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Proyecto CGPI 20070768

ESTUDIO DEL AISLADO Bacillus subtilis DAF-1. SU PERFIL EXOENZIMÁTICO Y SU

ACCIÓN ANTIBIÓTICA.

DIRECTOR

Dr. RAMON CRUZ CAMARILLO

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RESUMEN

En la Isla de Trinidad y Tobago las hojas de la planta Spondia mombin son usadas

tradicionalmente por la gente frotándolas sobre la piel para tratarse las micosis dérmicas.

En 2003 los Dres. Ammons y Rampersad aislaron del filoplano de tales hojas, una bacteria

a la que denominaron Bacillus sp. DAF-1 (de Dermatophyte Antifungal-1), la cual presentó

acción antimicótica contra Tricophyton rubrum. Ya en nuestro laboratorio, dicho aislado

fue identificado como Bacillus subtilis por pruebas bioquímicas (API 50 CHB) y por

secuenciación de 16S rDNA.

En el presente estudio se investigó la potencialidad biotecnológica de B. subtilis

DAF-1 para producir exoenzimas y antibióticos.

Su perfil exoenzimático resultó predominantemente proteolítico, pues produjo altos

niveles de caseinasa, queratinasa, colagenasa y elastasa. De cinco polisacáridasas

estudiadas produjo en cantidad relevante sólo la pectinasa y en menor grado la amilasa.

Secretó niveles moderados de lipasa, fosfolipasa y esterasa. Produjo DNasa en muy baja

cantidad. Las enzimas más atractivas pudieran ser las queratinasas, para aprovechar

desechos queratinosos como son las plumas resultantes del sacrificio de aves.

Por otra parte, los antibióticos secretados por DAF-1 mostraron un amplio espectro

inhibitorio sobre bacterias Gram-positivas y negativas como: Staphylococcus aureus,

Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Salmonella typhi,

Salmonella thyphymurium y Serratia marcescens. También sobre algunos hongos

filamentosos como: Alternaria sp., Aspergillus niger; Curvularia sp., Fusarium sp.,

Helmintosporium sp., Mucor rouxii, Trichoderma ressei, Paecilomyces fumosoroseus y dos

levaduriformes: Candida albicans y Cryptococcus neoformans. Los estudios cinéticos

referentes a la producción de antibióticos por B. subtilis DAF-1 indicaron que éstos se

forman principalmente en la fase estacionaria del crecimiento (origen no ribosomal). Los

productos secretados por DAF-1 cultivado en caldo nutritivo dieron un perfil diferente

según se ensayase sobre S. aureus, P. aeruginosa o C. albicans. Las curvas de crecimiento

de DAF-1 mostraron importantes fluctuaciones poblacionales durante la fase estacionaria

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en dos medios de cultivo de diferente complejidad, así como fluctuaciones en el efecto

inhibitorio de los compuestos antibióticos sobre C. albicans que probablemente están

asociadas a eventos periódicos de esporulación-germinación.

Los antibióticos secretados por B. subtilis DAF-1, fueron termoestables, de

naturaleza peptídica, de carácter hidrofílico y de bajo peso molecular. Finalmente se

estableció un proceso para producir, aislar y purificar mediante cromatografía en gel, al

menos aquellos antibióticos con un peso molecular cercano a los 700 Da.

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SUMMARY

The Spondia mombin leaves are rubbed on the skin by people to relief dermic

mycosis in the Trinidad-Tobago Island. From such leaves, a bacterium named Bacillus sp.

DAF-1 (derived from Dermatophyte Antifungal) was isolated in 2003 by Drs. Ammons and

Rampersad which and secreted antibiotic substances against Trichophyton rubrum. In our

laboratory the strain DAF-1 has been identified by means of API-50CHB biochemical test

and by sequencing its 16S rDNA as B. subtilis.

The aim of the present study was to search the production of exoenzymes, as well as

antibiotic substances by B. subtilis DAF-1.

DAF-1 produced high levels of caseinase, keratinase, colagenase and elastase.

Among five assayed polysaccharide-degrading enzymes, only pectinase and in lesser extent

amylase were produced. The amounts of lipase, phospholipase and esterase were moderate,

while production of DNase was very low. The most attractive enzyme could be the

keratinase, that could be used for transforming keratinous wastes like the chicken feathers

to protein hydrolyzates, that could be useful as animal fed.

More interesting results were the antibiotic substances produced by B. subtilis

DAF-1, because they inhibited the growth of Gram-positive and Gram-negative bacteria as

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Escherichia

coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium and Serratia marcescens. A numerous

group of filamentous fungi and yeast as: Alternaria sp., Aspergillus niger, Curvularia sp.,

Fusarium sp., Helmintosporium sp., Mucor rouxii, Trichoderma reesei, Paecilomyces

fumosoroseus, Trichophyton rubrum, Candida albicans and Cryptococcus neoformans

were also inhibited. The kinetic studies about the antibiotics production by B. subtilis

DAF-1 showed that they were secreted in the stationary phase of growth (non-ribosomal

origin). The inhibitory profiles for the antibiotics produced by DAF-1 in nutrient broth

were different over S. aureus, P. aeruginosa y C. albicans. The growth curves of

B. subtilis DAF-1 in two culture media showed notorious fluctuations in the bacterial

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population and also showed a different antibiotic effect on C. albicans; probably

associated to periodic events of sporulation-germination.

Some of the antibiotics produced by B. subtilis DAF-1 resulted thermostable,

hydrophilic, with a high stability at pH between 6-7.5. Their chemical nature corresponded

to low molecular weight peptidic compounds. Finally, a process including the production,

isolation and purification by gel chromatography of the antibiotics was achieved.

K L M

Introducción

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1.0 INTRODUCCION

1.1 Procedencia y características relevantes de la cepa DAF-1

En la Isla de Trinidad en Sudamérica, algunas personas utilizan de manera empírica

las hojas de la planta Spondia mombin, para tratar las micosis dérmicas. El tratamiento

consiste en la frotación de las hojas sobre las zonas enfermas. Fue a partir de hojas de esta

planta que en 2003 los Dres. David Ammons y Joanne Rampersad de la Universidad de

West Indies de dicha isla, aislaron una cepa bacteriana secretora de antibióticos activos

contra Trichophytum rubrum, el hongo productor del pie de atleta.

El aislamiento de bacterias productoras de antibióticos con acción antifúngica, a

partir de la superficie de hojas vegetales es un hecho conocido y reportado. Por ejemplo,

en la patente 20030186852 (USA), referente a la producción de formulados para el control

biológico de cultivos de interés agrícola, se menciona el uso de una cepa de Bacillus

subtilis que produce sustancias insecticidas, antifúngicas y antibacterianas. Esta cepa

particular fue aislada de hojas de una planta silvestre (Heins et al. 2003). La presencia de

una flora antimicótica en la superficie foliar, ha permitido suponer que se trata de un

mecanismo natural que permite proteger a las plantas del ataque de hongos fitopatógenos.

Por todo lo anterior, sería importante estudiar un microorganismo que ha sido

aislado de la superficie foliar de una planta, el cual posiblemente posee actividad

antimicrobiana contra una gran variedad de hongos y bacterias, y que pudiera también

producir otro tipo de compuestos de interés biotecnológico.

Fue así que se estableció un convenio extra-oficial de colaboración científica entre

el laboratorio de los Doctores Ammons y Rampersad y el de Enzimas Microbianas de la

ENCB, basado en un interés mutuo en el área de la Biotecnología Microbiana. En el caso

concreto del aislado DAF-1, interesa conocer por una parte su identidad taxonómica, sus

características morfológicas y bioquímicas; y por otro, investigar su potencial como

productor de sustancias de interés económico como antibióticos y enzimas extracelulares.

Introducción

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Uno de los primeros pasos dentro de la investigación fue identificar la cepa DAF-1,

para definir si pudiera ser patógena. En el Laboratorio de Bacteriología Médica de la

ENCB, la cepa DAF-1 fue identificada como Bacillus subtilis por pruebas bioquímicas

API 50 CHB. Posteriormente, con el apoyo del Dr. Jorge E. Ibarra del CIVESTAV-

Irapuato se comprobó este dato mediante la secuenciación de genes en su 16S rDNA.

