DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE METABOLITOS SECUNDARIOS

PRESENTES EN LA HOJA DE LIMA (Citrus aurantium)

Domínguez Balan O.; Justiniano Canul D.; Keb Tamayo E.; Martínez Arcos F.;

Quevedo Castrejón C.; Trujillo López A.; Wicab Che G.

Caracterización biológica: Biólogo Ricardo Efraín Góngora Chin

TÉCNICO DOCENTE DEL CENTRO DE ESTUDIOS DE DESARROLLO SUSTENTABLE Y APROVECHAMIENTO DE LA VIDA SILVESTRE (CEDESU)

RESUMEN

El trabajo siguiente tuvo como objetivo la determinación cualitativa de los metabolitos secundario de los extractos de la hoja de Citrus aurantium (lima dulce), se realizaron diferentes extracciones con alcohol y agua a distintas temperaturas, para determinar de forma cualitativa los metabolitos secundarios presentes en la C.aurantium (lima dulce), por diferentes métodos o técnicas, como la prueba de sudan y método se shinoda, entre otras. Obteniendo como resultado del macerado acuoso, la presencia de azucares reductores, de mucilagos, antocianidinas, flavonoides, fenoles y taninos.En los de procedencia alcohólica se encontró la presencia de: aminas, terpenos y esteroides, saponinas, fenoles y taninos.Al término de las técnicas de determinación cualitativa de los metabolitos presentes en las distintas maceraciones de la hoja C.aurantium, los cuales, dieron como resultado una mayor presencia de metabolitos secundarios en los extractos.

Palabras clave: Citrus aurantium; extracto; metabolitos secundarios; análisis cualitativo;

INTRODUCCION

La medicina tradicional desde hace muchos años ha sido de gran importancia para

el ser humano, este es un conjunto de sistemas médicos que cambia y perdura a

pesar del avancetecnológico, teniendo un fin terapéutico a partir de la herbolaria,

el uso de productos animales y minerales; diferentes tipos de masajes y

punciones. Suponen un amplio conocimiento que constituye la base de la materia

médica.

Los cítricos existen desde hace 20 millones de años y su origen está en el sudeste

asiático, Persia (Irán), Malasia. De ahí durante la edad media y con las cruzadas

llegaron a España y al norte de África. Desde entonces se han extendido por todo

el mundo y dependiendo de las regiones han evolucionado de diferentes maneras

y por lo tanto obteniendo diferentes variedades.La lima es una fruta extravagante y

de un agradable aroma perteneciente a la familia de los cítricos. Existen muchas

variedades de lima pero generalmente son de pequeño tamaño de color verde o

amarillo. Su sabor es entre ácido y dulce, según la variedad, a veces es amargo.

Los árbolesde tamaño variable y de diferente forma, según la especie en

determinada región. Este es un árbol pequeño con unas espinas muy puntiagudas.

Las hojas son ligeramente onduladas y el soporte que une a la hoja con el tallo es

alado.

Esta búsqueda puede ser extendida a estudios farmacológicos y también podría

verse la oportunidad de producción industrial en los casos que los principios

activos hallados sean debidamente aceptados.

Debido al interés actual se identificara preliminarmente los metabolitos

secundarios que se hallan en los extractos acuosos y etanólicos de la hoja de

Citrus aurantium(lima) recolectado del pueblo de Pocboc perteneciente al

municipio de Hecelchakán,Campeche.

MARCO TEORICO

Los citricos son el principal cultivo frutal del mundo. Se estima que en la actualidad

el cultivo de los citricos ocupa una superficie de 7,4 millones de hectareas en las

regiones tropicales y subtropicales del planeta, aproximadamente entre los 40o de

latitud Norte y los 40o de latitud Sur, aunque las principales areas de produccion

se situan entre los 20o Norte y los 20o Sur.

La produccion de citricosesta en continuo crecimiento y se estima que en el ano

2007 se superaron los 110 millones de toneladas de frutos producidos

(FAO,2007).

Los principales paises productores de citricos en el mundo, de mayor a menor,

son: Brasil, EE.UU., China, Mexico y Espana. En Brasil y Florida (primera zona

productora de EE.UU.) la citricultura esta orientada a la produccion de naranjas

para laobtencion de zumo concentrado, al contrario que en Espana donde la

mayoria de la produccion es destinada al mercado de fruta fresca.

