PROTOCOLO 11-12-10 v. final · _____Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica...

___________Efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en hepatopatía crónica __________

1

Universidad Dr. José Matías Delgado

Facultad Ciencias de la Salud

Dr. Luis Edmundo Vásquez Escuela de Medicina

TESIS

Para optar al título de: Doctor en Medicina

“EFECTO HEPATOPROTECTOR DE ACIDO ETILENDIAMINOTETRACÉTICO Y SELENATO

DE SODIO EN UN MODELO DE DAÑO HEPÁTICO CRÓNICO EN RATONES”

Investigadores:

Br. Juan Francisco Granados Colocho Br. Pedro Eduardo Sobenes Romero

Asesora:

Lic. Teresita Bertoli de Masferrer

Patólogo: Dr. José Nicolás Astacio Soria

2010


2

AGRADECIMIENTOS ESPECIALES A

A DIOS que siempre ha estado con nosotros y nos ha mostrado la luz en momentos de oscuridad,

a nuestros padres que nos han apoyado y acompañado en cada sacrificio durante todos estos años,

a nuestros catedráticos por su empeño en comunicarnos nuevos conocimientos,

a Lic. Teresita Bertolí, al Dr. Nicolás Astacio y al Dr. Carlos Flores, por habernos apoyado durante la realización de este trabajo, así como su

esfuerzo por cultivar en nosotros el espíritu de investigación, contribuyendo a enriquecer el conocimiento científico nacional.


3

INDICE PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. ........................................................................ 6

PREGUNTA. .................................................................................................................... 8

JUSTIFICACION ............................................................................................................. 9

OBJETIVOS ................................................................................................................... 11

OBJETIVO GENERAL: ........................................................................................... 11

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ................................................................................. 11

MARCO TEÒRICO ....................................................................................................... 12

FISIOLOGÍA HEPÁTICA ......................................................................................... 13

CIRROSIS HEPÁTICA ............................................................................................ 15

ETAPAS DE LA ACTIVACIÓN DE HSC .............................................................. 16

AGENTES ASOCIADOS A DAÑO HEPÁTICO .................................................. 19

TIOACETAMIDA ................................................................................................. 21

ESTRÉS OXIDATIVO EN HEPATOPATÍAS ...................................................... 24

HIERRO ..................................................................................................................... 29

ORIENTACIONES TERAPÉUTICAS .................................................................... 34

NUEVAS OPCIONES TERAPÉUTICAS EN ESTUDIO .................................... 35

ANTIOXIDANTES .................................................................................................... 35

SELENIO ................................................................................................................ 36

QUELANTES DE HIERRO ..................................................................................... 38

MÉTODOS PARA EVALUAR DAÑO HEPÁTICO ................................................... 42

HIPOTESIS DE TRABAJO: ........................................................................................ 46

HIPOTESIS ESTADISTICAS: ..................................................................................... 46


4

H1 ............................................................................................................................... 46

H0 ............................................................................................................................... 46

DELIMITACIÓN DEL TEMA ........................................................................................ 46

METODOLOGIA ........................................................................................................... 47

TIPO DE ESTUDIO .................................................................................................. 47

POBLACIÓN Y MUESTRA..................................................................................... 47

DIETA ......................................................................................................................... 47

DISEÑO EXPERIMENTAL ..................................................................................... 48

CRITERIOS DE INCLUSION ............................................................................... 50

CRITERIOS DE EXCLUSION. ............................................................................ 50

OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES DEPENDIENTES ..................... 51

ESTANDARIZACIÓN DE MODELO DE INDUCCIÓN DE DAÑO CRÓNICO .... 52

EFECTO HEPATOPROTECTOR DEL EDTA Y EL SELENIO. ............................ 53

SOLUCIONES ............................................................................................................... 54

DETERMINACIÓN DE LA SOBREVIDA .................................................................. 55

ANÁLISIS DE MUESTRAS ......................................................................................... 55

ANÁLISIS BIOQUÍMICOS ...................................................................................... 55

ANÁLISIS MACROSCÓPICO ................................................................................ 55

ANÁLISIS MICROSCÓPICO .................................................................................. 56

MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS ..................... 56

PRESENTACIÓN DE LA INFORMACIÓN. .............................................................. 57

CONSIDERACION ETICAS. ....................................................................................... 57

RESULTADOS .............................................................................................................. 58


5

ESTANDARIZACIÓN DEL MODELO DE DAÑO HEPÁTICO CRÓNICO

INDUCIDO POR TIOACETAMIDA EN RATONES ............................................. 58

ANÁLISIS MICROSCÓPICO DEL MODELO ...................................................... 59

EVALUACIÓN DEL EFECTO HEPATOPROTECTOR DEL EDTA Y

DEL SeNa .................................................................................................................. 60

HALLAZGOS MACROSCÓPICOS ....................................................................... 60

ANÁLISIS MICROSCÓPICO .................................................................................. 61

DEGENERACIÓN HEPATOCÍTICA, NECROSIS E HIPEREMIA PASIVA

CRÓNICA .............................................................................................................. 61

HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS ................................................................ 63

ANALISIS BIOQUÍMICOS ..................................................................................... 64

HEPATOPROTECCIÓN ......................................................................................... 65

DISCUSIÓN ................................................................................................................... 69

Modelo experimental de daño hepático crónico mediante

Tioacetamida en Ratones. ...................................................................................... 69

Evaluación del efecto hepatoprotector del EDTA y del SeNa .......................... 71

CONCLUSIONES ......................................................................................................... 75

RECOMENDACIONES ................................................................................................ 76

BIBLIOGRAFIA: ............................................................................................................ 77


6

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

El Fallo Hepático se define como una enfermedad que resulta de la imposibilidad

de las células hepáticas de mantener una adecuada función. En ocasiones el fallo

multiorgánico acompaña a la falla hepática aguda, y los índices de mortalidad

varían dependiendo el soporte vital desde un 50% a un 90%.

El daño hepático crónico puede ser producido por múltiples causas entre estas

tenemos

• Esteato - Hepatitis (Alcohólica y No Alcohólica).

• Hepatitis Crónica (Virus, autoinmune, medicamentos).

• Colestasis Crónica (CBP, CEP, otros).

• Enfermedades Metabólicas.

• Hígado Congestivo Crónico.

• Daño Hepático Crónico Criptogénico.

Esta enfermedad afecta a un amplio grupo de la población y posee diversas

complicaciones. Sabemos que la progresión de la hepatopatía crónica puede ser

retardada, pero difícilmente detenida. En la mayoría de los casos, la acción

terapéutica está limitada al manejo de las complicaciones, con especial énfasis en

la detección de factores reversibles que producen descompensación.

Actualmente este problema es abordado con el uso de fármacos, restricciones

alimenticias en algunos casos y en otros con adiciones alimentarías dependiendo

la evaluación nutricional del paciente y el nivel de progresión de la enfermedad.


7

Algunos estudios1, 2 demuestran los beneficios que tiene la disminución de los

niveles de hierro sérico ya sea mediante la dieta1 o mediante el uso de un agente

quelante1 como la deferoxamina y su contribución en el proceso de curación de la

hepatopatía crónica. El hierro es un productor de estrés oxidativo y tiene un papel

muy importante en la progresión de la lesión hepática1 en pacientes con

hepatopatía crónica.1

La actividad oxidativa dañina también puede ser reducida con la utilización de

antioxidantes que ayuden a la disminución del estrés oxidativo a nivel de los

tejidos lo cual produce una respuesta favorable para la disminución de la

progresión de la hepatopatía y para la regresión en algunos casos de la

enfermedad ya establecida.

La terapia quelante de hierro usual con deferoxamina implica un alto costo

económico; así, por ejemplo, la dosis para talasemias de 20-40mg/kg/día, en una

persona de 65kg. a una dosis media equivaldría a 1.95g/día, con precio en el

mercado de $75.73 x cada 2g, representaría aprox. $530/semana. Si se utilizara

Ácido Etilendiaminotetracético, a la dosis máxima de 7000mg/día, con precio de

$30 x cada 100g, sería un total de 49g/semana o $30, representando una

alternativa notablemente económica; por lo que estudios en la utilización de este

quelante tendrían gran valor aplicativo si demuestra su efectividad en patologías

con alto componente oxidativo.3


8

Al momento no está bien definida la importancia de la terapia combinada

mediante un agente quelante de iones bivalentes como el Acido

Etilendiaminotetracético (EDTA) y la administración de un antioxidante como el

selenato de sodio (SeNa) para la reducción del estrés oxidativo logrando mejorar

los índices de curación en daño hepático. Por lo que hemos decidido evaluar el

efecto de la terapia combinada en un modelo de daño hepático crónico en ratones.

PREGUNTA.

¿Cuál es el efecto hepatoprotector del ácido etilendiaminotetracético y el selenato

de sodio en un modelo de daño hepático crónico en ratones?


9

JUSTIFICACION

En todo el mundo las patologías hepáticas crónicas representan un porcentaje de

mortalidad considerable por cada 100,000 hab. Para casos de hepatitis B y C que

van desde un 19.7%—19.5% en la República de Nauru y Sierra Leona, hasta un

0.1% en países como Australia; y un 0.0% en Georgia y Rumania. Así mismo la

cirrosis hepática representa 89.2 muertes por cada 100,000 hab. En Moldavia

parte de Europa Oriental4.

Regionalmente Bolivia es el país más afectado por cirrosis hepática con 27.9

muertes/100,000 hab. , según la OMS, dejando a Haití como el principal afectado

por mortalidad relacionada a hepatitis B con 9.7%. 4

A nivel nacional las patologías hepáticas han demostrado un considerable

incremento desde la década pasada ya que datos a partir de 1997 en cuanto a la

mortalidad general, revelan que dichas patologías representaron el 10º lugar con

142 defunciones de un total de 7,327; un año después en 1998 se encontraron en

8º lugar. Y posteriormente como se aprecia en el siguiente cuadro, tomando en

cuenta los últimos datos de 2008 se ubican en 4º lugar solo superado por VIH,

traumas e insuficiencia renal; representando un no despreciable 8.7% del total. 5

Cuadro 1.-

1997 1998 2008

Mortalidad por Patologías Hepáticas

10º Lugar 8º Lugar 4º Lugar

1.9% 4.4% 8.7%


10

Es por ello que se han estudiado diversas formas para retrasar o detener el

avance de estas patologías variando cada una según su causa; abarcando desde

la utilización de interferones, antivirales, supresión de sustancias hepatotóxicas

hasta el transplante hepático.6 En los últimos años se han detectado nuevas

alteraciones en estas patologías encontrando niveles bajos de selenio y otros

antioxidantes séricos, promoviendo el rol importante de estos en la progresión del

daño hepático.7, 8 Así mismo se ha propuesto recientemente la importancia del

hierro en el estrés oxidativo que ocurre en la cirrosis hepática.1 Ambas nuevas

propuestas en el tratamiento actual de la patología hepática crónica, puesto que a

nivel mundial se encuentran en sus primeros pasos y en nuestra región no existe

indicio de su utilización o comprobación en el avance de dichas patologías; se

vuelve importante tanto para el conocimiento científico mundial y regional el

desarrollo de un modelo que contribuya al posterior desarrollo de nuevas terapias

adyuvantes al tratamiento actual de una de las morbimortalidades mas

importantes de nuestra era.


11

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

Determinar el efecto hepatoprotector del ácido etilendiaminotetracético y el

selenato de sodio en un modelo de daño hepático crónico en ratones.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Estandarizar un modelo de daño hepático crónico en ratones mediante el

uso Tioacetamida (TAA).

• Determinar efecto hepatoprotector del SeNa como agente antioxidante en el

modelo experimental.

• Determinar el efecto hepatoprotector del agente del EDTA como agente

quelante de iones bivalentes en el modelo experimental.

• Determinar el efecto hepatoprotector del EDTA y del SeNa como terapia

combinada en el modelo experimental.

• Evaluar el daño hepático histopatológica y bioquímicamente en muestras

biológicas del modelo experimental.


12

MARCO TEÒRICO

El consumo de alcohol, hepatitis viral y la esteato hepatitis alcohólica son las tres

principales causas de hepatopatía crónica llevando a fibrosis hepática, cirrosis y

cáncer hepático.

A nivel nacional las patologías hepáticas han demostrado un considerable

incremento desde la década pasada ya que analizando datos a partir de 1997 en

cuanto a la mortalidad general en el país, dichas patologías representaron el

décimo lugar con 142 defunciones de un total de 7,327; un año después en 1998

se encontraron en octavo lugar con 308 de un total de 6,953 defunciones. Aún, a

principios de esta década se colocan en noveno lugar del total de defunciones

anuales con un porcentaje de entre 4.03% -- 4.12%. De tal manera que los datos

obtenidos por el ministerio de salud nacional en los años 2006—2007; las

patologías hepáticas han verificado un ascenso hasta ubicarse en el tercer lugar

con un 8 a 9% del total, solo rebasadas por patologías traumáticas y aquellas

relacionadas con el VIH. Y tomando en cuenta los últimos datos de 2008 se ubican

en cuarto lugar solo superado por VIH, traumas e insuficiencia renal;

representando un no despreciable 8.7% del total. 5


13

FISIOLOGÍA HEPÁTICA

Dentro del Hígado existen células parenquimatosas hepáticas que constituyen de

70 a 80% y el 20 a 30% restante son células no parenquimatosas.