1.2 Generalidades sobre Bacillus subtilis

B. subtilis es una bacteria Gram-positiva, aerobia facultativa. Es un bacilo que rara

vez se agrega en cadenas, y que produce una endospora resistente al calor y otros agentes

físicos y químicos. Además presenta motilidad mediante flagelos perítricos. Su pared

celular está compuesta de 75 % de fosfolípidos. Es una bacteria que puede crecer en un

medio mínimo sin requerir factores de crecimiento, por lo que se puede aislar de agua,

suelo, aire y residuos de plantas en descomposición. También se le ha aislado de suelos

contaminados (5).

B. subtilis puede producir altos niveles de una variedad de enzimas extracelulares que

le permiten degradar pectina y otros polisacáridos de origen vegetal como el almidón.

También produce proteasas, DNasas y lipasas entre otras. Esto hace posible que pueda

degradar una gran variedad de sustratos, lo que propicia su crecimiento en una gran

diversidad de habitats. ��

1.3 B. subtilis, sus enzimas y otros productos de interés

Muchos microorganismos del genero Bacillus son utilizados a nivel industrial. En

específico B. subtilis es la bacteria de preferencia por tener pocas exigencias nutricionales,

ser inocua y de fácil manejo; por su elevada velocidad de crecimiento, su capacidad de

producir enzimas extracelulares, y por crecer en un amplio intervalo de pH. Presenta

también resistencia a altas temperaturas, lo que resulta beneficioso para muchos procesos

fermentativos. Además su característica de producir sustancias antibióticas permiten la

Introducción

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conservación de ciertos productos, sin necesidad de agregar conservadores, como es el

caso del fermentado de soya de origen japonés denominado natto, y de productos similares

fabricados en Tailandia y China. Es interesante resaltar que aunque dentro del

género Bacillus se encuentran B. anthracis, un microorganismo en extremo patógeno

hacia el hombre y algunos animales, así como B. cereus que causa gastroenteritis

en humanos; B. subtilis es una especie libre de exotoxinas y endotoxinas, por lo que

la Food and Drug Administration (FDA-USA) le ha otorgado el status de organismo

GRAS, o generalmente seguro (Generally Regarded As Safe) (Stein 2005). Las principales

enzimas producidas por esta bacteria son utilizadas en una gran diversidad de industrias,

como son las α-amilasas, celulasas, hemicelulasas y pululanasas usadas en la industria

del pan; las proteasas utilizadas en la industria del queso, derivados de la carne

y del pescado; las proteasas alcalinas (pH óptimo 8.5 y 10.3-10.8) en la industria

de los detergentes. En la industria de las bebidas y del almidón se utilizan

las α-amilasas, β-glucanasas, descarboxilasa α-acetolactato y xilanasas. Todas ellas

han sido producidas con cepas de B. subtilis modificadas genéticamente (1); sin embargo,

se han encontrado cepas silvestres que producen enzimas en grandes cantidades como la

cepa B. subtilis KMS-635 que produce entre 20-25 g/L de celulasa extracelular (Schallmey

et al. 2004). Además de lo antes mencionado, esta especie es utilizada también para la

síntesis de nucleótidos de purina y adenina, así como riboflavina, suplementos alimenticios

como el ácido poli-γ-glutámico y potenciadores del sabor (Rao et al. 1998, Dauner et al.

2002, Schallmey et al. 2004).

Por otra parte, es conveniente aclarar que B. subtilis es la bacteria que se usa como

modelo para las bacterias Gram-positivas. La cepa más estudiada es la Marburg 168, de la

cual se conoce su genoma completo desde 1997, encontrándose que al menos 4 % de los

4.2 Mbp del mismo, codifican para proteínas involucradas en la biosíntesis de metabolitos

antimicrobianos (Kunst et al.1997). Esto explica porqué B. subtilis es uno de los

microorganismos más utilizados en procesos biotecnológicos. En años recientes la mayoría

de los estudios referentes a esta especie se han enfocado a la producción de proteínas

heterologas, ya que es posible controlar sus niveles de expresión y hacer posible la

Introducción

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sobreproducción de sustancias de interés, mediante la modificación de zonas promotoras

en estos genes de expresión (Westers et al. 2003).

Otra área de interés en el estudio de B. subtilis, y en general del género Bacillus, es

su capacidad de producir antibióticos. Desde comienzos de los años 70s, el interés en su

estudio ha ido en incremento, puesto que muchos microorganismos han desarrollado

resistencia a los antibióticos de uso más frecuente, por lo cual ha sido necesaria la búsqueda

de nuevos fármacos.

1.4 Generalidades en relación con los antibióticos del género Bacillus

En 1977 Katz & Demain publicaron una revisión de los compuestos con actividad

antibiótica producidos por el género Bacillus. En base a tal revisión se concluyó que sus

características más relevantes son:

� La mayoría son de naturaleza peptídica y están compuestos de aminoácidos,

pero pueden poseer también residuos de ácidos grasos.

� Sus pesos moleculares son menores al de las proteínas, y van desde

270 (bacilisina) hasta 4,500 (licheniformina).

� Un mismo microorganismo puede producir familias de antibióticos, los

cuales pueden diferir en unos cuantos aminoácidos.

� La mayoría de los antibióticos peptídicos son de estructura cíclica. Unos

pocos son de estructura lineal (edeina, gramicidinas).

� Frecuentemente los antibióticos peptídicos contienen aminoácidos que son

únicos, y por tanto no se encuentran en las proteínas, tales como

D-aminoácidos, aminoácidos básicos (ornitina, ácido diaminobutirico),

β-aminoácidos, dehidroaminoácidos (dehidroalanina) y aminoácidos con

átomos de azufre (lantionina).

Introducción

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� Los antibióticos peptídicos de Bacillus no contienen residuos de ácidos

N-metilamino, como ocurre con los péptidos sintetizados por hongos y

actinomicetos.

� Los péptidos-antibióticos de Bacillus son generalmente resistentes a la

hidrólisis por peptidasas y proteasas de origen animal y de plantas.��

Entre los principales productores de antibióticos del género Bacillus se encuentran:

B. brevis (gramicidina, tirotricina); B. cereus (cerexina, zwittermicina A); B. circulans

(circulina); B. laterosporus ( laterosporina); B. licheniformis (bacitracina); B. Polymyxa

(polimixina, colistina); B. pumilus (pumulina); B. subtilis (bacitracina A, plipastatina,

surfactina, bacilisina, bacilomicina, fengicina, subtilina, micobacillina, gramicidina S,

tirocidina entre otros); y la turicina 17 por B. thuringiensis (Ozcengiz, et al. 1990; Silo-Suh

et al. 1998, Tsuge et al. 1999 y 2001, Vollenbroich et al. 1997, Yu –Shu et al. 2002).

Por otra parte, los antibióticos de origen microbiano se pueden clasificar en dos

grupos: los de origen ribosomal, los cuales son sintetizados durante la fase de crecimiento

exponencial, y los de origen no ribosomal, que se producen durante la fase estacionaria.

1.4.1 Antibióticos de B. subtilis de origen ribosomal

Stöver & Driks (1999) estudiaron la secreción de un agente proteico antibacteriano

al que llamaron Tas A, con peso molecular de 31 kDa, el cual era secretado en la etapa

temprana de la esporulación, y posteriormente era incorporado dentro de las esporas. Sus

estudios mostraron que esta proteína era activa contra algunas bacterias de interés clínico

como Enterobacter cloacae, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, pero no contra

E. aerogenes y Pseudomonas aeruginosa. Por su parte Schnell et al. (1988) reportaron otro

antibiótico de origen ribosomal, producido por la cepa B. subtilis ATCC 6633, al

que se denominó subtilina (lantibiótico), el cual posee puentes meso-lantionina y

3-metil-lantionina. Además contiene aminoácidos inusuales como deshidroalanina y

Introducción

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deshidrobutirina. Se encontró que su estructura es muy similar a la de la nisina, un

antibiótico usado como conservador en los alimentos. La subtilina es activa contra bacterias

Gram-positivas como Propionibacterium acnes, Micrococcus lentus, y algunas especies de

los géneros Staphylococcus, Streptococcus y Clostridium. Se ha visto que los antibióticos

de origen ribosomal tienen la función de servir como precursores de péptidos, el cuál

consiste de un grupo péptido N-terminal líder seguido de un C-terminal propéptido que se

extiende mediante modificaciones postransduccionales. La acción de estos antibióticos está

basada en la formación de poros en la membrana citoplasmática en bacterias Gram

positivas (Corvey et al. 2003).

