con H2O2 3% por 5 minutos a Tº ambiente.
10. Realizar 5 lavados de 2 min c/u con buffer de lavado.
11. Incubación con Ac primario: por 60 min a Tº ambiente.
12. Realizar 5 lavados de 2 min c/u con buffer de lavado.
13. Incubar con Ac secundario- biotinilado (diluido 2:1 en buffer PBS): 30 min a
Tº ambiente.
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14. Realizar 5 lavados de 2 min c/u con buffer de lavado.
15. Incubar con Streptavidina-Peroxidasa (diluido 2:1 en buffer PBS): 30 min a
Tº ambiente.
16. Realizar 5 lavados de 2 min c/u con buffer de lavado.
17. Revelar con DAB: 2 gotas de cromógeno en 1,5 ml de buffer DAB (Labvision).
18. Lavado abundante en agua destilada.
19. Contraste: Hematoxilina 3 minutos Lavado agua corriente 1 minuto Alcohol ácido 1% por 1-2 segundos Lavado agua corriente 1 minuto Acido Bórico 2% (bórax) 1 minuto Deshidratar en 2 baños de alcohol, uno 95º y otro de 100º. Aclarar en 3 baños de Xilol. Montaje con medio hidrófobo.
PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE
TÉCNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS PROTOCOLO DE TÉCNICAS
Nº Resolución: 1238 26 Agosto de 2011
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PROTOCOLO EN INMUNOTINCIONADOR AUTOMÁTICO
(immunostainer) BENCHMARK PARA CD10
1. Realizar cortes de 3-4 µm en portaobjetos con carga positiva (Superfrost
Thermo). Secar a 60ºC por 1 hora o a 37ºC toda la noche.
2. Generar etiquetas con el número nuevo asignado al caso. La etiqueta
señala: Número Caso, Anticuerpo y clon, Patólogo solicitante, TM
responsable. Además lleva su código de barras que indicará a la máquina
qué protocolo debe seguir.
3. Orientar y pegar las etiquetas en la zona esmerilada procurando que quede
centrada y alineada con los bordes.
4. Abrir la compuerta de la máquina y colocar los portaobjetos. Debe contar el
total de láminas ya que al ejecutar el programa, se le preguntará este
número. Cerrar la compuerta.
5. Colocar los reactivos necesarios:
a. Kit revelado libre de biotina
b. Kit de contraste
c. Anticuerpo CD10 (PREP-KIT)
6. Asegurarse que los líquidos necesarios para el proceso estén a nivel
aceptado.
a. EZ-PREP (reactivo desparafinante libre de xilol)
b. LCS (liquid cover slip, aceite protector de tejido)
c. Buffer
d. CC1 (líquido para recuperación a pH 8)
7. Comenzar proceso en botón “EJECUTAR” en programa VENTANA.
8. El programa VENTANA le entregará el tiempo que demorará el proceso
completo.
PROCEDIMIENTO DE SOLICITUD Y ENTREGA DE
TÉCNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS PROTOCOLO DE TÉCNICAS
Nº Resolución: 1238 26 Agosto de 2011
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9. Una vez terminado el proceso abrir la compuerta de la máquina y extraer
los portaobjetos, con mucho cuidado, colocándolos en un carro de tinción.
10. Lavar las láminas con abundante agua corriente en movimiento, para
eliminar el aceite que las cubre (LCS),con detergente antigrasa disuelto en
agua
11. Deshidratar manualmente en dos baños de alcoholes de 99° o 100°
12. Aclarar en 3 baños de Xilol cuidando de no mojar las etiquetas ya que se
deshace el pegamento.
13. Montaje Manual con medio hidrófobo.