Los hepatocitos son células parenquimatosas que se encuentran en la mayor

parte de la masa hepática, y tienen una conformación radial alrededor de las

venas centrales. 9

El hígado es un órgano muy versátil, cuyas funciones principales incluyen:

Metabolismo de carbohidratos: manteniendo la homeostasis de glucosa según las

necesidades, mediante el almacenamiento, síntesis y/o liberación de esta.

Metabolismo graso: realizando oxidación de ácidos grasos, síntesis de colesterol,

triglicéridos, fosfolípidos y lipoproteínas.

Metabolismo proteico: llevando acabo reacciones de transaminación y

desaminación tanto para la síntesis de aminoácidos como para la degradación de

estos. Las reacciones de transaminación están catalizadas por transaminasas

localizadas en el citoplasma del hepatocito: glutamato-oxalacetato tranasminasa

(TGO) y glutamato-piruvato transaminasa (TGP). Las cuales son abundantes en el

corazón y en el hígado, se liberan por las células durante la lesión celular que se

produce en el infarto de miocardio, hepatitis infecciosa u otras lesiones de órgano.

Las determinaciones de estas actividades enzimáticas en suero sanguíneo

pueden utilizarse para el diagnóstico y seguimiento de la evolución de un paciente

durante el tratamiento. Así mismo, en la degradación de aminoácidos es

importante la conversión de amonio a urea para su eliminación.10,11


14

Depósito: el almacenamiento de glucógeno, minerales entre ellos hierro para la

producción de sustancias de coagulación de la sangre y vitaminas liposolubles.

Síntesis de bilis: para la excreción de bilirrubina, colesterol, electrolitos y secreción

de sales biliares. La fosfatasa alcalina, es una enzima localizada en la membrana

celular de canalículos biliares. Niveles séricos muy elevados indican enfermedad

del sistema biliar.

Detoxificación de metabolitos, hormonas y fármacos: mediante reacciones de

modificación o inactivación de sustancias y reacciones de conversión de

liposolubilidad a hidrosolubilidad para su eliminación.12, 11

Los hepatocitos están delimitados por células endoteliales que conforman los

sinusoides, que presentan fenestraciones la cual es una característica

indispensable para mantener el hígado en óptimo estado. El espacio de Disse se

encuentra entre los cordones de hepatocitos y las células sinusoidales.9

En el espacio de Disse, existe una mezcla organizada de proteínas denominada

matriz extracelular (MEC) está en contacto directo con la lámina basal.

Constituyendo aproximadamente 0.5% del peso total del hígado, es el sostén para

las células parenquimatosas y, funciona como refuerzo de la arquitectura del

órgano. Gracias a su disposición no fibrilar hace posible el intercambio de

moléculas, que funciona como un flujo semi continuo fundamental para el

mantenimiento de las funciones hepáticas. Dentro del espacio de Disse, e

incluidas en la MEC, se encuentran las células estearato hepáticas (HSC, por sus

siglas en inglés), también conocidas como células de Ito, representan 15% de la

celularidad total. En estado normal almacenan ésteres de retinol (vitamina A).9


15

La MEC representa el principal sostén de las células hepáticas y permite diversas

funciones. Para asegurar una función satisfactoria, es indispensable un equilibrio

constante entre la síntesis y degradación de dichas proteínas. Esta actividad es

realizada por unas enzimas llamadas metaloproteinasas (MMPs), que tienen la

capacidad de degradar cada uno de los componentes de la MEC.9

Varios factores como toxinas, virus, estrés oxidativo, necrosis, apoptosis y factores

de crecimiento dañan los hepatocitos sus componentes de membrana, producen

metabolitos tóxicos y células inflamatorias que activan las células Kupffer, y

posteriormente estas células Kupffer activadas liberan citoquinas importantes que

activan células HSC en reposo, las cuales tienen un papel importante en la

patogénesis de la cirrosis hepática.

CIRROSIS HEPÁTICA

En la cirrosis hepática13, el colágeno tipo I y III se depositan en los lobulillos

hepáticos creando septos irregulares que pueden llegar a ser muy gruesos y que

seccionan y circundan porciones del lobulillo hepático (nódulos de regeneración).

Esto provoca el reclutamiento de células inflamatorias. Durante la fibrosis hepática

la mayor parte del colágeno depositada es producto de las células HSC. Estas

células sufren un cambio radical llamado activación. Algunos de estos cambios

son que adquieren fenotipo miofibroblástico, proliferan y se convierten en fuertes

productoras de colágeno, TIMP-1 (inhibidor tisular de metaloproteinasas), TIMP-2

y TGF-β (factor de crecimiento transformante-β). 9

La transformación de las células HSC quiescentes hacia células tipo

miofibroblastos, que poseen una capacidad incrementada de síntesis de colágeno,


16

con la expresión de proteína del citoesqueleto α actina de músculo liso, inicia el

proceso crónico de fibrosis hepática, que lleva al estadio fatal de cirrosis hepática.

La expresión de la α actina es característica de las células HSC activadas, por lo

que es considerado un marcador de exacerbación de la fibrosis hepática.14 Son

precisamente las células hepáticas de estearato la principal fuente de colágeno

tipo I en la fibrosis hepática, produciendo también metaloproteinasas de la matriz

que remodelan estas proteínas. 15,16

ETAPAS DE LA ACTIVACIÓN DE HSC

En la primera etapa de activación de la HSC17, conocida como iniciación se

produce una respuesta programada, en donde la célula se encuentra en un estado

pre-inflamatorio, aquí son predominantes los cambios en la expresión génica.9,18

Luego continúa con la fase de perpetuación en la cual se amplifica el fenotipo

activado, y la expresión de citoquinas. La capacidad de respuesta ante las

citoquinas se aumenta de manera autocrina y paracrina; también se acelera la

producción de MEC. La citoquina mitogénica (factor de crecimiento derivado de

plaquetas PDGF) es el estimulo que dirige la producción de la MEC.

En la fibrogénesis se caracteriza por la expresión descontrolada de proteínas de

MEC a cargo de TGF-β; también se secretan diferentes tipos de MMPs

(metaloproteasas), TIMP-1 y TIMP2, lo que conduce a recambio de tipos

moleculares de colágeno.

Las HCS se tornan contráctiles con el fin de aumentar la resistencia portal, esto

impide el flujo sanguíneo portal y causa una contracción hepática en general,

también se libera Endotelina-1 (ET-1) que contribuye a este fenómeno. Otros


17

fenómenos observados son la liberación del factor de crecimiento de hepatocitos

(HGF), quimiotaxis y apoptosis, fenómenos que se atribuyen principalmente al

proceso de regeneración hepática y mecanismos de remoción de células HSC

activadas.9

Es por esto que la cirrosis se define por sus hallazgos histológicos, nódulos de

hepatocitos en regeneración y la deposición anormal de tejido conectivo dentro y

alrededor de los nódulos (fibrosis). En algunas ocasiones aunque el daño que

causo la fibrosis ceda o desaparezca, la fibrosis puede ser irreversible. Si las

fenestraciones sinusoidales son obliteradas esto causa una obstrucción del

espacio Disse, y el reemplazo de los canales vasculares, por lo que se aumenta la

resistencia al flujo sanguíneo. La elevación de presión resultante causa un "Shunt"

del flujo portal alrededor del hígado, lo que causa hipertensión portal. Además la

fibrosis previene el intercambio de nutrientes y metabolitos.

Otros estudios indican que la mitocondria también se ve afectada y vulnerable al

daño inducido por las especies reactivas de oxígeno, y los productos de la

peroxidación lipídica; sin embargo, estudios sobre disfunción mitocondrial en

hepatocitos de ratones han concluido que proteger este daño mitocondrial puede

retrasar los estadíos tempranos de la fibrogénesis, pero dicha protección

eventualmente sucumbe cuando las especies reactivas de oxígeno se siguen

produciendo en lugares extramitocondriales y continúan activando las HSC. 19


18

Se han encontrado niveles elevados de citoquinas proinflamatorias involucradas

en el proceso de fibrosis hepática tales como el factor de necrosis tumoral alfa

(TNFα), dichas elevaciones ocurren en fallas hepáticas fulminantes, hepatitis viral,

abuso de alcohol, enfermedades metabólicas, autoinmunes y obstrucción biliar así

como hepatotoxicidad inducida químicamente, de tal forma que incluso se llega a

correlacionar la elevación en TNFα con la severidad de cirrosis alcohólica. Así

mismo, en algunas otras condiciones hepáticas fisiopatológicas, tales como

isquemia/perfusión; el influjo masivo y sostenido de neutrófilos, que es

influenciado por TNFα, juega un papel central en asegurar la injuria hepática

mediante la liberación de especies reactivas de oxígeno o RLO y proteasas.20 De

tal manera, que el TNFα es un mediador endógeno principal de la hepatotoxicidad

mediante la citotoxicidad directa, producción de óxido nítrico y el

desencadenamiento de una cascada inflamatoria, como se ha establecido por

diferentes experimentos de injuria hepática.

De tal forma que la respuesta fibrogénica, es una cascada dinámica que se inicia

con el daño del hepatocito seguida por activación de células inflamatorias por

metabolitos tóxicos, activación y proliferación de células HSC, y la liberación de

mediadores fibrogénicos. Este resultado provoca un incremento de la matriz

extracelular y acumulación de colágeno. Mientras que la fibrosis hepática es

reversible, la cirrosis, etapa final de la fibrosis, generalmente no lo es y es la

tercera causa más común de muerte en poblaciones urbanas de entre 25—64

años. 20


19

AGENTES ASOCIADOS A DAÑO HEPÁTICO

La disponibilidad de modelos animales es crucial para el estudio de la fibrosis

hepática; por ello existen diversos modelos según su etiología: tóxicos,

nutricionales, inmunológicos, colestáticos, alcohólicos, genéticos metabólicos y

transgénicos; utilizados en variedad de especies como ratas, ratones, conejos,

perros y monos. Todos los anteriores presentan ventajas e inconvenientes de

diversa índole adecuados según el objetivo a investigar, así tenemos agentes

hepatotóxicos comúnmente utilizados para inducir fibrosis y cirrosis hepática como

el Tetracloruro de carbono (CCl4), dimetilnitrosamina (DMNS), Tioacetamida

(TAA), y D-galactosamina (GalN). De los anteriores el más ampliamente utilizado

es el CCL4, que produce significativa inflamación, necrosis y depósitos de tejido

conectivo fibrótico en hígado con daño mínimo a otros órganos, en diversos

modelos de roedores; asemejando la fibrosis y cirrosis hepática humana en

aspectos morfológico y fisiopatológico; sin embargo, su utilización representa alta

toxicidad pulmonar por lo que en países como el nuestro no se habilita su

importación. Por otro lado la DMNS y la TAA son agentes carcinogénicos

hepáticos comunes, utilizados para la inducción de cirrosis hepática y más

recientemente la TAA ha sido utilizado ampliamente para la inducción de fibrosis

en ratas y el estudio del papel de especies reactivas de oxigeno, y la acción

protectora de antioxidantes en hepatopatías crónicas, como se explicará más

adelante. Además, la TAA, desde 1995, ha demostrado ser un modelo

experimental conveniente que origina una patología comparable a aquella que

ocurre en humanos en la inducción de cirrosis. También, el Acetaminofén produce


20

daño hepático al inhibir la cadena respiratoria mitocondrial e inducir estrés

oxidativo; sin embargo, ha producido amplias diferencias en los resultados según

su dosis. El GalN induce daño hepático similar a la hepatitis viral humana que

guarda cierta similitud con los cambios morfológicos en la hepatopatía biliar

crónica. Estos modelos con hepatotoxinas presentan diversos inconvenientes

entre ellos, el ajuste de dosis y las variables susceptibilidades tanto

interespecíficas como etáreas. 21,22,23

Así mismo, la fibrosis hepática inducida por otros métodos nutricionales con dietas

de alto contenido graso y baja proteínas produce fibrosis nutricional o cirrosis en

ratas; requiriendo una duración prolongada y dietas específicas fabricadas en

laboratorios fuera de nuestras fronteras. Inmunológicamente se ha logrado

producir fibrosis con infecciones en ratones por Schistosoma mansoni, mediante la

respuesta inflamatoria al parásito. Así como infecciones con Helicobacter pylori se