1.4.2 Antibióticos de origen no ribosomal producidos por B. subtilis

Entre los antibióticos de origen no ribosomal producidos por B. subtilis se

encuentran las surfactinas, iturinas, bacilomicinas y fengicinas, los cuales generalmente son

lipopéptidos constituidos por 7-10 aminoácidos, que conforman una estructura cíclica.

Como ejemplo se muestra la estructura de la iturina A (Figura 1).

Los heptapéptidos cíclicos como la Iturina A, tienen α-aminoácidos en

configuraciones LDDLLDL. Los dos aminoácidos en los extremos de la cadena se unen a

una molécula de un ácido graso de 14-17 átomos de carbono. La variación de un solo

aminoácido, ocasiona cambios en su acción antibiótica (Feigneir et al. 1996, Stöver &

Figura 1.- Estructura química de la iturina A. Tomado de Tsuge et al. 2001.

Introducción

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Driks 1999). Como puede verse en el caso de la iturina A, estas sustancias poseen cargas y

por lo tanto tienen carácter hidrofílico, pero también poseen una región hidrofóbica, por eso

se dice que son sustancias anfipáticas y anfifílicas, que exhiben una fuerte acción

antifúngica, que puede variar dependiendo de los aminoácidos que conforman el grupo

cíclico. Presentan también restringida actividad bacteriana. Los estudios acerca del modo

de acción de este tipo de antibióticos sugiere la formación de poros en la membrana

citoplasmática por provocar desordenes en esta estructura por su carácter anfipático,

ocasionando la pérdida de iones K+ y otros elementos vitales, causando así la muerte de la

célula (Volpon et al. 2006).

Por su parte, Rogers et al. (1965) reportaron que la cepa B. subtilis A14

producía durante la fase estacionaria un compuesto antibacteriano activo contra

S. aureus, al cual se denominó bacilisina. Se encontró que se trataba del dipéptido

L-alaninil-[2,3–epoxiciclohexano-4]-L-alanina (Figura 2). El mismo compuesto fue aislado

en la cepa B. subtilis 168 por Hilton et al. en 1988.

Por otro lado, la surfactina (biosurfactante) es un antibiótico cicloheptapeptídico,

que también ha sido estudiado como agente antitumoral, anticoagulante y antiviral (Carrillo

et al. 2003). Se ha reportado que este antibiótico no solamente lo produce B. subtilis, sino

también las especies B. pumilus, B. licheniformis y B. amyloliquefasciens (Peypoux et al.

1999 y Stein 2005).

�� Figura 2.- Estructura química de dos antibióticos de origen no ribosomal. Tomado de Yazgan et al. 2001 y Carrillo et al. 2003.

Introducción

��

Mucho se ha especulado sobre la función de la surfactina y estudios recientes

parecen indicar que está involucrado en la formación de biopelículas (Hofemeister

et al. 2004).��

La Figura 3 muestra otros antibióticos que se han estudiado en B. subtilis. Se puede

apreciar que suelen variar en tan solo algunos aminoácidos, tal es el caso de la

micosubtilina y la bacilomicina D; aunque en otros casos su estructura también puede ser

completamente diferente, como ocurre con la bacilisocina y la bacitracina.

Figura 3.- Estructura de algunos antibióticos producidos por B subtilis.

Tomado de Tsuge et al. 2001, Duitman et al. 1999, Tamehiro et al. 2002.

Introducción

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Aún cuando el estudio de los antibióticos de B. subtilis es una área cada vez más

compleja, dista mucho de haberse agotado. La búsqueda de antibióticos de origen

microbiano va en incremento, pues la mayoría de los antibióticos sintéticos causan efectos

secundarios no deseados. Un paso importante en el estudio de los antibióticos es establecer

su espectro de acción, su purificación, y luego determinar su estructura química.

1.5 Antibióticos de origen bacteriano, su purificación y espectro de acción

Wakayama et al. (1984), realizaron la purificación parcial por cromatografía en

capa fina de un antibiótico producido por un aislado identificado tentativamente como

Bacillus cereus SW. Encontraron que su estructura era peptídica y estaba compuesto por

ácido aspártico, serina, ácido glutámico, leucina, tirosina, prolina y un ácido desconocido,

en una proporción 2:1:1:1:1:1:1. Este antibiótico inhibía el crecimiento de hongos y

levaduras, como Conidiobolus lamprauges, Fusarium oxysporum, Aspergillus nidulans,

Eurotium chevalieri, Mucor rouxianus, Penicillium chrysogenum, Cryptococcus luteolus,

Hansenula wingei y Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo no inhibía el crecimiento de

las bacterias S. aureus, B. subtilis, E. coli, Serratia marcescens y Proteus vulgaris.

Zheng et al. (1999), reportaron la purificación de la bacteriocina subtilosina,

producida por la cepa B. subtilis JH64.2. Este compuesto por ser de tipo proteico, fue

purificado mediante cromatografía de intercambio iónico y por filtración en gel.

Por su parte Hagelin et al. (2004), reportaron una familia de 20 nuevos péptidos

cíclicos con actividad antibiótica, a la que denominaron complejo maltacina, activa contra

C. albicans, T. mentagrophytes, A. fumigatus y S. aureus. La cepa utilizada fue aislada de

suelo e identificada como B. subtilis. La purificación del complejo maltacina se llevó a

cabo por HPLC en una columna Wydac C18, utilizando como fases móviles, una solución

de agua-ácido trifluoro acético (TFA) al 0.1 % y acetonitrilo-TFA al 0.1 %.

La caracterización de los péptidos fue llevada a cabo mediante espectrometría de masas

(MS) y espectrofotometria UV-IR.

Introducción

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Ström et al. en 2002, encontraron dipéptidos cíclicos con actividad antifúngica,

pero con un espectro de acción pequeño, pues solamente eran activos contra unos cuantos

hongos y levaduras. Estos compuestos fueron producidos por Lactobacillus plantarum cepa

MILAB 393. Dicha cepa fue aislada de pasto y el ensayo de su actividad inhibitoria se

realizó en placa. Los microorganismos sensibles fueron A. fumigatus, Fusarium

sporotrichoides y la levadura Kluyveromices marxianus. La purificación de los antibióticos

se llevó a cabo por HPLC en una columna C18, usando como fase móvil una solución de

acetonitrilo al 95 %. La identificación de las estructuras fue realizada mediante resonancia

magnética nuclear, MS y cromatografía de gases. Los dipéptidos encontrados fueron ciclo

(L-Phe-L-Pro) y ciclo( L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) y ácido fenil-láctico. Un año después, en

2003, Sjögren & Magnusson reportaron que ácidos grasos 3-hidroxi secretados por

Lactobacillus plantarum MiLAB14 presentaban actividad antifúngica. Los compuestos

encontrados fueron ácido 3-(R)-hidroxidecanoico y ácido 3-hidroxi-5-cis dodecanoico. La

máxima producción de estos compuestos ocurría alrededor de las 38 h de incubación del

cultivo. Los datos antes mencionados podrían considerarse ejemplos de como se producen

algunos antibióticos microbianos, lo amplio que puede ser su espectro de acción, las

condiciones y el momento en que se originan. También se dan algunos indicios sobre la

metodología que podría emplearse para su purificación y caracterización.

En suma, considerando que la cepa B. subtilis DAF-1, aislada del filoplano de las

hojas de Spondia mombin presenta actividad contra una cepa de T. rubrum, se puede

especular que pudiera actuar también contra otros hongos, y probablemente contra diversas

bacterias. Puede suponerse también que tiene la capacidad de producir enzimas de interés

biotecnológico. La comprobación de estos supuestos constituye el objetivo del presente

estudio.