Espana es lider mundial en exportaciones de citricos frescos, sobre todo para el

mercado de las mandarinas y clementinas donde supera la cantidad de 1,5

millones de toneladas de producto exportado anualmente (casi el 75% de la

produccion total de mandarinas en Espana). En total Espana exporta mas del 50%

de su produccion de citricos, lo que nos da una idea de la importancia economica

que representa este cultivo para el país.

METABOLITOS PRIMARIOS:

Son los productos químicos necesarios para la vida, resultantes del metabolismo

vital de todo ser vivo, son: los carbohidratos, los lípidos, las proteínas y los ácidos

nucleicos.

METABOLITOS SECUNDARIOS:

Otros compuestos llamados metabolitos secundarios son subproductos de rutas

metabólicas normales que ocurren en ciertas especies, siendo particulares dentro

de un grupo taxonómico, estado de vida o tejido presentando una distribución

restringida dentro del Reino Vegetal dando origen a la quimiotaxonomía. Su

ocurrencia depende de condiciones externas tales como ataques de patógenos,

predadores, cambios térmicos o lumínicos, deficiencias nutricionales o presencia

de otros organismos intra o interespecíficos. El metabolismo secundario es una

característica fundamental de la especialización, es decir que el compuesto

resultante, puede no ser importante para la célula pero sí para el organismo como

un todo. Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un

papel esencial en los procesos fisiológicos del organismo. Algunos metabolitos

secundarios son “residuos bioquímicos”, es decir, productos de actividad

enzimática de substratos no apropiados o productos de destoxificación o desecho

de importancia para la supervivencia y la buena condición de los organismos. Con

pocas excepciones, los metabolitos secundarios pueden clasificados dentro de

cinco grupos, de acuerdo con su base biosintética: fenilpropanos, acetogeninas,

terpenoides, esteroides y alcaloides.

RECONOCIMIENTOS DE METABOLITOS:

El reconocimiento de metabolitos secundarios se realiza por medio de pruebas

fitoquímicas preliminares, las cuales son una prueba química de caracterización

consistente en una reacción química que produce alteración rápida en la

estructura molecular de un compuesto, por ejemplo, la modificación de un grupo

funcional, la apertura de un sistema anular, la formación de un aducto o un

complejo, lo cual da por resultado una manifestación sensible como el cambio de

un color, la formación de un precipitado o el desprendimiento de un gas, dándonos

indicios de la presencia o ausencia de un metabolito secundario en particular.

A continuación se presenta el fundamento de algunas pruebas que se utilizaron

en la metodología.

El reactivo de Fehling se utiliza para la detección de sustancias reductoras,

particularmente azúcares reductores. Se basa en el poder reductor del grupo

carbonilo de un aldehído que pasa a ácido reduciendo la sal cúprica de cobre (II),

en medio alcalino, a óxido de cobre (I). Éste forma un precipitado de color rojo. Un

aspecto importante de esta reacción es que la forma aldehído puede detectarse

fácilmente aunque exista en muy pequeña cantidad. Si un azúcar reduce el licor

de Fehling a óxido de cobre (I) rojo, se dice que es un azúcar reductor.

La prueba de nihidrina se utiliza para la detección de aminoácidos, actualmente

acoplada a sistemas de valoración automática. La ninhidrina (hidrato de

tricetohidrindeno) es un oxidante energético que por una desaminación oxidativa

de los aminoácidos conduce a la formación del aldehído correspondiente, con

liberación de amoniaco y gas carbónico y formación de la ninhidrina reducida o

hidrindrantina. La molécula de hidridantina, en presencia de otra de ninhidrina,

condensa a través del amoniaco produciendo una estructura denominada

indanona o púrpura de Ruhemann, manifestando un color rojizo, excepto para la

prolina, hidroxiprolina y en menor medida para la histidina. Presenta su máximo de

absorbancia a los 570 nm, exceptuando los tres aminoácidos reseñados

anteriormente.

La presencia de mucilagos permite reconocer en los extractos de vegetales la

presencia de esta estructura tipo polisacárido, que forma un colide hidrófilo de alto

índice de masa que aumenta la densidad del agua donde se extrae.