han asociado a pacientes con hepatopatías crónicas incluyendo cirrosis,

detectando fragmentos de antígeno positivos en el hígado de estos pacientes; y en

modelos animales, han causado cambios degenerativos funcionales y

morfológicos en hepatocitos.14,21

También se describe la inducción por alcohol de cirrosis y fibrosis hepática

especialmente en roedores, que sin embargo, presenta un problema en la

estabilización del modelo debido al control de ingesta de etanol, pues solo unos

cuantos reportes han establecido el entrenamiento, implantación y mantenimiento

técnico requerido de catéteres gástricos, en décadas. Recientemente, avances en

la biología molecular en laboratorios sofisticadamente avanzados, han permitido

modelos transgénicos que expresan genes específicos para el desarrollo de


21

hepatitis crónica, Por último, quirúrgicamente mediante la ligación del conducto

biliar común se ha producido fibrosis o cirrosis hepática colestática en ratas,

conejos, perros y monos; presentando así mismo, problemas técnicos de

reversibilidad y diferencias en las respuestas que varían según la especie.21

El metabolismo de agentes hepatotóxicos en humanos y varias especies de

animales no es exactamente el mismo; por tanto, no hay modelo animal de fibrosis

o cirrosis hepática que pueda replicar precisamente la enfermedad en humanos;

pero sirven para enriquecer nuestro entendimiento de los mecanismos

patogénicos de la fibrosis hepática, ayudando en los ensayos preliminares de

novedosas medidas terapéuticas con resultados prometedores.21

TIOACETAMIDA

La TAA es un potente hepatotóxico centrilobular ampliamente utilizado como

componente de modelos para inducir enfermedad hepática aguda y crónica; la

TAA sufre su bioactivación en dos pasos por la enzima CYP2E1 microsomal hacia

TAA sulfóxido (TASO) y posteriormente a TA-S,S-dióxido (TASO2) un metabolito

reactivo que inicia la necrosis celular, por unión covalente a macromoléculas

hepáticas. La CYP2E1 parece catalizar al menos el 75% de la conversión de TAA

a TASO; por lo que es la principal enzima que media la bioactivación, siendo

también una enzima toxicológicamente significativa con alta relevancia en el

humano pues bioactiva muchos fármacos, solventes industriales y carcinógenos.

Numerosos investigadores utilizan TAA para estudiar mecanismos de necrosis

hepática debido a su vida media relativamente corta y a una ventana de tiempo

amplia entre su efecto necrogénico y la falla hepática. Así, las vidas medias de


22

TAA y TASO son de 1 a 1.5h y 1.5 a 2h respectivamente, después de una dosis

única de 200mg/kg de TAA. 24

La ventaja de utilizar TAA como modelo hepatotóxico incluye su alta especificidad

por el hígado como órgano blanco, excepto a dosis excesivas, pues a estas dosis

puede también causar daño renal transitorio. Basados en experimentos con TAA,

los niveles plasmáticos alcanzan su pico alrededor de 60-90min para una dosis de

50mg/kg, mientras que la concentración máxima se alcanza a 180min para dosis

de 300-600mg/kg. Las evidencias experimentales demuestran que la bioactivación

de la TAA es saturable a dosis altas, ya que el metabolismo de TAA hacia TASO

se satura, en contraste con su metabolismo a concentraciones menores; por tanto

TAA exhibe un metabolismo dosis-dependiente, por lo que dicha saturación es

responsable de la falta de respuesta del daño hepático ante dosis mayores de

TAA. 24

Adicionalmente se ha demostrado que la utilización de la TAA en modelos

animales para la inducción de daño hepático causa una reducción de selenio en el

hígado y en el plasma de estos. 25

Durante la biotransformación de la TAA, tanto la monooxigenasa de flavina (FMO),

como la citocromo P450 oxidasa, reducen la TAA-S-oxido a TAA-S-dióxido, que

posteriormente se cataliza para formar peróxido de hidrogeno. Es así que el estrés

oxidativo está profundamente involucrado en el daño hepático inducido por la

TAA;25 evidenciándose por la cuantificación de Malondialdehído (MDA) el cual es

un buen indicador de la peroxidación lipídica, pues es proporcional a la oxidación

de los ácidos grasos poliinsaturados a partir de los radicales libres de oxigeno.26


23

En el estudio conducido por Zhang et al. Las actividades de las selenoenzimas

Tioredoxina Reductasa (TrxR), Glutatión peroxidasa (GPx) fueron medidas

después de 24 a 72 horas de la aplicación de TAA; demostrando un incremento en

la actividad de TrxR y una disminución de la actividad de GPx en una significativa

correlación negativa entre la actividad de TrxR y GPx; también fue concomitante

la disminución del contenido hepático de Selenio. Así mismo, tampoco se

encontró ninguna mejoría en la cirrosis o en la actividad de las selenoenzimas,

debido a la suplementación con Selenio ya sea histopatológicamente o en la

actividad sérica de Alanina aminotransferasa (ALT) y Aspartato aminotransferasa

(AST). 25

Sin embargo, a pesar de lo anteriormente expuesto, dichos hallazgos indican que

la administración de TAA impide específicamente la biodisponibilidad de Selenio

en el hígado, y no en la orina; de manera similar a como ocurre en otras

hepatopatías alcohólicas y no alcohólicas. 25, 27 Por ende, esto implica que la

suplementación de Selenio a sujetos con cirrosis y deficiencia nutricional de este,

puede mejorar pero no restaurar completamente la GPx y el Selenio hepáticos.

Además, se ha visto que en ratas sometidas a lesión por quemadura, el Selenio se

incrementa en el riñón pero disminuye en hígado, sugiriendo que el estrés

oxidativo de uno o más tejidos puede llevar al Selenio a redistribuirse en diferentes

tejidos, siendo el riñón un importante tejido para el secuestro de Selenio. 25


24

Por tanto, si el Selenio es el eje central causante de la actividad inversa entre la

TrxR y GPx, la suplementación de Selenio debería ser útil para atenuar la

disminución de la actividad de GPx; sin embargo, la administración oral en estos

estudios de selenio no contrarrestó la disminución en la actividad de GPx,

indicándonos que la relación inversa entre las actividades de estas dos enzimas

no se relaciona con el requerimiento de Selenio. 25

Siendo aún, más probable que sea el estrés oxidativo asociado a la toxicidad

hepática y evidenciado por la acumulación del MDA, que cuantifico Zhang et al.; el

que promueva la biosíntesis de TrxR e inhiba la GPx; ya que este mismo estrés

oxidativo suprime la biosíntesis de las selenoproteinas de pequeño peso

molecular. 25

ESTRÉS OXIDATIVO EN HEPATOPATÍAS

Figura 1.- Formación de Radicales libres en la cadena mitocondrial28


25

El estrés oxidativo se inicia cuando hay un desbalance entre la actividad

generadora de radicales y la actividad eliminadora de radicales; y por tanto esto

puede incrementar la formación de productos de la oxidación con una disminución

o depleción de mecanismos endógenos de protección antioxidante.27

El estrés oxidativo es un importante factor en el desarrolló y la progresión de

fibrosis hepática. Los radicales libres de oxigeno (RLO) pueden oxidar muchas

proteínas, pero los lípidos representan un blanco mayor. Las moléculas oxidadas

pueden tener efectos negativos en el metabolismo celular. Los ácidos grasos en

las membranas celulares son altamente susceptibles a un ataque por RLO lo cual

genera peróxidos lipídicos. Estos peróxidos pueden continuar su oxidación y

convertirse en aldehídos. Estos últimos estimulan la expresión de genes de

colágeno en los fibroblastos. Ocasionando fibrosis hepática que posteriormente

causa Cirrosis.

Estudios en animales y humanos sugieren que el estrés oxidativo juega un papel

importante en la progresión de las patologías hepáticas29. Así mismo esta relación

ha sido demostrada en modelos animales de hepatopatías agudas y crónicas; y en


26

estudios clínicos de humanos con una variedad de desordenes hepáticos

incluyendo hepatitis crónica viral y hepatopatía alcohólica30. Por tanto el estrés

oxidativo es ahora un componente reconocido de la enfermedad hepática

crónica.27

El estrés oxidativo estimula la fibrogénesis;31 las especies reactivas de oxígeno

(ERO) son principalmente generadas por un incremento en la NADPH oxidasa que

produce aniones superóxido (O2•-) a partir del oxígeno (O2).28 El anión superóxido

entonces genera H2O2 radical hidroxilo (OH-).32 Así mismo, otras ERO como el

óxido nítrico (NO), se han detectado en pacientes con cirrosis y otras alteraciones

hepáticas inflamatorias, lo cual sugiere que este contribuye a la progresión de la

cirrosis, puesto que se ha detectado que puede actuar como un agente oxidante

por si mismo ya que da origen a especies oxidante secundarias tales como el

peroxinitrato que puede dañar las células y producir peroxidación lipídica,

induciendo el estrés oxidativo. 33,34

La descomposición lipídica causada por reacciones de peroxidación conlleva a la

generación de reactantes del ácido tiobarbitúrico (TBA) que son el 4-hidroxynoneal

(4HNE) y el malonaldehido (MDA) los cuales son utilizados como marcadores de

la peroxidación lipídica. La peroxidación lipídica afecta la membrana plasmática de

la célula e incrementa la fragilidad membranal de diferentes organelos como los

lisosomas (que guardan el exceso de hierro) la mitocondria y el retículo

endoplásmico, lo que conlleva a una disfunción celular. La peroxidación lipídica de

la membrana mitocondrial (figura 1) puede llevar a un incremento en la


27

permeabilidad de la membrana mitocondrial lo que resulta una pérdida de el

gradiente electroquímico y en la liberación de citocromo C. A este fenómeno se le

llama transición de permeabilidad mitocondrial. El daño en la mitocondria genera

más radicales libres que incrementan el daño a la célula y las señales

proapoptóticas35,36. Otra consecuencia de la peroxidación lipídica es el daño al

ADN y a las proteínas.37

Aunque en algunas patologías como la cirrosis biliar primaria, aún no se tiene con

claridad si el estrés oxidativo está involucrado en la iniciación del proceso

patológico; se puede decir con certeza que si es un factor importante en la

progresión de la enfermedad. 27 Así mismo, el estrés oxidativo debido al depósito

de hierro en hepatocitos o células de Kupffer contribuye a la iniciación y

perpetuación de la injuria hepática; esto ha sido demostrado en estudios con

fibrosis hepática inducida por TAA en los que una dieta deficiente en hierro o la

utilización de deferoxamina como agente quelante de hierro, han suprimido el

depósito de colágeno y atenuado el proceso de activación de células HSC,

mayores productoras de colágeno en el hígado. En la actualidad se conoce que

los iones de metales libres son importantes en la producción de radicales libres.

Por lo que la depleción de hierro dificulta los procesos de estrés oxidativo,

inflamación y activación de HSC, resultando en una inhibición de la fibrosis

hepática. 1

Minerales como Selenio y Cobre sirven como co-factores en procesos enzimáticos

de eliminación de radicales libres, por lo que su deficiencia puede causar una


28

disminución notable en la actividad enzimática y un incremento en concentración

de ERO.

Disminución de los niveles de cobre causa una disminución en la actividad de la

ceruloplasmina, catalasa hepática, y glutatión peroxidasa. Compuestos

antioxidantes conteniendo magnesio y cobre han demostrado resultados

prometedores relacionados con la reducción de anormalidades serológicas y

disminución de daño hepático histológico.

El exceso de cobre puede resultar en estrés oxidativo en consecuencia de su

habilidad de catalizar reacciones entres aniones superoxido y peroxido de

hidrógeno produciendo radicales libres hidroxilo, por lo que su homeostasis es de

suma importancia. 38, 39

Figura 2.- Transporte hepático de hierro. 40


29

HIERRO

La mayoría del hierro corporal es contenido en eritrocitos como componente de

hemoglobina y circula por el cuerpo permitiendo procesos biológicos. El hierro en

la forma de ferritina y hemosiderina constituye solamente el 23% del hierro

corporal.41 La mayoría del resto del hierro se almacena en el bazo e hígado como

componente de enzimas como citocromo P450.

El hierro es un elemento esencial para la vida, Sin embargo las formas libres de

hierro son prácticamente insolubles y potencialmente toxicas. Por lo que el hierro

se encuentra asociado a ligandos específicos que permiten a los organismos

utilizar las propiedades del hierro sin causar daño. La mayoría del hierro

hepatocelular está contenido en la ferritina (80%) con un 2-3% presente como

grupo hemo. El resto está unido a transferrina o presente en las reservas.