Objetivo y metas

��

2.0 OBJETIVO

Estudiar la capacidad del aislado Bacilus subtilis DAF-1 de producir sustancias de

interés biotecnológico, como enzimas y antibióticos extracelulares.

3.0 METAS

3.1 Estudiar el perfil enzimático extracelular de la cepa B. subtilis DAF-1.

3.2 Reunir una colección, lo más amplia posible, de bacterias y hongos de

interés médico, agrícola y biotecnológico, que sirva como blanco para estudiar

el espectro antibiótico de DAF-1.

3.3 Averiguar cualitativamente la capacidad antibiótica de B. subtilis DAF-1 sobre

el acervo microbiano reunido.

3.4 Establecer un ensayo para evaluar cuantitativamente el efecto antibiótico de

los filtrados de DAF-1 sobre microorganismos de interés médico.

3.5 Investigar la cinética de producción del antibiótico usando microorganismos

de interés médico como blanco.

3.6 Caracterizar el antibiótico a nivel de extracto crudo.

3.7 Fraccionar y purificar por métodos cromatográficos o por extracción con

solventes, el o los antibióticos más activos.

��

Justificación

��

4.0 JUSTIFICACIÓN

4.1 Bacillus sp. DAF-1 ha sido identificado como Bacillus subtilis. Esta especie es

considerada generalmente segura (GRAS), y por tanto su empleo biotecnológico

no ofrece riesgos a la salud.

4.2 B. subtilis DAF-1 produce un antibiótico activo contra una cepa del hongo

dermatofito Trichophyton rubrum; por lo tanto podría actuar también sobre otros

microorganismos de interés médico.

4.3 Dado el incremento en las infecciones por hongos, resulta de interés estudiar

nuevas cepas que eventualmente pudieran producir antimicóticos más eficaces.

4.4 Considerando que B. subtilis produce gran variedad de compuestos de interés

económico, es posible que B. subtilis DAF-1 produzca también enzimas

extracelulares de importancia biotecnológica.

Metodología

��

5.0 METODOLOGÍA

5.1 Microorganismos utilizados

En el presente trabajo se utilizaron cepas microbianas de interés médico, agrícola y

biotecnológico, utilizadas como blancos para evaluar la acción antibiótica de DAF-1, o cepas de

referencia productoras de enzimas extracelulares. En las Tablas 1 y 2 se mecionan las personas e

instituciones que donaron las cepas para la realización de este trabajo.

Tabla 1.- Integración de la colección bacteriana para el presente estudio.

Microorganismo Importancia Área de

Interés

Donante / Institución

Aeromonas hydrophila Sch3

Aeromonas hydrophila 839T

Aeromonas hydrophila 54 W



Contaminantes en alimentos marinos y

agua.

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 27853

Puede invadir y causar infecciones de

diversa gravedad.

Escherichia coli 0536 Causa diarrea en niños.

Salmonella typhi 6539 Puede producir fiebre tifoidea si

presenta el serotipo específico.

Salmonella typhimuriumm

14028

Aislado de toxiinfecciones alimentarias.

* Staphylococcus aureus

ATCC 25923

Presenta varios factores de virulencia

como: proteína A, hemolisinas,

exotóxinas. Resistencia a agentes

antimicrobianos.

Médico y

sanitario

Dra. Graciela

Castro

Escarpulli,

Lab. de

Bacteriología

Médica, Depto.

de

Microbiología,

ENCB.

Metodología

��

Tabla 1 (continuación)

Microorganismos Importancia del microorganismo Área de

Interés

Donante /

Institución

** Erwinia carotovora

Produce pectinasas, es responsable

de la pudrición blanda de la papa.

Fitopatógeno

Dr. Isaac Luna

Guerrero

Lab. de

Fitopatología,

Depto. de

Microbiología,

ENCB.

** Bacillus thuringiensis 132

** Bacillus thuringiensis NGRA

Producción de cristales insecticidas.

Biotecnológico

** Serratia marcescens WF

Patógeno oportunista, cepa no pigmentada.

** Serratia marcescens NIMA

** Serratia marcescens WTR

Patógeno oportunista, cepas pigmentadas.

Médico

Lab. de

Enzimas

Microbianas,

Depto. de

Microbiología,

ENCB.

La mayoría de los microorganismos citados en la tabla son bacilos Gram-negativos. * Excepto S. aureus que es un coco Gram-positivo. ** Son microorganismos de referencia para acción enzimática.

Tomado de (5)

Metodología

��

Tabla 2.- Integración de la colección de hongos para el presente estudio.

Microorganismo Importancia del microorganismo

Clase Donante / Institución

Aspergillus flavus

Patógeno oportunista, productor de micotoxinas entomopatógeno, fitopatógeno y zoopatógeno.

Hifomiceto

Aspergillus fumigatus

Patógeno oportunista.

Hifomiceto

Aspergillus niger H-179 Patógeno oportunista. Algunas cepas tienen interes biotecnológico

Hifomiceto

Mucor rouxii 080503

Produce mucomicosis gástrica.

��

Zigomiceto��

Trichoderma reesei

Celulolítico, antagonico de fitopatógenos.

Euascomiceto

Lab. de Enzimas

Microbianas, Depto.

de Microbiología,

ENCB.

Alternaria sp.

Entomopatógeno

Hifomiceto��

Aspergillus niger Patógeno oportunista.

También tiene interes biotécnológico.

Hifomiceto

Curvularia sp.

Produce queratitis ocular.

Hifomiceto

��

* Candida albicans (caso médico)

Patógeno oportunista.

Blastomiceto

�

��Cryptococcus neoformans

Presente en micosis sistemicas

Basidiomiceto

Dra. Ma. de Guadalupe

Moctezuma Zarate.

Lab. de Micología

Médica, Fac. de

Ciencias Químicas.

Escuela de Medicina,

Univ. Autónoma de

San Luís Potosí.

Metodología

��

Tabla 2 (continuación)

Microorganismo Importancia del microorganismo

Clase Donante / Institución

Metharizium anisopliae var. Acridum EH-500

Metharizium anisopliae 4681

Entomopatógeno

Fitopatógeno.

Ascomiceto

Paecilomyces fumosoroseus EH-452



Entomopatógeno, bioinsecticida.

Deuteromiceto

Trichophyton rubrum Patógeno oportunista causante del pie de atleta.

Verticillium lecanii EH-457 Fitopatógeno

Hifomiceto

��Candida albicans EH-155 Patógeno oportunista Blastomiceto

Dra. Ma. Judith

Castellanos Noguel

Lab. de Micología de

la UAM-Xochimilco.��

Aspergillus flavus sp.

Patógeno oportunista, productor de micotoxinas, entomopatógeno, fitopatógeno y zoopatógeno.

Fusarium sp. Fitopatógeno

Hifomiceto

Helmintosporium sp. Fitopatógeno Deuteromiceto

Penicillium sp. Patógeno oportunista.

Biotécnológico

Euascomiceto

M. en C. Ramón J.

Arteaga Garibay

Lab. de Fitopatología,

Depto. de

Microbiología, ENCB.

La mayoría de los hongos citados en esta tabla son filamentosos, su pared celular está constituída por quitina-β-glucano. La excepción es Mucor rouxii cuya pared es de quitina-quitosana.

* Son hongos levaduriformes; la pared celular de C. albicans esta constituida por manano-β-glucano y la de C. neoformans por quitina-β-glucano.

Tomado de (3, 4)

Metodología

��

5. 2 Conservación de los microorganismos

5.2.1 A corto plazo

Para la conservación a corto plazo de la mayoría de los microorganismos, se hicieron

resiembras en tubos con agar inclinado de los siguientes medios de cultivo: agar nutritivo, o

agar soya triptocaseina para las bacterias; y agar extracto de papa o agar dextrosa Sabourad

para los hongos. Las bacterias y hongos levaduriformes se sembraron por estría; los hongos

filamentosos por picadura. Una vez que se realizó la siembra, se incubó a 28°C durante 24 h

para las bacterias y 48 h o periodos más largos para los hongos, hasta su crecimiento másivo en

las placas. Una vez crecidos los microorganismos, se conservaron en refrigeración a 4°C. Las

resiembras se repitieron de la misma forma cada mes para bacterias, y cada tres meses para

hongos.