Las saponinas son una clase de compuestos químicos, uno de muchos

metabolitos secundarios que se encuentran en fuentes naturales, con saponinas

que se encuentran en abundancia en particular, varias especies de plantas. Más

específicamente, son glucósidos anfipáticas agrupados, en términos de la

fenomenología, por el jabón-como la formación de espuma que producen cuando

se agitan en soluciones acuosas, y, en términos de estructura, por su composición

de uno o más restos hidrófilos glucósido combinado con un triterpeno lipófilo

derivado.

El comercio mundial de citricos experimento un fuerte incremento a partir de

mediados del siglo XIX, concretandose en las zonas donde el cultivo podia

desarrollarse con facilidad gracias a la climatologia. A finales de este mismo siglo

el comercio de Espana, sobre todo con Francia, comienza a ser relevante y la

citricultura se trasforma en una actividad lucrativa

DESARROLLO

Materiales y métodos.

Se recolectaron 900 gr de la hoja de C. aurantium aleatoriamente a una altura de 3m aproximadamente, se secó el material orgánico como se muestra en la figura 1, teniendo un peso inicial de 184gr y posterior al

secado un peso de 106.35 gr, dando así un porcentaje de humedad de 55.69 %. Posterior al secado se trituro el material orgánico y se sometió a maceración estática por una semana añadiendo 10 gr de la

muestra y 100 ml de diferentes solventes: Agua fría, agua caliente, alcohol frío y alcohol caliente (figuras 2 y 3)

Se realizaron una serie de pruebas para determinar las propiedades que tiene el extracto de la hoja de Citrus aurantium (lima dulce), como son la determinación de azúcares reductores, la determinación de aminas, los mucílagos, principios amargos o astringentes, antocianidinas, determinación de terpernos o esteroides, saponinas, glucósidos cardiotónicos, determinación de alcaloides, quinonas y agrupamientos lactónicos.

Para la determinación de azucares reductores se utilizó la prueba de Fehling. Se realizó tomando una gota del extracto de la maceración de la hoja de Citrus aurantium, se trató con una gota de Fehling A y una gota de deFehling B y se sometió a baño maría por tres minutos.

La prueba de aminas se determinó mediante la técnica de la Ninhidrina, se tomaron dos gotas del extracto y se le añadieron 2 gotas de ninhidrina al 5 % en etanol, se sometió a baño maría por cinco minutos.

La determinación de los mucílagos se vio mediante la viscosidad que presentó el extracto.

Para el ensayo de los principios amargos o astringentes se colocó una gota de extracto en placas ELISA y

se diluyó con 5 gotas de agua, se probó el resultado.

La identificación de antocianidinas se realizó depositando dos gotas del extracto en un tubo de ensayo y se llevó a sequedad; el residuo se diluyó en 10 gotas de HCL 2N. Posteriormente se colocó el tubo a baño maría durante 15 minutos y para terminar se le agregaron dos gotas de alcohol amílico.

La prueba de la triterpenos y esteroides se realizó agregando en un pozo de la placa de ELISA 2 gotas del extracto con 2 gotas de cloroformo, posteriormente se le añadió 2 gotas de anhídrido acético. Se le adicionó 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado.

En el ensayo de saponinas, en un tubo de ensayo se adicionó 1 ml del extracto con 1 ml de agua destilada y se agitó la mezcla durante dos minutos.

Para los glucósidos cardiotónicos se agregó 2 gotas del extracto las placas de ELISA se mezcló con 2 gotas de ácido 3,5 dinitrobenzoico al 2% en metanol y 2 gotas de Hidróxido de potasio en agua.

La prueba de Sudan se usó para determinar lípidos y aceites esenciales, se realizó extrayendo 0.5 ml del extracto y adicionándolo en un tubo de ensaye. Se le añadió 0.5 ml de Sudan III al 0.6% en glicerina-agua 1:1.

Para la determinación de flavonoides fue elegido el método de Shinoda. En un tubo de ensaye se añadió 1 ml de agua destilada con 1 ml de extracto, luego se adicionó 0.5 ml de ácido clorhídrico y un pequeño trozo de magnesio metálico. Despues de haber acabado la reacción se le adicionó 0.5 ml de ácido amílico y se agitó.