Histológicamente el hierro esta distribuido alrededor de las regiones periportales

del hígado con un gradiente que disminuye en las regiones centrolobulares. 40

El mediador para el ingreso de transferrina el receptor TFR1 (figura 2) el cual

regula la entrada de transferrina al hepatocito. La expresión de TFR1 se encuentra

regulada principalmente por un mecanismo post transcripcional que es sensible a

los niveles de hierro, niveles de oxigeno y a la demanda celular de hierro en los

periodos de crecimiento. Existe también otro sitio receptor de transferrina de

menor afinidad TFR2 el cual también interviene de manera significativa en la

incorporación de hierro al hepatocito. TFR2 es un censor de la saturación de


30

transferrina y controla el metabolismo de hierro regulando la expresión de

hepcidina.

La proteína de hemocromatosis (HFE) está asociada al TFR1 posiblemente

limitando la cantidad de hierro liberada por la transferrina. Después de su

endocitosis y la acidificación vesicular el hierro es reducido a su forma ferrosa

antes de ser trasferido a través de la membrana endosomal.

El gen STEAP3 genera una hemoproteína que incrementa la actividad de la

ferrireductasa (proteína encargada de la reducción a hierro ferroso). La forma

ferrosa del hierro es transportada desde el interior del endosoma hacia el citosol

por una proteína llamada DMT1 (una glicoproteína transmembranal).

El hierro puede ser ingresado a la célula hepática sin necesidad de la transferrina

mediante el proceso que se conoce como Ingreso de hierro no asociado a

Transferrina o NTBI (por sus siglas en ingles). NTBI esta disminuido en presencia

de al algunos minerales como Cadmio, Cobre, magnesio y Zinc. Esto se debe a la

mayor afinidad que posee DMT1 por estos minerales, lo que confirma que DMT1

esta altamente implicado en NTBI. Existe otro transportador para NTBI el cual es

el ZIP14 al cual originalmente se le atribuyo el trasporte de zinc hacia el hepatocito

pero se ha evidenciado que puede mediar transporte de NTBI. Otros complejos

transportadores de hierro hacia el interior de la célula comprenden el transporte de

ferritina y lactoferrina mediante receptores específicos.

La ferroportina (FPN) es el mediador para la liberación de hierro del hepatocito.

Hepcidina es un péptido el cual es producido en los hepatocitos en condiciones de


31

suficiencia de hierro. Su expresión es regulado por la inflamación y la hipoxia y los

niveles he hierro. Es un punto focal en la vía reguladora del hierro involucrando

HFE, TFR2 y HJV. La expresión de hepcidina es incrementada por citoquinas

como IL-6.

Haemojuvelina (HJV) es una proteína que tiene un rol muy importante en la

homeostasis hepática del hierro. Se expresa en músculo esquelético adulto, y en

tejido hepático adulto y fetal en los hepatocitos periportales. La ausencia de la HJV

resulta en niveles aumentados en plasma de transferrina saturada y ferritina en

humanos. La función primordial de HJV es la regulación de los niveles de

hepcidina. La HJV puede aumentar la trascripción de hepcidina mediante vías

alternas e independientes de HFE, TFR2 e IL6.

Las células de Kupffer son los macrófagos residentes del hígado su rol principal en

el metabolismo hierro hepático es la de guardar depósitos de hierro en forma de

ferritina. Las células de Kupffer también expresan FPN. Después de la

eritrofagocitosis por el hepatocito, se da un incremento en la expresión de FPN lo

que resulta en mayor excreción de hierro por parte del hepatocito. Las células de

Kupffer tienen la capacidad de expresar TFR1 indicando que puede obtener hierro

de transferrina si lo necesitan. Interesantemente las células de Kupffer también

expresan niveles altos de HFE.40,42


32

Hemocromatosis

Hemocromatosis

Expresión Génica

Injuria Celular

Mutación DNA

Daño Proteico

Peroxidación Lipidica

Figura 3.- Interacción Celular del Hierro y reacciones Fenton.37

El aumento de los niveles de hierro resulta en la formación de oxigeno reactivo

(figura 3). Esto conlleva a la oxidación de los lípidos de membrana en la

mitocondria, microsomas, y lisosomas; la peroxidación lipídica resultante conlleva

a daño celular causando problemas funcionales con estructuras celulares. Por lo

que un aumento en el hierro incrementa la peroxidación lipídica causando daño

celular irreversible. Esto activa las células de Kupffer que producen RLO y

citoquinas fibrogénicas, 43 contribuyendo a la iniciación y perpetuación del daño

hepático. 37

Se ha demostrado una acumulación inusual de hierro frecuentemente en algunas

hepatopatías44, incluyendo hepatitis viral, daño hepático alcohólico y esteato

hepatitis no alcohólica (EHNA). El hierro libre induce la producción de mediadores

fibrogénicos y proinflamatorios como factor de crecimiento Beta (TGF-ß) y el factor


33

nuclear kß (NF-kß). La fagocitosis por macrófagos hepáticos resulta en depósito

de hierro de la hemoglobina en el hígado y contribuye a la patogénesis de la

EHNA. Por tanto se ha determinado que la sobrecarga de hierro puede estar

asociada con hepatitis, cirrosis o cáncer hepático. 1

En un experimento con ratas con hepatopatía crónica inducida por TAA,

administrándoles una dieta corriente (DC) vs. una dieta deficiente en hierro (DDH),

significativamente redujo el hierro en hígado y suero en aquellos con dieta

deficiente de este metal, obteniendo una disminución de la mortalidad hasta de un

87%. Así mismo, los productos oxidativos, y la lipoproteína peroxidasa (LPO)

fueron claramente disminuidos en el hígado del grupo con DDH, indicando un

claro papel del hierro en el estrés oxidativo; y a nivel macroscópico se demostró

una superficie nodular en el hígado de ratas con DC y una superficie lisa casi

intacta en aquellas con DDH. 1

La regulación aumentada o disminuida en la producción de hepcidina por

hepatocitos bajo condiciones patológicas regula la absorción de hierro desde el

intestino delgado. Sin embargo, no se han descubierto medicamentos que regulen

la producción de esta enzima; por lo que actualmente la flebotomía es una terapia

relativamente segura y conveniente para deprivar el hierro del cuerpo aprox. 50mg

de hierro/100ml. A pesar de esto para mantener niveles bajos de hierro se

requieren flebotomías repetidas siendo una alternativa inconveniente por lo que

procesos alternativos como la terapia quelante de hierro y/o dieta deficiente de

este metal representan una nueva alternativa para reemplazar dichos procesos. 1


34

Figura 4.- Reacciones de Oxido – Reducción. 45

Como se ha explicado anteriormente es clara la inducción del hierro sobre el

proceso del estrés oxidativo impulsado por radicales libres de oxígeno como H2O2,

cuya explicación aceptada actualmente es la vía de las fentonas(figura 4)46,47: Fe2+

+ H2O2 Fe3+ + HO + HO-- la cual genera hidroxiradicales (OH) una molécula

fuertemente reactiva. Por lo tanto el control de la homeostasis del hierro hepático

puede ser una estrategia terapéutica en hepatopatía crónica. 1

ORIENTACIONES TERAPÉUTICAS

Actualmente la única terapia efectiva para tratar la fibrosis hepática es eliminar el

agente causal Ej.: terapia antiviral exitosa en pacientes con hepatitis C crónica. Se

encuentran en desarrollo terapias antifibrogénicas para aquellos pacientes en los

cuales la causa subyacente no puede ser eliminada como la utilización de agentes

antiinflamatorios que eliminan los estímulos encargados de activar las células

HSC. Se ha experimentado con el uso de algunos fármacos con actividad

antifibrótica indirecta, porque reducen la acumulación de células que favorecen la

fibrogénesis. También se han utilizado diferentes estrategias antioxidantes (como

Reacción Fenton

Reacción Habber - Weiss

Peroxidación LDL


35

el tocoferol o vitamina E), IFN-γ y HGF para inhibir la transformación fenotípica de

las HSC en miofibroblastos. Y aunque muchos resultados iniciales se ven

prometedores actualmente no existen terapias antifibróticas efectivas. Durante los

años recientes, se han estado llevando investigaciones en mecanismos

moleculares y celulares involucrados en la fibrosis hepática así como

intervenciones farmacológicas; sin embargo, no existe aún una terapia aprobada

por la FDA (administración de fármacos y comida de los EEUU) para impedir la

progresión de la hepatopatía fibrótica. 9, 48

NUEVAS OPCIONES TERAPÉUTICAS EN ESTUDIO

ANTIOXIDANTES

Los componentes antioxidantes individuales incluyen las vitaminas A, C y E, y el

Selenio, un co-factor esencial de la GPx. El glutatión es un componente principal

del sistema antioxidante contra ERO y se sintetiza y afluye a partir de este. El

hígado es la principal fuente de glutatión en plasma. Algunos estudios sugieren

que el metabolismo del glutatión solo se ve alterado en un estado avanzado de los

desordenes hepáticos; sin embargo estudios recientes realizados en pacientes

con cirrosis biliar primaria demostraron que el estrés oxidativo no solo es un

componente de las etapas tardías o avanzadas de la enfermedad hepática sino

también un componente importante de la cirrosis biliar temprana. 27

Vitaglione et al, sugirió que los antioxidantes naturales ingeridos en mezclas

complejas con la dieta son más eficaces que los compuesto puros en prevenir el

estrés oxidativo relacionado a patologías. 49


36

SELENIO

La función reductora del selenio en las proteínas como selenocisteina es

importante para la reducción de lípidos oxidados. La deficiencia de selenio se ha

relacionado a infecciones virales, inflamación, enfermedad cardiovascular50 y

cáncer51. En estudios multicéntricos52 bajas concentraciones de selenio han sido

inversamente correlacionadas con infarto al miocardio53.

En la dieta humana el selenio es encontrado predominantemente en la forma de

selenato, selenocisteina y selenometionina. Selenita y selenato son considerados

fuentes mayores de selenio en proteínas que requieren selenio para funciones

catalíticas, mientras que la selenometionina parece ser incorporada azarosamente

en las proteínas en vez de metionina. El selenio del plasma esta principalmente

asociado con tres proteínas: selenoproteinas, GPx y albúmina. Selenometionina y

selenocisteina son absorbidos mediante transporte activo compartido con los

aminoácidos correspondientes. El selenato es absorbido en parte mediante un

transportador mediado de sodio compartido con sulfato, mientras que selenita

parece que se introduce a la célula mediante difusión pasiva. El selenito ingerido

es reducido a selenida (selenide) el que puede ser metilado para formar

compuestos menos tóxicos que pueden ser excretados mediante las heces y

orina. La vida media es aproximadamente 1.7 días con una retención aproximada

de 3 días.3 El cuerpo humano parece adaptarse de diferentes maneras a las bajas

concentraciones de selenio. Disminución de su excreción urinaria y redistribución

entre las selenoproteinas. 52


37

El selenio como se estableció anteriormente es un co-factor esencial de la GPx, la

cual es responsable de la catálisis en la reducción de hidroperóxidasas en la

presencia del glutatión; catalizando ERO como en la reducción de H2O2 a H2O, por

conversión del glutatión reducido (GSH) a su forma oxidada. 32 Se ha demostrado

que tanto en la hepatopatía alcohólica como la no alcohólica, los niveles de

selenio están reducidos en el hígado y en el suero; mas no en la orina. 27 Así

mismo se ha demostrado que el selenio en plasma disminuye en proporción a la

severidad de la condición cirrótica y una variedad de hepatopatías.54

Las selenoenzimas tales como la TrxR y la GPx, juegan un papel importante en la

homeostasis de reducción-oxidación; de tal manera que la deficiencia de Selenio y

de GPx se ha asociado con niveles elevados de ERO y de peroxidación lipídica,

evidenciada por sus productos tales como el Malondialdehído (MDO). 32 Estos

hallazgos indican que los pacientes con cirrosis probablemente deficientes en

selenio se beneficiarían de un suplemento del mismo. Sin embargo, estudios de

Valimaki et al. Demostraron que un suplemento de Selenio no mejoró la función de

pacientes con cirrosis, sin embargo no reporta la existencia de cambios en la

progresión de la patología. 25

Así como se expuso anteriormente en los cambios en la severidad de

hepatopatías inducidos por selenio, este también ha demostrado que al haber una

disminución en sus niveles concomitantemente se manifiesta una disminución en

la actividad plasmática de GPx. 25


38

En estudios con selenio y tetracloruro de carbono como agente hepatotóxico,

demostraron una disminución en la inflamación y en el número de HSC, y un

aumento en su apoptosis; a pesar que el mecanismo exacto por el cual se induce

este efecto se mantiene incierto. Así también, se evidenció una disminución de la

fibrosis hepática, asociada a un incremento en la degradación del colágeno. Así

como una disminución en la cantidad de MDO hepático. 32

QUELANTES DE HIERRO

La quelación es una reacción química que resulta de la unión formada entre un ión

metálico y una molécula orgánica (Ej. Carbón). El complejo resultante, metal unido

a molécula es denominado “quelado” y contiene una o más anillos de átomos en

los cuales el ión metálico esta tan firmemente unido que no puede escapar. El

hierro es un elemento esencial para el organismo, sin embargo puede iniciar o

mantener reacciones inflamatorias e incluso dañar tejidos mediante la formación

de radicales libres; es por ello que se han buscado diferentes maneras de

eliminarlo, entre ellas diversos agentes quelantes.2, 55

La Deferoxamina (C25H48N6O8), un quelante específico de hierro en las células

HSC. En el organismo es capaz de combinarse con el hierro férrico de los

depósitos de ferritina y hemosiderina y en menor grado con la transferrina,

aproximadamente 1 g de deferoxamina se combina con 85mg de hierro férrico. En

modelos de ratas dichas células demostraron partículas lipídicas que contienen

vitamina A, localizadas alrededor de núcleos agrandados y en proceso de

multiplicación, pero al exponerlas a un medio con deferoxamina mantuvieron su

fenotipo quiescente y núcleos pequeños. En particular, estas células en respuesta