5.2.2 A largo plazo

La cepa B. subtilis DAF-1 se conservó a largo plazo por liofilización de la siguiente

manera. Primero se cultivó en matraz Erlenmeyer de 125 mL conteniendo 25 mL de caldo

nutritivo, a 28 °C durante 24 h y 180 rpm. Posteriormente se sembró masivamente en placas

de agar nutritivo, colocando tiras de papel filtro estéril sobre la superficie. Luego se incubó a

28 °C durante 24 h. Cada tira de papel filtro impregnada con los microorganismos crecidos fue

colocada en un tubo de plástico estéril, previamente sellado por calor en uno de sus extremos.

Los tubos con las tiras de papel fueron transferidos a un frasco estéril, y sometidos a

congelación en una mezcla de hielo seco y alcohol. Se procedió enseguida a liofilizar por un

periodo aproximado de 8 h. Los tubos fueron sellados después por calor en su extremo abierto.

La viabilidad y pureza del liofilizado se verificó reactivando la cepa, cultivándola en caldo

nutritivo, y resembrando luego en placa de agar nutritivo. Después de una incubación de 24 h a

28 ºC, se verificó la pureza colonial y microscópica.

Metodología

��

5.3 Evaluación del perfil exoenzimático de DAF-1

5.3.1 Naturaleza de los sustratos

5.3.1.1 Proteinas

Los sustratos proteicos utilizados fueron caseina, elastina, queratina y colágeno. A

continuación se describen sus diferentes características.

La caseína es la proteína principal de la leche. Es una proteína de forma globular,

soluble, que posee un adecuado balance entre aminoácidos aromáticos, polares, alifáticos,

azufrados, hidroxilados, etc. Su importancia radica en su alto contenido de aminoácidos

nutricionalmente esenciales. La elastina por su parte es una proteína fibrosa, presente en el

tejido conectivo de los animales, principalmente en los ligamentos. En su molécula existe una

elevada cantidad de valina, un aminoácido alifático; de prolina, un aminoácido cíclico, y de

glicina. La queratina es otra proteína fibrosa, insoluble, que forma parte de la piel y de apéndices

como pelo, uñas, pezuñas y cuernos en los animales superiores. Esta proteína es insoluble

debido a su alto contenido de cistina que origina gran cantidad de puentes disulfuro (Lehninger

1971). Por último, el colágeno se encuentra en el tejido conjuntivo en una proporción de 25 a 33

% del total de las proteínas. En la composición del colágeno, el 33 % es glicina; el 21 % es

prolina y el 11% es alanina. Además el colágeno es una de las pocas proteínas conocidas que

tiene derivados hidroxilados como hidroxiprolina y 5-hidroxilisina (White et al. 1983).

��

��

��

Metodología

��

5.3.1.2 Lípidos

��

Como ejemplo de lípidos típicos se tiene a los triglicéridos; es decir ésteres de glicerol

con ácidos grasos, los cuales pueden ser sólidos (grasas), cuando los ácidos grasos son

saturados; o líquidos (aceites) si los ácidos grasos son insaturados, esto es que presenten uno o

más dobles enlaces en su cadena hidrocarbonada. Por otro lado, considerando las lecitinas como

modelo de fosfolípidos, pueden éstas ser definidas como compuestos en donde 2 grupos -OH

del glicerol están esterificados con ácidos grasos, y el tercer grupo -OH está esterificado con la

fosforilcolina. Finalmente, los ésteres son considerados como la combinación de alcoholes con

ácidos grasos. Los ésteres más típicos serían por tanto aquellos donde el alcohol es un

monoalcohol lineal, unido a cualquier tipo de ácido graso.

5.3.1.3 Polisacáridos

El almidón es un polisacárido vegetal de reserva, es una mezcla de 2 polisacáridos

diferentes, la amilosa y la amilopectina. La amilosa está constituida por largas cadenas de

glucosa eslabonadas por enlaces glicosidicos α-1,4, que cada 6 unidades dan una vuelta,

propiciando una conformación helicoidal. La hélice es hidrofóbica en su interior e hidrofílica en

su superficie. La amilosa reacciona rápida y específicamente con el lugol formando un

complejo de color azul, donde átomos de yodo se acomodan en el interior de la hélice. La

amilopectina por su parte es una molécula ramificada. De la cadena de glucosas unidas por

enlaces glicosídicos α-1,4 se desprenden cadenas laterales cada 10-12 unidades, mediante un

enlace glicosídico α-1,6. Las ramificaciones también consisten de glucosas unidas por enlaces

glicosídicos α-1,4. Por su parte la celulosa es también un homopolímero de la glucosa,. Sus

unidades están unidas por enlaces glicosídicos β-1,4. Las largas cadenas lineales resultantes se

agregan en grandes haces llamadas microfibrillas, mediante infinidad de puentes de hidrogeno,

dando lugar a estructuras macromoleculares extraordinariamente resistentes y fuertes, acordes

con la función estructural de la celulosa en los vegetales, donde se encuentran firmemente

Metodología

��

asociada a la lignina y otras sustancias. Por otro lado, la pectina es un polisacárido vegetal

formado de ácido 6 galacturónico en un 65-70% y ácido 6 metil galacturónico en un 30-35 %.

Estos compuestos están unidos por enlaces glicosídicos α-1,4. Los grupos carboxilato de los

ácidos glucurónico y galacturónco pueden estar neutralizados con iones sodio, potasio o

amonio. Se considera que en promedio cada molécula de pectina tiene 1000 unidades de

monosacárido. La pectina se encuentra en forma abundante en la pulpa de ciertos frutos como la

pera o la manzana, y en la cáscara de los cítricos. Este polisacárido tiene muchas aplicaciones

como espesante y/o gelificante en la industria alimentaría.

Entre los polísacaridos de origen animal se encuentran la quitina que es un

homopolisacárido muy abundante en insectos, crustáceos y otros grupos, el cual desempeña un

papel estructural y de soporte, equivalente al de la celulosa en los vegetales. La quitina tampoco

se encuentra libre en la naturaleza, sino que está asociada con proteínas formando complejos

quitino-proteicos. La quitina es una homoglucana formada por unidades de N-acetil-

glucosamina, eslabonadas por enlaces β-1,4 cuyas moléculas se asocian fuertemente en haces

estabilizados por puentes de hidrógeno. Dichos haces están recubiertos por capas

unimoleculares de proteína. Es interesante recalcar que la celulosa y la quitina son los dos

compuestos naturales más abundantes; por lo que podrían ser considerados recursos renovables

por síntesis biológica.

Por su parte la quitosana es un polímero lineal, compuesto por residuos de glucosamina

unidos por enlaces β-1,4, el cual se comporta como policatión a pH ácido. La quitosana puede

considerarse producto de la desacetilación de la quitina, por lo que también se le conoce como

quitina desacetilada. Dicho polímero se encuentra en la pared celular de ciertos hongos, asociada

con otras glucanas y con proteínas.

Metodología

��

5.3.1.4 Ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos son biopolímeros formados de nucleotidos encadenados por enlaces

fosfodiester 3’, 5’. Los nucleótidos por su parte son compuestos formados por una base

nitrogenada, una pentosa y ácido fosfórico. Los ácidos nucleicos pueden ser de dos tipos; ácido

desoxirribonucleico si los nucleótidos contienen las siguientes bases nitrogenadas, adenina,

guanina, timina y citosina, y si además la pentosa es 2´-desoxirribosa. El otro tipo de ácidos

nucleicos son los ribonucleicos, los cuales contienen adenina, guanina, uracilo y citosina y su

pentosa es la ribosa.

5.3.2 Ensayos en medio sólido

Los ensayos en medio sólido se realizaron en placas conteniendo un medio basal

formulado de la siguiente manera (g/L): NaCl 0.250, KH2PO4 0.375, Na2CO3 0.375, MgSO4

0.275, extracto de levadura 1, casaminoácidos 1 y agar 15. Como fuentes de carbono se

añadieron los sustratos inductores correspondientes (Tabla 3). El pH se ajustó a 6.5.