Para la detección de fenoles y taninos en un tubo de ensaye dispusimos 0.5 ml del extracto, se le añadió 0.25 ml de cloruro férrico al 5% en solución salina. Al extracto acuoso se le adicionó acetato de sodio previo al ensayo. En la determinación especifica de taninos, de la prueba anterior extraer 0.5 ml del extracto y se adicionó 0.5 ml de gelatina al 1% en cloruro de sodio al 0.85%.

Para la detección de los alcaloides utilizamos el método de Dragendorff,

ocupamos un tubo de ensaye para la determinación añadiendo 0.5 ml de extracto al igual que 0.5 ml del reactivo de Dragendorff.

Posteriormente para la especificación de quinonas; en un tubo de ensaye se agregó 0.5 ml del extracto y se diluyo en proporción 1:1 en cloroformo luego se agito esperamos un momento y se agregó 0.5 ml de hidróxido de sodio al 5% y se agito vigorosamente.

Para la identificación de los agrupamientos lactonicos; se agregó a un tubo de ensayo 0.5 ml del extracto obtenido a la cual se le agrego 0.5ml de ácido picrico al 1% en etanol y 0.5 ml de hidróxido de sodio al 10% en agua, en esta identificación solo se observó el cambio de color y la formación de un precipitado rojo.

Figura 1.-Hojas de Citrus aurantium después del secado

Figura 2.- Maceración estática de la hoja de C. arantium en agua caliente y fría.

Figura3.- Maceración estática de la hoja de C. arantium en alcohol caliente y frío

RESULTADOS

HOJA DE LIMA (Citrus aurantium)

PruebaAgua

calienteAgua fría

Alcohol

calienteAlcohol frio

PRUEBA DE

FEHLING+ + - -

PRUEBA

NINHIDRINA

(AMINAS)

- - + +

PRUEBA DE

MUCÍLAGOS+ + - -

PRUEBA DE

ANTOCIANIDINA

S

+ + - -

PRINCIPIOS Amargo Amargo Astringente Astringente

AMARGOS Y

ASTRINGENTES

PRUEBA DE

TERPENOS Y

ESTEROIDES

- - + +

PRUEBA DE

SAPONINAS- - + +

PRUEBA DE

GLÚCOSIDOS

CARDIOTÓNICOS

- - - -

PRUEBA DE

LIPIDOS Y

ACEITES

ESENCIALES

- - - -

PRUEBA DE

FLAVONOIDES+ + - -

PRUEBA DE

FENOLES Y

TANINOS

+ + + +

PRUEBA DE

ALCALOIDES+ + + +

PRUEBA DE

QUINONAS+ + + +

PRUEBA DE

AGRUPAMIENTO

LACTÓNICOS

+ + - -

DISCUSION

Los cítricos son una parte fundamental para la elaboración de medicamentos,ya

que constituyen una principal fuente de metabolitos secundarios, como son las

cumarinas, alcaloides, aceites esenciales y flavonoides, ya que utilizan estos para

su protección y crecimiento.

Los alcaloides son de gran interés porque se les atribuye propiedadesanalgésicas

como: anestesia (morfina y tubocuraina), estimulantes (cafeína, nicotina).

Los flavonoides por tener un mayor interés por la comunidad científicason una de

las pruebas que hicimos para ver si había presencia de este en los extractos

obteniendo positivo en la técnica tanto para este metabolito tanto para los

alcaloides.

Estos datos obtenidos son aceptables porque se han encontrado en otras

investigaciones como las publicadas en revistas cubanas sobre plantas.

CONCLUSION

Las diferentes determinaciones realizadas pueden servir para saber los

metabolitos presentes en Citrus aurantium (lima dulce), son muy importantes para

posteriores investigaciones como son las cuantificaciones de estos, también para

efectos farmacológicos que pueden aliviar en el organismo algún padecimiento o

enfermedad.

Estos metabolitos pueden ser de utilidad para crear nuevos farmacoforos aislando

la molecula activa o principio activo y posteriormente tener medicamentos para el

tratamiento.

BIBLIOGRAFIA

Avendaño,C, (2001). Introducción a la química farmacéutica. Madrid: Mc Graw Hill

Kuklinskli,c. (2000). Farmacognosia, estudios de las drogas y sustancias

medicamentosas de origen natural. Omega

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