39

Figura 5.- Configuración de EDTA56

a un ambiente de estrés oxidativo cambian sus características fenotípicas de

almacenaje de vitamina A hacia un fenotipo productor de colágeno contribuyendo

a la formación fibrótica típica de un hígado crónicamente inflamado. 1

Lo anteriormente mencionado se comprueba con los estudios de modelos que

utilizan ratas expuestas a TAA y dietas DDH y DC; puesto que el hierro libre

involucrado en la inducción del estrés oxidativo puede inducir la activación de este

tipo de células, demostrando en ratas con DDH una marcada atenuación del

progreso de la fibrosis hepática y la inhibición de la activación de células HSC. 1

Hasta el momento el tratamiento de elección en diversas patologías que

involucran la quelación de hierro como las talasemias ha sido la deferoxamina

pero involucra algunos inconvenientes entre ellos el elevado costo, ya que uno de

los precios más accesibles encontrado en el mercado es de aprox. $75.73/vial.3

El EDTA es un acido poliaminocarboxílico, es

utilizado ampliamente como disolvente, debido a su

actividad como agente quelante de iones metálicos

como Ca2+, Cu2+ y Fe2+. Posterior a ser quelados los

iones se mantienen en solución pero demuestran

reactividad disminuida.

Debido a que los iones metálicos son extensivamente envueltos por EDTA, sus

propiedades catalíticas son suprimidas a menudo. Debido a que los complejos de

EDTA son aniónicos, tienden a ser altamente hidrosolubles. Por esta razón, el

EDTA es capaz de disolver depósitos de metal oxidados y carbonatos. 56

Por tanto a diferencia de la deferoxamina el EDTA puede quelar iones Fe2+, Zn2+,

Cu2+ y Ca2+.57


40

Usualmente EDTA es utilizado para quelar metales tales como plomo en

intoxicaciones, quelante de calcio en el tratamiento de hipercalcemia y

anticoagulante en bancos de sangre, así como para remover el hierro en exceso a

consecuencia de excesivas transfusiones sanguíneas en el tratamiento de

talasemias. Así mismo se ha estipulado que el EDTA actúa como antioxidante

para prevenir el daño producido por radicales libres en las paredes de vasos

sanguíneos. Inclusive en estudios clínicos se ha encontrado un fuerte efecto

antioxidante y protector contra oxidación lipídica del EDTA al aplicarse en

tratamiento quelante. 56

La dosis promedio es 700—3500mg/12h (ajustado al peso corporal, edad y

función renal) añadido a 500 ml de “solución transportadora” (agua estéril) con una

mezcla de vitaminas y minerales, siendo administrado de manera parenteral ya

que solo se absorbe parcialmente en el tracto gastrointestinal. Su vida media es

de 1 hora. Como se ha expuesto el EDTA controla el daño por radicales libres

pues quela las coenzimas catalizadoras metálicas y por tanto inhibe la

peroxidación lipídica sirviendo como antioxidante. 56

Se ha demostrado mediante estudios comparativos que la producción de radicales

libres se ve disminuida con la adición de quelantes de hierro como deferoxamina y

EDTA. Utilizando 5.5-dimetil -1 -pirrolina N - Oxido (DMPO) y su medición con

resonancia electrónica (ESR) se puede saber si los radicales hidroxilo se

aumentan o disminuyen al agregar un compuesto. Mediante este método se

compararon diferentes quelantes incluyendo Deferoxamina y EDTA, concluyendo


41

que la deferoxamnia tiene una mayor capacidad inhibitoria comparada con el

EDTA. Sin embargo el EDTA posee aproximadamente un 79% de actividad

supresora de radicales libres comparado con la Deferoxamina. 47

Otro estudio reveló que la deferoxamina posee una habilidad para bloquear la

peroxidación lipídica aun en aquellas reacciones donde interviene el hierro

almacenado en la oxihemoglobina. El EDTA es menos efectivo que la

deferoxamina como un inhibidor de las reacciones de peroxidación en las cuales

interviene la oxihemoglobina, pero si se aumenta la concentración puede causar

una inhibición de las reacciones causantes de radicales libres en las cuales se ve

involucrada la oxihemoglobina.58

Los resultados de estos estudios47, 58 demuestran que a pesar que la

deferoxamina como quelante de hierro es más eficaz en la disminución de

producción de radicales libres por la reacción Fenton, el EDTA también ha

demostrado eficacia al disminuir la producción de radicales libres.

Bajo condiciones fisiológicas en las cuales el hierro ha sido quelado totalmente; el

hierro quelado puede ser reducido a complejos que pueden ser incorporados a la

reserva interna de hierro. Y si existe la presencia de un quelante que se una

fuertemente al hierro es poco probable que se produzcan en condiciones

fisiológicas radicales hidroxilo o especies relacionadas.59

Aunque hay estudios que apoyan la teoría que en condiciones fisiológicas puede

existir producción de radicales libres sin intervenir la vía de las fentonas, esta vía

es la principal productora de radicales libres. El uso de quelantes de hierro


42

produce una reducción en la cantidad de reacciones de oxidación en las cuales se

ve involucrado el hierro lo que reduce grandemente la producción de radicales

libres que pueden causar peroxidación lipídica.46, 47, 60

MÉTODOS PARA EVALUAR DAÑO HEPÁTICO

Se han desarrollado diferentes sistemas como el score de fibrosis de Knodell61

METAVIR (modificado por Ishak), el score de Scheuer, y el análisis morfométrico

asistido por computadora como FibroScan®.43, 62

Se han utilizado diversos métodos para detectar una gran cantidad de elementos

bioquímicos e histopatológicos que revelen el daño hepático crónico representado

por fibrosis, necrosis e inflamación hepática, entre los cuales tenemos:

El conteo de plaquetas que es una medida conveniente para la evaluación de la

fibrosis. En etapas avanzadas de la enfermedad el conteo de plaquetas disminuye.

Este hallazgo correlaciona moderadamente con el grado histológico de fibrosis,

con un coeficiente de correlación de 0.46 a 0.50.

El péptido procolágeno III también se ha utilizado como marcador de fibrosis

hepática. 62 Otro marcador sérico de fibrosis es la relación aspartato

aminotransferasa/plaquetas el cual es calculado utilizando los niveles de GOT y

conteo de plaquetas. Este score ha sido utilizado hasta el momento en pacientes

con hepatitis viral y no se recomienda para la evaluación de pacientes con

hepatopatías causadas por otras patologías.62


43

La detección de alfa actina del músculo liso como hallazgo específico de la

activación de células HSC, mediante tinción inmunofluorescente y la expresión de

genes de procolágeno alfa 1 medidos por PCR de tiempo real, en estudios con

dicha tecnología han indicado un incremento de sus niveles en hígados

característicamente fibróticos.14

Las transaminasas son marcadores indirectos que reflejan alteraciones en la

función hepática. La medición de las transaminasas como enzimas citosólicas:

Aspartato aminotransferasa (AST/TGO) y Alanina aminotransferasa (ALT/TGP); y

de fosfatasa alcalina (ALP) como marcadores convencionales de daño

hepatocelular, han sido determinados en múltiples experimentos con daño

hepático crónico. 1,33 Dichos valores enzimáticos varían según el daño hepático

como se evidencia en la figura 6 63. También existen marcadores directos de

fibrosis que demuestran alteraciones séricas relacionadas a proteínas de la matriz

extracelular.

Se ha determinado también niveles aumentados de Malondialdehido como

producto de peroxidación lipídica, así como de transaminasas y glutatión en

hígados de ratones tratados con TAA y otros hepatotóxicos, indicando su


44

correlación con la existencia de estrés oxidativo e injuria hepática. 25

La actividad de enzimas caspasa ha sido detectada por substratos fluorescentes

específicos para medir actividad proteolítica en diversos estudios avanzados en

los cuales los niveles de dichas enzimas se correlacionaban con la apoptosis de

células HSC. 32

Histopatológicamente, los cambios morfológicos asociados con injuria hepática

crónica y hepatotóxicidad se han visualizado con tinción de hematoxilina-eosina,

incluyendo necrosis, inflamación y fibrosis (figura 7-1). Por lo que se han utilizado

diversos métodos semicuantitativos para su detección: La Fibrosis ha sido

determinada en estudios con la siguiente escala: 0, normal; 1, fibrosis portal; 2,

fibrosis periportal; 3, fibrosis septal y 4, cirrosis.

Cirrosis ha sido adjudicada según los criterios a seguir: 0, hígado normal; 1,

colágeno perivenular engrosado y septum de colágeno delgado; 2, septum

delgado con conexiones entre regiones portales; 3, septum delgado y conexiones

extensas; 4, septum engrosado con conexiones completas de regiones portales y

apariencia nodular.

Septos Fibróticos

Nódulos de Regeneración

Ductos Biliares

Figura 7-1.- Comparación microscópica de lobulillo hepático sano y hepatocito fibrótico.58,59


45

Y la necrosis fue evaluada, basada en los siguientes criterios: 0, ausente; 1,

mínimo; necrosis puntiforme; 2, necrosis moderada en áreas no confluentes; 3,

necrosis submasiva con áreas confluentes; y 4, necrosis masiva.20,25

Técnicas imagenológicas como elastografia hepática y resonancia magnética se

han utilizado como métodos no invasivos para indagar sobre fibrosis hepática.43

Finalmente macroscópicamente (figura 7-2) se ha detectado disminuciones

significativas en el peso de hígados de ratones sometidos a agentes hepatotóxicos

en comparación con aquellos sometidos a placebos. Así también, la apariencia en

ratones sometidos a hepatotóxinas, demostró superficies nodulares indicativas de

cirrosis en períodos que van de 1 a 3 meses, en comparación con hígados de

superficies lisas en ratones no sometidos a estas injurias. 1

Debido a la variedad de indicadores de daño hepático crónico y la complejidad

tecnológica involucrada en la detección de muchos de ellos, nuestro proyecto se

centrará en aquellos indicadores más utilizados tales como transaminasas,

hallazgos histopatológicos y macroscópicos entre otros. 64

Figura 7-2.- Comparación macroscópica de Hígado sano e Hígado

Normal Cirrótico


46

HIPOTESIS DE TRABAJO:

El efecto antioxidante del SeNa y quelante del EDTA proveen una acción

hepatoprotectora en un modelo de daño hepático crónico en ratones.

HIPOTESIS ESTADISTICAS:

H1

La utilización de EDTA como quelante de hierro y Selenato de sodio como

antioxidante disminuye la progresión y gravedad de la hepatopatía crónica de los

ratones en estudio.

H0

La utilización de EDTA como quelante de hierro y de Selenato de Sodio como

antioxidante no disminuye la progresión ni la gravedad de la hepatopatía crónica

de los ratones en estudio.

DELIMITACIÓN DEL TEMA

• No se determinaron los niveles de hierro sérico o en la dieta del modelo

experimental.

• La evaluación del daño hepático se realizó mediante el análisis

macroscópico, microscópico y bioquímico en los diferentes grupos

experimentales.


47

METODOLOGIA

TIPO DE ESTUDIO • Experimental, Controlado.

POBLACIÓN Y MUESTRA.

Se utilizaron para el estudio ratones heterocigotos derivados de la línea de ratones

albinos suizos adultos mayores de 6 semanas, de sexo femenino, criados en las

instalaciones del laboratorio de la Universidad Dr. José Matías Delgado en un

ambiente de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con una temperatura de

27°C y los cuales mantuvieron una dieta marca Knino y agua ad libitum.