A partir de cultivos frescos crecidos en agar nutritivo de las cepas testigo y de

B. subtilis DAF-1 (24 h, 28 ºC), se inocularon por picadura con palillos estériles los

microorganismos a ensayar en placas conteniendo el sustrato inductor. Las placas inoculadas se

incubaron a 28°C durante periodos variables (dependiendo de la enzima a evaluar). Las

actividades enzimáticas se expresaron en función de la relación de diámetros (halo de hidrólisis-

colonia) tanto de las cepas testigo como de DAF-1. En algunos casos fue necesario añadir

reveladores o indicadores que permitieran observar mejor los halos de hidrólisis, tal como se

indica en la Tabla 3.

Metodología

��

Tabla 3.- Exoenzimas evaluadas en medio sólido.

ACTIVIDAD

ENZIMATICA

SUSTRATO INDUCTOR

(FUENTE DE CARBONO)

INDICADOR

Y / O AGENTE REVELADOR

TESTIGO POSITIVO

OBSERVACION

REFERENCIA

Amilasas

Almidón al 1 %

Solución de lugol

al 1% (solución

reveladora)

B. thuringiensis NGRA

Halo transparente de hidrólisis alrededor de la colonia, sobre un fondo azul debido a la reacción del lugol (yodo) con el almidón remanente.

Dhawale et al. 1982.

Esterasas

Tween 80

al 1 %

No requiere

Serratia

marcescens WF

Halo granuloso de oleato de calcio formado alrededor de la colonia.

Lovell &

Bibel, 1977.

Elastasas

Elastina

al 0.3 %

No requiere

B. thuringiensis

NGRA

Halo transparente alrededor de la colonia debido a la hidrólisis de la elastina.

Janda 1986 y

Kaur et al. 1988.

Proteasas

Caseina al 2 %

No requiere

S. marcescens WF

Borde exterior del halo de aspecto blanco grumoso de paracaseinato de calcio, y un halo transparente alrededor de la colonia por la digestión de la caseína.

Rojas

Avelizapa et al. 1999.

Fosfolipasas (lecitinasas)

Yema de huevo al 3 %

No requiere

B. thuringiensis NGRA

Halo transparente alrededor de la colonia por actividad de lecitinasas tipo A; o un halo opaco debido a la formación de diglicéridos insolubles en agua producidos por la acción de lecitinasas tipo C.

Crisope et al. 1976.

Lipasas

Mantequilla

al 5 %

Resarzurina al 0.02 % (solución

indicadora)

S. marcescens

WF

Halo de hidrólisis de color rosa alrededor de la colonia producido por el vire del indicador resarzurina, debido a la acumulcación de ácidos grasos libres.

Nava Fonseca

1995.

Nucleasas (DNasas)

DNA

al 0.03%

Azul de

ortotoluidina al 0.0025 %

S. marcescens

WF

Halo de hidrólisis de color rosa alrededor de la colonia por cambio en las propiedades espectrofotométricas del complejo colorante –DNA hidrolizado.

Lachica

et al. 1971.

Pectinasas

Pectina al 1 %

Cetrimida

al 5 %

Erwinia

carotovora

Halo transparente de hidrólisis alrededor de la colonia, que es revelado al adicionar la solución de Cetrimida.

Hubbel et al.

1978.

Quitinasas

Quitina coloidal

al 10 %

No requiere

S. marcescens

WF

Halo transparente alrededor de la colonia por la hidrólisis de la quitina.

Rojas

Avelizapa et al.1999.

Quitosanasas

Quitosana coloidal al 2.5 %

No requiere

B. thuringiensis

Bt-132

Halo transparente alrededor de la colonia por hidrólisis de la quitosana.

Sánchez Pérez

2000.

Metodología

��

5.3.3 Ensayos en medio líquido

La producción de quitinasas, celulasas, queratinasas y colagenasas se evaluó mediante la

técnica del cultivo sumergido, utilizando 5 mL del medio sintético basal descrito, adicionado

de los inductores indicados en la Tabla 4 como fuente de carbono. Los cultivos fueron

incubados a 28°C, 180 rpm, durante periodos variables. Despues se centrifugaron a 7000 rpm

durante 10 minutos y se decantaron. Posteriormente a la mayoría de los sobrenadantes

obtenidos se les determinó la absorbancia a 595 nm, el colorante azul brillante de remazol fue

liberado de los diferentes sustratos teñidos por las correspondientes actividades enzimáticas.

Como testigos positivos se inocularon matraces con cepas productoras patrón, y como testigos

negativos se utilizaron matraces sin inocular. En la Tabla 4 se hace referencia a las técnicas

utilizadas en cada actividad enzimática.

Tabla 4.- Exoenzimas evaluadas en medio líquido.

ACTIVIDAD

SUSTRATO INDUCTOR (FUENTE DE CARBONO)

� max

TESTIGO POSITIVO

REFERENCIA

Quitinasas

* Quitina coloidal al 2%

595 nm

S. marcescens

WF

Gómez Ramírez

1999.

Queratinasas

* Lana al 0.4 %

595 nm

B. thuringiensis

NGRA

Cedillo Robles

1998.

Celulasas

* Celulosa coloidal al 5 %

595 nm

Trichoderma ressei

Poincelot & Day

1972.

Colagenasas

* Hide powder azure al 0.4 %

595 nm

S. marcescens

WF

O´Brien & Davis

1982.

Quitosanasas

Quitosana coloidal al 2.5 %

535 nm

B. thuringiensis

132

Sánchez-Pérez

2000.

*Teñidos con azul brillante de remazol.

Metodología

��

Sólo en el caso de las quitosanasas se utilizó como inductor un sustrato sin teñir

(quitosana coloidal). La enzima secretada al medio degrada el polímero hasta pequeños

oligosacáridos, los cuales tienen capacidad reductora, y por lo mismo pueden ser evaluados

mediante la técnica de Miller con ácido 3,5 dinitrosalicílico (Miller 1959). El compuesto

anaranjado formado se evaluó a 535 nm.

5.4 Espectro de acción antibiótica de la cepa B. subtilis DAF-1

5.4.1 Efecto sobre bacterias y hongos levaduriformes usando la técnica de las “placas

césped”

Los microorganismos utilizados fueron reactivados tomando una asada del cultivo

guardado en refrigeración e inoculados en matraces de 125 mL conteniendo 25 mL de caldo

nutritivo en el caso de las bacterias, o caldo dextrosa Sabouraud para las levaduras. Los

matraces se incubaron a 28 ºC durante 18 h a 180 rpm. Luego se realizaron dos nuevos pases,

inoculando cada vez 0.1 mL de las suspensiones microbianas en 25 mL de los medios

correspondientes, e incubando en las condiciones ya referidas. Del último cultivo se tomaron 0.5

mL, que se mezclaron suavemente con 50 mL de agar nutritivo estéril y mantenido a 50 ºC para

el caso de las bacterias, o 50 mL de agar dextrosa Sabouraud estéril y fundido a 50 ºC para las

levaduras. De las mezclas obtenidas se adicionaron 4 mL sobre placas conteniendo 21 mL de los

medios sólidos correspondientes. Para verificar que las placas se prepararon correctamenter,

sólo una placa para cada microorganismo se incubó a 28 ºC durante 24 h, y el resto se guardó en

refrigeración. La observación de un crecimiento abundante, continuo y homogeneo, indicó que

las “placas césped” estaban debidamente preparadas.

Posteriormente, los ensayos se llevaron a cabo inoculando por picadura en la parte

central de las placas césped a la cepa DAF-1 usando palillos estériles. El inóculo de DAF-1

provenía de cultivos frescos en placas de agar nutritivo sembradas por estría cruzada, e

incubadas a 28°C durante 24 h. Las placas césped inoculadas se incubaron a 28 °C durante 24

a 48 h. La acción antibacteriana se apreció por los halos de inhibición formados alrededor de la

colonia de DAF-1.