DIETA

A continuación se detallan las diferencias entre los principales componentes según

los análisis garantizados proveídos por los fabricantes entre la dieta de marca

Knino de empresa nacional Tecnutral que ha sido elegida para la alimentación de

la población experimental y la dieta AIN-93G, una de las más utilizadas en

experimentos de laboratorio debido a su aporte nutricional ideal para roedores de

experimentación en crecimiento.65, 66


48

Cuadro 2-1

Dieta

Componente

Dieta Knino

Dieta AIN-93G

Proteína minima 18.0% 18.7%

Grasa minima 7.0% 7.0%

Fibra mínima 6.0% 5.0%

DISEÑO EXPERIMENTAL

Estandarización modelo

Para la estandarización del modelo de daño hepático se tomo una n de 10 ratones

divididos en 2 grupos, uno de inducción (grupo TAA) y otro control sano (grupo S)

de 5 ratones cada uno descritos a continuación. (Ver cuadro 3-1)

Cuadro 3-1 GRUPO DESCRIPCIÒN INTERVENCIÒN

Grupo TAA

n=5

Grupo para inducción de fibrosis hepática crónica con TAA

Inyección intraperitoneal de 200mg/Kg. de TAA dos veces por semana

Grupo S

n=5

Grupo control negativo con aplicación de Solución salina

Inyección intraperitoneal de SSN 0.9% dos veces por semana

Experimento

Durante el experimento se utilizó una n de 20 ratones, divididos en 4 grupos, en

los cuales grupo I control de inducción, que es similar a grupo TAA de la

estandarización del modelo y los grupos II, III y IV, como grupos experimentales,


49

en los cuales grupo II y III miden individualmente las funciones hepatoprotectoras

de EDTA y SeNa; y grupo IV aplica ambas simultáneamente. (Ver cuadro 3-2)

Cuadro 3-2

GRUPO DESCRIPCION INTERVENCION Grupo I

n=5 Control de fibrosis hepática crónica positivo con TAA

Inyección intraperitoneal de 200mg/Kg. de TAA dos veces por semana

Grupo II n=5

Grupo experimental con SeNa Inyección intraperitoneal bisemanal de 200mg/Kg. de TAA + administración trisemanal con cánula Intragástrica de 500ug/kg vo.de SeNa, a partir de 2ª semana.

Grupo III n=5

Grupo experimental con quelante de hierro EDTA

Inyección intraperitoneal bisemanal de 200mg/Kg. de TAA + 0.02mg/g intraperitoneal de EDTA bisemanal a partir de 2ª semana.

Grupo IV n=5

Grupo experimental con SeNa mas EDTA

Inyección intraperitoneal bisemanal de 200mg/Kg. de TAA + 500ug/kg vo. de SeNa trisemanal a partir de 2a semana + 0.02mg/g intraperitoneal de EDTA (0.01umol/uL) bisemanal a partir de 2ª semana.

A continuación se muestra un cuadro con la vida media de cada componente

utilizado.

Cuadro 3-3 3, 24, 56

Compuesto Horas TAA 1,5

EDTA 1SeNa 40


50

CRITERIOS DE INCLUSION

• Ratones adultos mayores de 6 semanas de edad de sexo femenino.

• Ratones sin enfermedades crónico – degenerativas evidentes.

CRITERIOS DE EXCLUSION.

• Ratones a los cuales no se pueda aplicar la totalidad de las dosis de EDTA

y SeNa.

• Ratones que fallezcan previamente a la terminación del experimento por

causas ajenas a la inducción de hepatopatía.

• Ratones que desarrollen alguna alteración degenerativa durante el proceso

experimental.


51

OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES DEPENDIENTES

Cuadro 4.- Variable Definición Medición

Daño hepático causado por TAA en

un modelo experimental en

ratones.

Injuria hepática causada por la administración aplicación bisemanal de 200mg/Kg. de TAA durante un período

de 6 semanas en un modelo experimental con ratones.

Verificación mediante análisis macroscópico e histopatológico de las lesiones hepáticas causadas por TAA.

Concentraciones de SeNa en la

alimentación de los animales de

experimentación.

Cantidad presente de SeNa en el agua administrada a los animales de

experimentación.

Aplicación de SeNa una vez al día oralmente a dosis de 500ug/Kg

Concentraciones de EDTA administrada intraperitonealmente

a los animales de experimentación.

Cantidad presente de EDTA en la preparación intraperitoneal que se

administra a los animales de experimentación

Se aplicará una solución estéril de EDTA a dosis de 0.02mg/g en inyección

intraperitoneal

Efecto hepatoprotector de la terapia con EDTA.

Disminución en la injuria hepática en animales de experimentación con

terapia con EDTA. Alteraciones bioquímicas en las principales enzimas hepáticas

(TGO,TGP)


Análisis bioquímico de TGO y TGP

Efecto hepatoprotector de la

terapia con SeNa.


terapia con SeNa. Alteraciones bioquímicas en las principales enzimas hepáticas

(TGO,TGP)



Efecto hepatoprotector de la terapia combinada de

EDTA y SeNa.


terapia combinada de EDTA y SeNa. Alteraciones bioquímicas en las principales enzimas hepáticas

(TGO,TGP)



Análisis macroscópico de

muestras hepáticas. Análisis microscópico

de muestras hepáticas


Verificación de las lesiones hepáticas a nivel macroscópico y microscopio en las

muestras hepáticas tomadas de los animales de experimentación.

Verificación de los niveles bioquímicos de TGO y TGP

Verificación de la apariencia lisa o de rugosidades en la superficie hepática así como cambios de color en su superficie y posteriormente se enviarán a estudio por

un patólogo Verificación mediante un laboratorio clínico de los niveles de TGO y TGP

Correlación entre los hallazgos

macroscópicos y microscópicos de los

diferentes grupos experimentales.

Comparación entre las diferentes verificaciones de las lesiones hepáticas a nivel macroscópico y microscópico en las muestras tomadas de los animales

de experimentación.

Análisis estadístico, por medio de una prueba U de Man-Whithney, para

experimentos independientes o Kruskall-Walis, para comparación entregrupos


52

Correlación entre los hallazgos de los

diferentes niveles de TGO y TGP de los diferentes grupos experimentales.

Comparación entre los diferentes niveles de TGO y TGP de las muestras

sanguíneas tomadas de todos los animales de los diferentes grupos

experimentales.

Definición de los valores encontrados para el grupo de TAA como 0% de protección y comparación con los niveles encontrados

en los otros grupos.

ESTANDARIZACIÓN DE MODELO DE INDUCCIÓN DE DAÑO CRÓNICO

Se utilizó una n de 10 ratones albinos de 200—260g, divididos en dos grupos con

el objetivo de determinar la efectividad de nuestro modelo para la inducción del

daño hepático crónico, por lo que cada grupo constó de una n de 5, aplicando al

primer grupo una dosis de TAA de 200mg/kg intraperitonealmente dos veces por

semana, durante seis semanas: y el segundo grupo de 5 ratones resultó el grupo

control a los que se les aplicó inyecciones intraperitoneales con solución salina

dos veces por semana, durante un período de seis semanas; posterior a lo cual

son sacrificados mediante dislocación cráneo cervical, tomándose muestras

histopatológicas de hígado mediante extracción de este por laparotomía,

estandarizando el tipo de daño hepático producido por TAA.

Figura 8.-


53

EFECTO HEPATOPROTECTOR DEL EDTA Y EL SELENIO.

Durante el experimento con el fin de determinar la mejor terapia que pueda

contribuir con la reducción de fibrosis hepática se utilizaron 4 grupos, con una n de

5 ratones albinos de 200—260g cada uno, de los cuales el grupo I se sometió a

una aplicación bisemanal de 200mg/Kg. de TAA intraperitoneal durante un período

de 6 semanas; el grupo II se le aplicó 200mg/Kg. de TAA intraperitoneal

bisemanalmente por 6 semanas, además de la aplicación oral de SeNa

trisemanalmente a dosis de 500ug/Kg por medio de una cánula intragástrica,

iniciando en la 2ª semana; al grupo III se le aplicó 200mg/Kg. de TAA

intraperitoneal bisemanalmente por 6 semanas y una solución estéril de EDTA a

dosis de 0.02mg/g en inyección intraperitoneal bisemanalmente iniciando en la 2ª

semana; finalmente al grupo IV se aplicaron dosis intraperitoneales

bisemanalmente de 200mg/Kg. de TAA por 6 semanas e inyecciones

intraperitoneales de 0.02mg/g de EDTA bisemanalmente, mas SeNa 500ug/Kg.

tres veces por semana oralmente, ambas a partir de la 2ª semana. Al cabo de 6

semanas los animales se sacrificaron mediante dislocación cráneo cervical,

tomándose muestras histopatológicas de hígado mediante extracción de este y

muestras sanguíneas para procesamiento de enzimas hepáticas, procediendo al

análisis de las muestras.


54

Figura 9.-

SOLUCIONES

Tioacetamida(Chemimpex) en forma sólida cristalina; para su administración fue

diluida en solución salina al 0.9% a manera de obtener una concentración, para su

inyección intraperitoneal.

SeNa(Twinlab),en forma sólida en cápsulas de gel y con excipientes de celulosa y

almidón en concentración de 250ug por cápsula, por lo que para su administración

fueron diluidas dos cápsulas en 3cc de agua bidestilada, obteniendo dilución del

SeNa en el sobrenadante, de manera suficiente para una aplicación semanal,

repitiéndose dicho proceso tres veces por semana.


55

DETERMINACIÓN DE LA SOBREVIDA

La sobrevivencia de los animales de experimentación en diferentes estudios, en

los que son sometidos a un daño hepático crónico mediante la utilización de TAA,

con un dosis promedio de 200mg/kg, han demostrado niveles de mortalidad

progresivamente mayores hasta del 40% después de 6 a 8 semanas.67

ANÁLISIS DE MUESTRAS

ANÁLISIS BIOQUÍMICOS

1. Se recolectó sangre de cada uno de los sujetos de estudio mediante una

punción cardíaca, utilizando sedación con éter y se obtuvo

aproximadamente 1 ml de sangre para análisis, posterior a lo cual se

incorporaron las muestras individuales en un conglomerado por cada grupo.

2. Se enviaron las muestras sanguíneas de cada conglomerado grupal a un

laboratorio para determinar los niveles de TGO, TGP y fosfatasa alcalina.

3. Se procedió a sacrificar los animales de estudio utilizando dislocación

cráneo cervical en concordancia con protocolos internacionales de ética

animal.

ANÁLISIS MACROSCÓPICO

Se disecó quirúrgicamente el hígado de los sujetos de estudio, mediante

una incisión de una laparotomía abdominal verificando la apariencia lisa o

de rugosidades en la superficie hepática así como cambios de color en su

superficie.


56

ANÁLISIS MICROSCÓPICO Se realizó tinción con hematoxilina y eosina para evaluar inflamación porta,

infiltración celular inflamatoria, necrosis centrizonal, displasia de hepatocitos,

degeneración de balón, congestión vascular, cambios grasos y fibrosis.

Las muestras fueron examinadas por un experto patólogo con método doble

ciego, utilizando las siguientes escalas20:

Cuadro 5.-

HALLAZGO HISTOPATOLÓGICO

ESCALA 0 1 2 3 4

FIBROSIS Normal Fibrosis Portal Fibrosis Periportal

Fibrosis Septal

Cirrosis

CIRROSIS Normal Colágeno perivenular engrosado y septum de colágeno delgado

Septum delgado con conexiones entre regiones

portales

Septum delgado y

conexiones extensas

Septum engrosado con conexiones completas de

regiones portales y apariencia nodular

NECROSIS Ausente/ sano

Mínimo, necrosis

puntiforme o inicial

Necrosis leve en áreas no

confluentes

Necrosis submasiva o

moderada con áreas

confluentes

Necrosis masiva o severa

DEGENERACIÓN HEPATOCÍTICA

TURBIA

Ausente/ sano

Daño inicial Daño leve Daño moderado

Daño severo

DEGENERACIÓN HEPATOCÍTICA

VACUOLAR

Ausente/ sano

Daño inicial Daño leve Daño moderado

Daño severo

HIPEREMIA PASIVA CRÓNICA

Ausente Escasa Aumentada

MÉTODOS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCION DE DATOS

Los datos obtenidos se almacenaran en una base de datos creada en Microsoft

Excel para Windows XP, y se realizaron los gráficos correspondientes con

GraphPad Pris5.


57

PLAN DE PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE LOS DATOS

El análisis estadístico, se realizará con el programa SPSS v15.0 por medio de una

prueba no paramétrica: U de Man-Whithney, para experimentos independientes y

Kruskall-Walis, para demostrar diferencias entre los grupos.

PRESENTACIÓN DE LA INFORMACIÓN.

Tablas comparativas, con los resultados observados según su codificación y

resultados estadísticos, realizados en el programa SPSS versión 15, utilizando

medidas de tendencia central, tablas y gráficos comparativos según necesidad.

Si se encuentran variables que puedan asociarse, se realizará.

CONSIDERACION ETICAS.

El tratamiento que se les dará a los animales de experimentación estará basado

en el acta de bienestar animal (AWA) y en el documento: “Elementos esenciales

para investigación animal, una guía para la investigación personal” del centro de

información del bienestar animal del departamento de agricultura de Estados

Unidos de América, provocando el mínimo dolor posible a los ratones tanto en la

aplicación de los medicamentos como en el método utilizado para su sacrificio

previo a la extracción de sangre para los análisis bioquímicos, y a su autopsia y

extracción del hígado utilizado para el estudio histopatológico posterior.68


58

RESULTADOS

ESTANDARIZACIÓN DEL MODELO DE DAÑO HEPÁTICO CRÓNICO

INDUCIDO POR TIOACETAMIDA EN RATONES

La estandarización se realizó con los grupos detallados en el Cuadro 3-1,

utilizando una n=10, de los cuales en el grupo S se excluyó a un sujeto de

investigación por haberse encontrado sepsis peritoneal al momento de la

disección.

En el Cuadro 6, se observan los resultados obtenidos de la estandarización del

modelo de daño hepático crónico. Según los hallazgos histopatológicos en el

grupo tratado con TAA se obtuvo una degeneración hepatocítica turbia y vacuolar,

así como necrosis multifocal, no encontrándose cambios fibróticos o cirróticos, por

lo que se decidió excluir las escalas de evaluación para dichos cambios. Por su

parte grupo S (SSN) o control negativo, no desarrolló necrosis ni fibrosis alguna,

sin embargo presento leves degeneraciones hepatocíticas turbias.

Cuadro 6.- Hallazgos histopatológicos en grupos de investigación fase de estandarización

Grupo de Investigación

TAA n=5 SSN n=4 DegeneraciónHepatocítica Turbia**

Ausente 0 .0% 0 .0%

Daño inicial 0 .0% 0 .0% Daño leve 0 .0% 4 100.0% Daño moderado 5 100.0% 0 .0% Daño severo 0 .0% 0 .0% DegeneraciónHepatocítica Vacuolar

Ausente 4 80.0% 4 100.0%

Daño inicial 0 .0% 0 .0% Daño leve 0 .0% 0 .0% Daño moderado 1 20.0% 0 .0% Daño severo 0 .0% 0 .0% Necrosis Ausente 5 100.0% 4 100.0%


59

*Diferencia significativa para p<0.05 **Diferencia muy significativa para p<0.01 +Hallazgos comparados utilizando prueba no paramétrica U de Mann-Whitney.

Como se aprecia anteriormente, los resultados obtenidos para degeneración

turbia, necrosis multifocal e hiperemia pasiva crónica presentaron diferencias muy

significativas entre los dos grupos con una p=0.005, p=0.009 y p=0.005

respectivamente. Sin embargo, para la degeneración vacuolar, necrosis focal y

fibrosis, se obtuvo en todos los casos una p≥0.05, siendo aún mayor para fibrosis

y necrosis focal.

ANÁLISIS MICROSCÓPICO DEL MODELO

El análisis histopatológico no revela fibrosis alguna en ninguno de los grupos de

estandarización del modelo, sin embargo en todas las muestras del grupo TAA se

Focal Daño inicial 0 .0% 0 .0% Daño leve 0 .0% 0 .0% Daño

moderado 0 .0% 0 .0%

Daño severo 0 .0% 0 .0%

Necrosis Multifocal*

Ausente 0 .0% 4 100.0%

Daño inicial 0 .0% 0 .0% Daño leve 0 .0% 0 .0% Daño

moderado 3 60.0% 0 .0%

Daño severo 2 40.0% 0 .0%

Fibrosis

normal 5 100.0% 4 100.0% portal 0 .0% 0 .0% periportal 0 .0% 0 .0% septal 0 .0% 0 .0% cirrosis 0 .0% 0 .0%

Hiperemia Pasiva Crónica**

Presente 5 100.0% 0 .0% Ausente 0 .0% 4 100.0%


60

destacan cambios histopatológicos crónicos correspondientes a Hiperemia pasiva

crónica y macrófagos necróticos, como se observa en la figura 10.

Figura 10.- Hallazgos histopatológicos Fase 1

EVALUACIÓN DEL EFECTO HEPATOPROTECTOR DEL EDTA Y DEL SeNa

Esta fase se realizó con una n de 20 ratones distribuidos como lo detalla el cuadro

3-2 con una n final de 19 ya que en el grupo IV (TAA-EDTA+SeNa) se registró el

fallecimiento de un sujeto de experimentación en la cuarta semana, por lo que fue

excluido del estudio.

HALLAZGOS MACROSCÓPICOS

Al comparar los pesos promedio de cada grupo de investigación al inicio y al final

de la fase experimental se encontraron aumentos significativos de peso en los

grupos I, II y III (TAA, TAA + SeNa y TAA + EDTA correspondientemente) y la

única disminución se encontró en el grupo IV (TAA+EDTA+SeNa), como se

observa en la figura 11

HPC, hiperemia pasiva crónica; MC, macrófagos necróticos.

HPC

HPC

MC

MCMC


61

Figura 11. Cambios de peso inicial a final.

Durante la disección y extracción del hígado se observó en los grupos I, II y III

superficies hepáticas nodulares pálidas, mientras que en el grupo IV

(TAA+SeNa+EDTA) se observaron superficies hepáticas nodulares brillosas.

ANÁLISIS MICROSCÓPICO

DEGENERACIÓN HEPATOCÍTICA, NECROSIS E HIPEREMIA PASIVA

CRÓNICA

En el grupo TAA+SeNa+EDTA, se encontraron un 25% de sujetos sin daño

hepático, y un 75% con daños iníciales a leves. El grupo TAA + EDTA y TAA +

SeNa evidenciaron resultados con daños de iníciales a leves, sin embargo, no se

obtuvo sujetos en estos grupos en los que no se encontrara daño alguno. En

contraposición a estos grupos el control positivo TAA obtuvo resultados de daño

hepático severo, demostrando necrosis multifocales en todos los sujetos de

investigación, así como hiperemia crónica aumentada.


62

Figura 12.- Gráficas de reporte histopatológico A) Degeneración Hepatocítica

Turbia B) Degeneración Hepatocítica Vacuolar C) Necrosis Focal D) Necrosis

Multifocal E) Hiperemia Pasiva Crónica

A) B) C) D)

E)


63

HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS

Los hallazgos histopatológicos anteriormente mencionados se observan en la

figura 13. Así mismo, en la imagen A se observa cariorrexis, cariolisis y picnosis

correspondientes al grupo I (TAA). Como hallazgo patológico crónico se observa

en las figura 13 macrófagos pigmentados que corresponden a la hiperemia pasiva

crónica (Fig. 13-A), los cuales en las imágenes B, C y D se van haciendo más y

más escasos, así como los demás parámetros histopatológicos que en la imagen

D (grupo IV) se hacen prácticamente inexistentes.

Figura 13.- Hallazgos histopatológicos A) grupo TAA, B) grupo TAA+SeNa, C)

grupo TAA+EDTA, D) grupo TAA+SeNa+EDTA

A) B)

C) D)

VC

S

DV, Degeneración vacuolar, N, necrosis

DV

HPC, Hiperemia pasiva crónica

HPC

TC, Tejido Conectivo

TC

VC, Vena Centrilobulillar; S, sinusoides DH, Degeneración hepatocítica

DH

N


64

ANALISIS BIOQUÍMICOS

Para el análisis de Transaminasas y fosfatasa alcalina como parámetros de

función hepática se utilizaron muestras sanguíneas a partir de punción cardíaca,

posterior a lo cual se unificó la muestra por grupo debido al escaso volumen de

suero obtenido en cada uno y se enviaron las muestras para su procesamiento a

un laboratorio particular que se mantuvo doble ciego, obteniendo los resultados

que se evidencian en la figura 14.

Figura 14.-Valores de Transaminasas y Fosfatasa Alcalina según grupo de

experimentación

A)

B)


65

C)

Como se aprecia en las gráficas anteriores, los rangos de valores normales para

los sujetos de investigación utilizados se representan con barras lineales.69 Para

los valores de Transaminasa Glutámica Oxaloacética (TGO) el único grupo que

obtuvo resultados dentro del rango normal fue el Grupo IV (TAA+SeNa+EDTA), al

igual que para los valores de Transaminasa Glutámica Pirúvica (TGP).

HEPATOPROTECCIÓN

Cuadro 7.-HALLAZGOS HISTOPATOLÓGICOS SEGUN GRUPO DE INVESTIGACIÓN Grupo de Investigación TAA TAA +

SeNa TAA + EDTA

TAA + SeNa + EDTA

P

Degeneración Hepatocítica Turbia*

Ausente .0% .0% .0% 25.0%

Daño inicial .0% 60.0% 60.0% 50.0% Daño leve 40.0% 40.0% 40.0% 25.0% 0.025 Daño

moderado .0% .0% .0% .0%

Daño severo 60.0% .0% .0% .0%

Degeneración Hepatocítica Vacuolar*

Ausente .0% 60.0% 60.0% 75.0%

Daño inicial 40.0% 40.0% 40.0% 25.0% Daño leve 60.0% .0% .0% .0% 0.025 Daño

moderado .0% .0% .0% .0%

Daño severo .0% .0% .0% .0%


66

Necrosis Focal

Ausente 100.0% 40.0% 80.0% 100.0%

Daño inicial .0% 60.0% 20.0% .0% Daño leve .0% .0% .0% .0% 0.086 Daño

moderado .0% .0% .0% .0%

Daño severo .0% .0% .0% .0%

Necrosis Multifocal**

Ausente .0% 60.0% 80.0% 50.0%

Daño inicial .0% 40.0% 20.0% 50.0% Daño leve 40.0% .0% .0% .0% 0.006 Daño

moderado 60.0% .0% .0% .0%

Daño severo .0% .0% .0% .0%

Hiperemia Pasiva Crónica*

Ausente .0% .0% .0% 25.0%

Escasa 40.0% 100.0% 100.0% 75.0% 0.03 Aumentada 60.0% .0% .0% .0%

* Diferencia significativa p<0.05 **Diferencia muy significativa p<0.01 +Hallazgos comparados utilizando prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis De los cuatro grupos de investigación podemos observar que en el grupo TAA se

obtuvieron hallazgos histopatológicos congruentes con el modelo estandarizado

en el 100% de los ratones, en el rango de leves a severos, para la degeneración

turbia y vacuolar, y la necrosis multifocal, así como un 40-60% para hiperemia

crónica.

En los grupos TAA+SeNa y TAA+EDTA, obtuvieron resultados similares ya que en

ninguno de los ratones tratados se encontraron daños severos, presentándose

hasta en un 60% daños iniciales a leves en degeneración turbia y vacuolar, así

como necrosis inicial e hiperemia escasa únicamente. Adicionalmente en el grupo

TAA+EDTA más del 80% de sujetos no presentaron necrosis alguna.

En el grupo con terapia combinada TAA+SeNa+EDTA entre el 25 al 75% de los

sujetos no presentaron ninguna degeneración histopatológica y entre el 50—100%

no presentaron necrosis alguna. Solo el 75% de los animales tratados presentó

hiperemia pasiva crónica.


67

Como podemos observar existen diferencias estadísticamente significativas entre

los grupos de experimentación en cuanto a lesiones de degeneración turbia,

vacuolar, necrosis multifocal e hiperemia pasiva crónica, obteniendo disminución

en la progresión y gravedad de estos hallazgos histopatológicos para los grupos

terapéuticos.

Sin embargo, se aprecia una diferencia no significativa para las lesiones de

necrosis focal, nótese que en todos los grupos de experimentación, el 100% de los

sujetos de investigación se encontraron en valores sanos, normales o con lesiones

iníciales de necrosis focal (cuadro 7).

Para evaluar la intensidad del daño hepático, se estableció un puntaje por grado

de lesión histopatológico en base a las escalas utilizadas de necrosis,

degeneración hepatocítica e hiperemia pasiva crónica, obteniéndose los

resultados promedio en cada grupo, detallados en el cuadro 8.1. Podemos

observar que el grupo con la menor intensidad de daño hepático es el grupo con

doble terapia, siendo este 11.12 veces menor al daño obtenido por el grupo TAA.

Cuadro 8.- Intensidad de la lesión hepática por grupo de experimentación

Grupo de

Investigación N Rango promedio P Intensidad de lesion TAA 5 17.00 TAA + Se 5 9.20 TAA + EDTA 5 7.10 .008

TAA + Se + EDTA 4 5.88 Total 19

Prueba de Kruskal-Wallis Variable de agrupación: GrupInvest

Como se aprecia en el cuadro anterior, al comparar los resultados de la intensidad

de la lesión hepática global de cada grupo, la diferencia entre los grupos resulta

ser estadísticamente significativa con una p<0.05.