Metodología

��

5.4.2 Ensayo del efecto antifúngico sobre hongos filamentosos

Cada uno de los hongos se sembró por picadura en el centro de placas de agar dextrosa

extracto de papa, y agar dextrosa Sabouraud, las cuales se incubaron a 28 ºC hasta obtener

colonias bien definidas de aproximadamente 4 cm de diámetro. Posteriormente se hicieron

cuatro inoculaciones por picadura, dispuestas simétricamente en cruz de un cultivo fresco B.

subtilis DAF-1, alrededor de la colonia fúngica. Se continúo la incubación bajo las mismas

condiciones durante el tiempo requerido. La acción antifúngica se manifestó como halos de

inhibición alrededor de la cepa DAF-1.

5.5 Cinética de producción del compuesto antibiótico de B. subtilis DAF-1

B. subtilis DAF-1 se cultivó en matraces de 125 mL conteniendo 25 mL de caldo nutritivo,

o de un medio sintético compuesto por 0.250 g NaCl; 0.375 g KH2PO4; 0.375 g Na2CO3;

0.275 g MgSO4; 0.625 g citrato de amonio; 6.25 mL glicerol; 0.02 g extracto de levadura y

0.02 g casaminoácidos por cada litro de agua. El pH se ajustó a 6.5.

La preparación del inóculo se llevó a cabo tomando una asada de una colonia aislada

de DAF-1, proveniente de un cultivo en placa de agar nutritivo, para inocular un matraz de

125 mL conteniendo 25 mL de los medios referidos. Se incubó a 28 ºC y 180 rpm durante 18 h.

Luego se realizaron dos pases sucesivos inoculando cada vez 0.1 mL de la suspensión

bacteriana fresca, en 25 mL de los medios de cultivo. Para evaluar la cinética de producción

del antibiótico se inocularon matraces conteniendo 25 mL de los diferentes medios, los cuales

se incubaron a 28 °C y 180 rpm. Cada 3 h se colectaron matraces de cada uno de los dos medios

utilizados, durante las primeras 24 h de incubación. Posteriormente los matraces fueron

colectados cada 6 hasta cumplirse las 216 h. De los cultivos recogidos se utilizó 0.1 mL para

determinar la concentración bacteriana por cuenta viable. El resto se centrifugó a 6000 rpm

durante 20 min. El sobrenadante se filtró luego en membranas Millipore con tamaño de poro de

0.22 µm, en condiciones de esterilidad. Los filtrados estériles se sometieron luego a un

Metodología

��

tratamiento térmico de 10 min en baño maría a ebullición, para eliminar la acción de las enzimas

que pudieran estar presentes. Los sobrenadantes tratados se guardaron en congelación hasta su

uso.

5.6 Ensayo de la actividad antibiótica

5.6.1 Preparación de los extractos concentrados del antibiótico

Los extractos libres de células se descongelaron pasándolos al refrigerador (5 ºC) durante

toda la noche. Luego se transfirieron a frascos estériles para liofilizar y se introdujeron en un

baño de hielo seco, girándolos hasta que las muestras se congelaron formando una capa

uniforme sobre la superficie interna de los frascos. Éstos se acoplaron a las tuberías de una

liofilizadora LABCONCO modelo 4451 F, y se concentraron hasta sequedad. Las muestras

liofilizadas se conservaron en congelación a -15 ºC, dentro de un desecador hasta su uso. Para

ensayar su actividad antibiótica, las muestras liofilizadas se resuspendieron con agua estéril a

un décimo del volumen original.

Otra opción para concentrar los extractos consistió en el uso de un evaporador rotatorio

a 60 ºC con presión reducida, hasta disminuir el volumen a la décima parte de su valor inicial.

5.6.2 Ensayo de los extractos antibióticos concentrados

Los extractos preparados como se refirió en el rubro anterior, fueron utilizados para

evaluar su efecto antibiótico sobre tres microorganismos blanco: S. aureus, P. aeruginosa y

C. albicans, utilizando la técnica de las “placas césped”. Los microorganismos blanco se

sembraron en matraces Erlenmeyer de 125 mL, conteniendo 25 mL de caldo nutritivo para los

dos primeros, y caldo dextrosa Sabouraud para C. albicans. Los matraces se incubaron a 28 °C

Metodología

��

durante 18 h a 180 rpm. Después se realizaron 3 pases sucesivos, inoculando cada vez 0.1 mL

de la suspensión del microorganismo, en 25 mL del medio correspondiente. Del último cultivo

se tomó una alícuota de 0.1 mL, la cual se mezcló suavemente con 50 mL del medio propicio

adicionando agar fundido y mantenido a 50 °C. Luego se adicionaron 4 mL de la mezcla

obtenida sobre placas conteniendo 21 mL del mismo medio ya solidificado. Las placas se

utilizaron para ensayar la acción antibiótica del extracto crudo, el cual se aplicó en porciones de

200 µL en círculos de papel filtro de 6 mm de diámetro. Los discos ya impregnados se

colocaron en las placas césped y se dejaron incubar a 28 ºC durante 24 h. La actividad del

antibiótico se evaluó midiendo el diámetro de los halos de inhibición.

5.7 Estabilidad del extracto crudo del antibiótico

5.7.1 Efecto del pH sobre la actividad antibiótica

De los extractos libres de células obtenidos de los cultivos crecidos en caldo nutritivo a

las 168 h o en el medio sintético a las 174 h, se tomaron porciones de 25 mL, cuyo pH fue

ajustado con HCl o NaOH 1N, a valores de 1 hasta 12 en intervalos de una unidad. Después de

dejó actuar durante 60 minutos. El pH de los extractos se neutralizó luego a pH 7.

Para verificar que el efecto inhibitorio se debiera a los antibióticos producidos por la

cepa DAF-1 y no a la adición del acido o de la base, se utilizaron porciones de 25 mL del medio

de cultivo sin inocular, ajustándolas en los mismos valores de pH que las muestras.

Posteriormente se secaron por liofilización y se resuspendieron con 250 µL de agua estéril y se

utilizaron 200 µL para impregnar discos de papel filtro de 6 mm de diámetro, los cuales se

colocaron sobre placas césped de C. albicans y se incubaron a 28 ºC durante 24 h; luego se

midieron los halos de inhibición.

Metodología

��

5.7.2 Estabilidad térmica

Porciones de 200 µL del extracto concentrado y redisuelto se colocaron en tubos

desechables de 1.5 mL, los cuales se introdujeron en un baño maría a 92 ºC durante 0, 10, 20,

30, 40, 50, 60, 120 y 180 min. Posteriormente las muestras se impregnaron en discos de papel

filtro en condiciones de esterilidad, y se colocaron sobre placas césped de C. albicans. Después

se incubó a 28 ºC durante 24 h y se midieron los halos de inhibición correspondientes. Como

testigo negativo se utilizarón las mismas cantidades del medio de cultivo concentrado sin

inocular y se trabajaron bajo las mismas condiciones.

5.7.3 Efecto de distintos solventes

De acuerdo a la literatura consultada, los solventes pueden utilizarse al menos con dos

propósitos en el área de los antibióticos. Uno es la extracción de éstos en las fases iniciales de su

purificación, si los antibióticos poseen un carácter hidrofóbico en alguna porción de su

molécula. Tal ocurre en los antibióticos lipopéptidicos, los cuales poseen un ácido graso. En este

caso se utilizan solventes no polares o poco polares, inmiscibles en agua, como el butanol y el

acetato de etilo. Los solventes hidrofílicos como el metanol y el etanol pueden usarse para

desproteinizar los extractos crudos de antibiótico.

Para ensayar los solventes inmiscibles se tomaron porciones de 50 mL de los extractos

concentrados 10 veces, y a cada una se le realizaron tres extracciones sucesivas con 50 mL de

acetato de etilo o butanol. Las fracciones orgánicas se juntaron y se secaron por evaporación en

un baño maría. Las fracciones acuosas se secaron por liofilización. Posteriormente, cada

fracción se resuspendió hasta 1000 µL con agua destilada estéril. Después se tomaron alícuotas

de 200 µL para ensayar la acción antibiótica como ya fue mencionado.