68

El grupo I (TAA) se categorizó como 0% de protección y 100% de Desprotección.

Luego se realizó una correlación con los valores de los otros grupos obteniendo el

siguiente cuadro.

Cuadro 9 – % de protección / % Desprotección Bioquímicos.

Enzimas/ Grupos

% Protección/ % desprotección TAA TAA+SeNa TAA+EDTA TAA+SeNa+EDTA

ASAT (TGO)

% desprotección

100,0% 27,3% 14,6% 9,3%

ALAT(TGP) % desprotección

100,0% 25,0% 12,7% 6,0%

ASAT (TGO)

% Protección 0,0% 72,7% 85,4% 90,7%

ALAT(TGP) % Protección 0,0% 75,0% 87,3% 94,0% De acuerdo a la correlación anteriormente descrita el grupo con terapia combinada

da un porcentaje de desprotección menor y por ende un porcentaje de protección

mayor en comparación con los otros grupos.

Tomando el dato de TAA como 0% de protección y 100% de desprotección

referente a la intensidad de la lesión, la correlación entre los datos obtenidos para

los otros grupos se muestra en el siguiente cuadro.

Cuadro 9.1 % de Protección/ % Desprotección Histopatológica.

INTENSIDAD DE LA LESION / GRUPOS

% Protección/ % desprotección

TAA TAA+ SeNa

TAA+ EDTA

TAA+ SeNa+ EDTA

INTENSIDAD DE LA LESION % Protección 0,0% 45,9% 58,2% 65,3%

INTENSIDAD DE LA LESION % desprotección 100,0% 54,1% 41,8% 34,7%

La correlación muestra que el grupo con terapia combinada posee un % de

protección mayor en comparación con los otros grupos.

Así mismo la correlación entre la histopatología como Gold Standard y los valores

de transaminasas, indican una asociación significativa entre la administración de

SeNa + EDTA y Intensidad de la lesión. Indicando una disminución en la

progresión histopatológica de la injuria hepática.


69

Aplicando la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para análisis de diferencia

entre dos grupos, podemos observar una diferencia estadísticamente muy

significativa entre la intensidad de lesión de los grupos terapéuticos y el grupo

control positivo (TAA), sin embargo, no se aprecia diferencia significativa entre los

resultados de los grupos terapéuticos.

DISCUSIÓN

Modelo experimental de daño hepático crónico mediante Tioacetamida en

Ratones.

El daño hepático crónico puede ser provocado por diversas causas (alcohol, virus,

medicamentos hepatotóxicos, colestasis entre otras) 6, activando una cascada

dinámica que se inicia con el daño del hepatocito, activación de células

inflamatorias por metabolitos tóxicos, activación y proliferación de HSC.

Produciéndose un estrés oxidativo por desbalance entre la producción y

.007

.008

.012

.007 .381

.241.008

.381 .615.012

.241 .615

(J) grupo experimentalTAA + SeTAA + EDTATAA + Se + EDTATAATAA + EDTATAA + Se + EDTATAATAA + SeTAA + Se + EDTATAATAA + SeTAA + EDTA

(I) grupo experimentalTAA

TAA + Se

TAA + EDTA

TAA + Se + EDTA

Sig.

*.

*. *. *. *.

*.

*.

Cuadro 10.- Análisis de diferencias entre grupos experimentales

La diferencia de medias es significativa al nivel .05.


70

eliminación de ERO, estimulando la fibrogénesis. Así mismo, el hierro incrementa

la peroxidación lipídica causando daño celular irreversible. Activando células de

Kupffer que producen más ERO, peroxinitratos y citoquinas fibrogénicas,

contribuyendo a la iniciación y perpetuación del daño hepático.33,37,43 Dicho estrés

oxidativo está profundamente involucrado en el daño hepático inducido por la TAA;

que ha sido evidenciado por la cuantificación de MDA como indicador de la

peroxidación lipídica. 25

Las enzimas que catalizan reacciones REDOX (GPx, superóxido dismutasa,

catalasa) son un importante mecanismo de defensa hepático ante la presencia de

ERO, así como mecanismos de homeostasis para evitar exceso de iones

bivalentes. Los metales como: Se, Fe2+ y Cu2+ entre otros, participan como

cofactores de múltiples enzimas para mantener este delicado balance. 38

Durante la estandarización del modelo, el análisis estadístico, indica que para

daño hepático, el grupo experimental presenta diferencias significativas para

lesiones como la degeneración turbia, necrosis multifocal, e hiperemia crónica, en

comparación con el grupo control negativo. Sin embargo, dicho modelo no llega a

producir fibrosis alguna.

Los resultados obtenidos demuestran la reproducción de un modelo experimental

de daño hepático crónico en ratones mediante la utilización de TAA: caracterizado

por inducción de degeneración hepatocítica turbia y vacuolar, así como necrosis

multifocal, e hiperemia pasiva crónica las cuales como se ha descrito

anteriormente indican la activación de la cascada inflamatoria en el parénquima


71

hepático. Hecho que usualmente antecede la formación de fibrosis, un reconocido

marcador de cronicidad en la injuria hepática. 15,16, 17

La presencia de degeneraciones hepatocíticas turbias en el grupo S, indica que la

infiltración con SSN intraperitoneal causa un efecto deletéreo mínimo, que

podríamos atribuir a diversos factores como el aumento de volumen

intraperitoneal, el estrés causado a los sujetos, y la técnica de infiltración. La

pérdida de uno de los sujetos debido a sepsis demuestra el cuidado que se debe

tener en cuanto a la manipulación de los sujetos y la adecuada técnica para la

infiltración ya que estos factores son los que mayormente influyen en el desarrollo

de complicaciones pudiendo afectar los resultados de los experimentos .

Evaluación del efecto hepatoprotector del EDTA y del SeNa

Los resultados obtenidos sugieren que al exponer artificialmente el tejido hepático

a una sustancia hepatotóxica como TAA y suministrarle las condiciones antes

descritas, se observa que no es posible evitar por completo una injuria hepática,

sin embargo es posible limitar la progresión de esta.

En el estudio realizado, la terapia con SeNa, evidenció una leve disminución en

necrosis multifocal, ausente en un 60% y una hiperemia pasiva crónica escasa. En

comparación con el grupo TAA con necrosis multifocal presente en el 100% e

hiperemia crónica aumentada; sugiriendo que la administración exógena de SeNa

disminuye pero no detiene el daño causado por TAA.25

En el grupo con terapia de EDTA, se evidenció ausencia de necrosis en el 60% de

los sujetos de estudio y una hiperemia crónica similar al grupo con SeNa.


72

Una mejor respuesta hepatoprotectora, se obtuvo por parte del grupo con EDTA y

SeNa (65.3%) en comparación con los grupos con monoterapia de EDTA (58.2%)

y SeNa (45.9%) como se observa en las Figura 12.

El daño hepático está asociado a una serie de cambios sistémicos como

retención de líquidos, y aumento del peso hepático; estos datos se correlacionan

con el aumento de peso total presentado en los grupos TAA, TAA+SeNa y

TAA+EDTA. El aumento más marcado fue en el grupo TAA el cual demostró

daños histopatológicos y enzimáticos severos. En contraste, el grupo con doble

terapia fue el único con una leve disminución del peso final en comparación al

peso inicial. Sugiriendo que las alteraciones hepáticas causadas por TAA no

ocasionaron cambios en el peso. Sin embargo, este grupo fue el más expuesto a

manipulación para la administración de los componentes, lo cual pudo haber

influido en el patrón alimenticio de los animales de experimentación.

Es importante considerar además del potencial como terapia, la importancia de

los resultados debido a la disponibilidad de SeNa en los suelos de origen

volcánico como el nuestro y la mayoría los suelos del trópico húmedo en

Latinoamérica70, 71 la cual suele ser de concentraciones bajas, en particular debido

a que las formas de Selenio comúnmente encontradas, son insolubles y las menos

disponibles para su absorción por las plantas.72 Los niveles bajos de Selenio se

han encontrado en patologías hepáticas, por lo que la baja disponibilidad de

Selenio en suelos nacionales, podría disminuir las ventajas de este antioxidante

para nuestra población.


73

Estudios realizados con aplicación de TAA demuestran una significativa

correlación negativa entre la actividad de TrxR y GPx; y una concomitante

disminución del contenido hepático de Selenio.25 La producción de ERO disminuye

la biodisponibilidad de Selenio y su utilización por las GPx, por lo que su

suplemento adicional beneficiaría la actividad de GPx. Como podemos observar

en los resultados obtenidos el grupo TAA+SeNa presenta menores daños

hitopatológicos que el grupo TAA, con valores de transaminasas más cercanos a

valores normales y con un porcentaje de protección 45.9% mayor; sugiriendo una

mejoría parcial en la actividad antioxidante. 25,27

El EDTA gracias a sus propiedades quelantes es capaz de reducir la cantidad de

iones bivalentes de hierro, de manera moderada evitando la interacción con

reacciones de peroxidación73 y estrés oxidativo, reduciendo la producción de

radicales libres; sin embargo, aunque existen vías de peroxidación lipídica

independientes de las reacciones de FENTON estas no representan una

formación de radicales libres significativa. Es así como dicho efecto se ve

reflejado en el grupo TAA+EDTA, que obtuvo un porcentaje de protección del

58.2%, resultando en daños histopatológicos iniciales a leves, similares a los del

grupo TAA+SeNa, además, en comparación con éste, se encontró una menor

elevación de los valores de transaminasas, acercándose más al valor normal.

Como se describió anteriormente, el efecto antioxidante del SeNa ha demostrado

ser cofactor importante de GPx, que cataliza la reducción de ERO, disminuyendo

el estrés oxidativo, aumentando la degradación de colágeno y disminuyendo la

producción de éste al reducir la activación de células estearato. Siendo esta la


74

causa mas probable de limitación del daño hepático con la utilización del SeNa,

logrando potenciar dicho efecto con la suplementación de EDTA como agente

quelante, el cuál disminuye la producción de ERO y aumenta así el efecto

antioxidante.32, 56, 57

Esta actividad sinergizante, se ve evidenciada en el grupo TAA+SeNa+EDTA, con

un 25% de sujetos sin daño hepático y un 75% con daños iniciales a leves. Siendo

además, el único grupo con valores de TGO y TGP en rangos normales,

conservando por ende la funcionalidad hepática. Obteniendo así, un porcentaje de

protección hepática (65.3%) mayor al logrado por SeNa y EDTA como

monoterapia. Por lo que la terapia combinada, podría contribuir a disminuir la

producción de ERO, aumentar la biodisponibilidad de Selenio y la actividad de

GPx, disminuyendo el daño hepático. 32, 56, 73

Los datos estadísticos muestran una diferencia muy significativa entre las terapias

utilizadas y el grupo con TAA únicamente, indicando una disminución en la

progresión y gravedad del daño hepático crónico, no encontrando aun así alguna

diferencia entre cada uno de los grupos terapéuticos. Sin embargo, los datos

histopatológicos y principalmente enzimáticas demuestran que la terapia

combinada posee mayor efectividad en la disminución de la progresión en el daño

hepático. Representando una buena opción como tratamiento coadyuvante ya que

posee un costo-beneficio mejor en comparación con terapias quelantes actuales.


75

CONCLUSIONES

• El modelo de daño hepático con TAA en ratones es efectivo para producir

daño hepático crónico, sin embargo requiere más tiempo para llegar a fase

de fibrosis y cirrosis.

• La utilización de SSN vía intraperitoneal causa efectos deletéreos mínimos

en el parénquima hepático.

• La monoterapia con SeNa o EDTA es efectiva en reducir la intensidad de la

lesión en comparación al grupo de TAA.

• El SeNa y el EDTA tienen efectos similares en hepatoprotección ante un

daño hepático crónico.

• La combinación de SeNa como antioxidante y el EDTA como quelante de

iones bivalentes reducen la progresión y la gravedad del daño hepático

crónico disminuyendo los niveles de transaminasas a valores normales.

• El EDTA como agente quelante de hierro representa una terapia más

económica que la deferroxamina.


76

RECOMENDACIONES

• Ampliar el tiempo de administración de TAA como agente hepatotóxico para

lograr fases más avanzadas del daño hepático crónico como fibrosis y

cirrosis.

• Comprobar el efecto hepatoprotector de EDTA y SeNa en otros modelos

animales de inducción de daño hepático crónico.

• Utilizar nuevos agentes antioxidantes en combinación a EDTA en

hepatopatía crónica para comparar sus efectos con los obtenidos por SeNa

y EDTA.

• Aumentar la muestra de los grupos experimentales.

• Medir niveles de SeNa, proteínas séricas y marcadores indirectos de

disfunción hepática como bilirrubinas y la vía intrínseca de la cascada de

coagulación TTPa, así como marcadores directos de estrés oxidativo como

MDA.


77

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