Para el caso de los solventes miscibles o hidrofílicos (metanol y etanol), se utilizaron 50

mL del solvente enfriado a – 15 ºC, y se mezcló con 50 mL de los extractos resuspendidos en

agua estéril. Para propiciar la precipitación del material proteíco, las mezclas se dejaron reposar

a – 15 ºC por un periodo de 2 h, y posteriormente se centrifugaron a 7000 rpm durante 20 min;

Metodología

��

luego se concentraron por evaporación en un baño maría hasta un volumen aproximado de 50

mL y se liofilizaron hasta sequedad. El material se resuspendió con 1000 µL de agua estéril, y

se utilizaron 200 µL de los extractos procesados para realizar la prueba de acción antibiótica.

5.8 Análisis cromatográfíco de los extractos crudos de antibiótico

Para instaurar un proceso de purificación del antibiótico secretado por DAF-1, es

necesario tener algún indicio de su naturaleza química. En términos generales, los antibióticos

producidos por B. subtilis son predominantemente polipeptídicos, muchas veces cíclicos, y

unidos a moléculas como azucares (glicopéptidos) o ácidos grasos (lipopéptidos). Por tal razón

se hicieron análisis de cromatografía en capa fina, revelando con ninhidrina para detectar

aminoácidos y péptidos; con el reactivo de Morgan-Elson para descubrir la presencia de

aminoazucares, y con 2,3,5 trifeniltetrazolium para distinguir azucares reductores. Los detalles

de las técnicas se dan a continuación.

En placas de 20 cm2 de silica gel, marca Macherey-Nagel (Alugram® Sil G/UV254) se

aplicaron 20 µL de los extractos concentrados libres de células obtenidos durante los estudios

cinéticos, o de las fracciones con actividad antibiótica, recuperadas después de la cromatografía

en columna y luego concentrados por liofilización. Las placas fueron corridas de forma

ascendente con un solvente de desarrollo que contenía n-butanol-metanol-amoniaco al 25 % -

agua destilada (5:4:2:1 v/v). Después de correr (aproximadamente 6 h) y secar a 90 ºC durante

10 min, las placas fueron reveladas con los siguientes reactivos delManual de Reactivos de

Coloración para Cromatografía en Capa Fina y en Papel, de Merck AG.

Metodología

��

5.8.1 Reactivo de ninhidrina- nitrato de cobre para péptidos y aminoácidos

(según Brenner)

La solución pulverizable se preparó al momento disolviendo 40.5 mg de ninhidrina, en

20.2 mL de alcohol etílico absoluto. Luego se adicionaron 4 mL de ácido acético glacial, 0.8 mL

de colidina y 15 mg de nitrato de cobre. Posteriormente se asperjó la placa y se calentó a

100 ºC hasta la aparición de manchas azul-violeta. También se utilizó una solución de ninhidrina

comercial (Sigma N-1411), siguiendo el mismo procedimiento.

5.8.2 Reactivo de Morgan-Elson para aminoazúcares

Solución pulverizable I: Inmediatamente antes de su uso se juntaron 0.5 mL de una mezcla de

5 mL de KOH al 50 % en agua y 20 mL de etanol; con 10 mL de una mezcla de 0.5 mL de

acetilacetona y 50 mL de 1-butanol.

Solución pulverizable II: Se disolvió 1g de 4-dimetilaminabenzaldehído en 30 mL de etanol, y

se mezcló la solución con 30 mL de HCl concentrado.

Técnica: Después de pulverizar con I, se calentó durante 5 min a 105 ºC, y se pulverizó con II.

Luego se desecó 5 min a 90 ºC o hasta aparición de manchas de color rosado.

5.8.3 Reactivo de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolium (TTC) para azúcares

reductores

La solución pulverizable se preparó mezclando 1 volumen de solución al 4 % de TTC

en metanol, con 1 volumen de solución metanólica 1 N de NaOH. El proceso de revelado se

realizó aplicando primeramente la solución pulverizable preparada al momento. Después se

asperjó la placa, y se calentó a 80 ºC hasta la aparición de manchas rojas.

Metodología

��

5.9 Purificación del antibiótico por cromatografía en columna

Un litro del sobrenadante obtenido de cada cultivo de DAF-1 crecido en caldo nutritivo

o en medio sintético, fue colectado a los tiempos previamente establecidos para la producción

de los antibióticos. Después se filtró en membranas millipore de 0.22µm y se concentró hasta

10 mL en un evaporador rotario (60 ºC y presión reducida). Posteriormente se desproteinizó por

adición de 10 mL de etanol frío, dejando reposar a -15 ºC durante 2 h. El sedimento se eliminó

por centrifugación a 7000 rpm durante 20 min. Enseguida se calentó en baño maría a ebullición

hasta reducir el volumen a 1 mL. El concentrado desproteinizado se fraccionó a través de una

columna de 0.9 x 60 cm empacada con Sephadex G-10-120 (límite de exclusión 700 Da).

La elución se realizó con regulador de fosfatos 0.2 M pH 7, colectándose fracciones de

2 mL. En las 20 fracciones colectadas se determinaron las sustancias que reaccionaban con el

reactivo de Bradford (1976), y la presencia de péptidos y aminoácidos que reaccionaban con la

ninhidrina, por el método de Harding (Block & Weiss 1956). También se ensayó la acción

antibiótica sobre C. albicans. Para determinar el volumen vacio (Vo), se utilizó la Dextrana

azul-2000 (masa molecular 2000 KDa).

5.9.1 Determinación de la acción antibiótica en las fracciones eluidas

Se ensayaron dos alternativas. En la primera se utilizaron 200 µL de cada una de las

fracciones resultantes de la cromatografía en columna; en la segunda se ensayaron sólo las

fracciones que dieron positiva la prueba de la ninhidrina. Los detalles del ensayo de la acción

antibiótica sobre C. albicans ya fueron referidas en el rubro 5.7.1.

��

Metodología

��

5.9.2 Ensayo con el reactivo de Bradford

Esta técnica introducida por Bradford en 1976, se utiliza ampliamente para evaluar

proteínas, y se basa en la capacidad que tienen estas sustancias de unirse con el colorante azul

de Coomassie a pH ácido. En el presente caso se utilizó 0.1 mL de cada fracción colectada en la

cromatografía en columna, 0.4 mL de agua destilada y 0.5 mL del reactivo comercial de

Bradford, agitándose de inmediato en un vortex. Se preparó un blanco utilizando 0.5 mL de

agua destilada y 0.5 mL de reactivo de Bradford. Los tubos se dejaron reposar durante 10 min,

y posteriormente se leyeron a 595 nm, calibrando el espectrofotómetro con el blanco de

reactivos.

5.9.3 Determinación de los productos solubles ninhidrina-positivos

Se utilizó el método colorimétrico de Harding (Block & Weiss 1956), basado en la

reacción de los grupos amino con la ninhidrina, dando una coloración desde rojo hasta violeta.

La técnica se llevó a cabo en tubos de vidrio de 16 x 150 mm, utilizando 0.2 mL de cada

fracción colectada en la cromatografía en columna, 1.8 mL de agua destilada y 0.1 mL del

reactivo de ninhidrina. Este se preparó mezclando 5 partes de ninhidrina al 1% disuelta en

piridina, y una parte de ácido acético glacial. El blanco se preparó con 2 mL de agua destilada y

0.1 mL de piridina. Los tubos se introdujeron en un baño maría a ebullición durante 20 minutos,

dentro de la campana de extracción. Después se enfriaron hasta temperatura ambiente y se

leyeron a 570 nm, calibrando el espectrofotómetro con un blanco de reactivos. Los resultados se

interpolaron en una curva tipo de 3 a 30 µg de leucina/mL usada como estándar.

Discusión

��

6.0 RESULTADOS

6.1 Perfil enzimático extracelular de B. subtilis DAF-1

En la tabla 5 se resume la información recabada al estudiar el perfil exoenzimático

de la cepa DAF-1, donde se observa claramente que esta bacteria produce una mayor

cantidad de enzimas de tipo proteolítico (caseinasas, elastasas, colagenasas y queratinasas).

Entre las polisacáridasas se destaca la pectinasa, como ha sido encontrada por otros autores

en B. subtilis. En menor proporción se forman las amilasas y el grupo de las

lipasas-esterasas. Otras enzimas como las celulasas, quitinasas y nucleasas se produjeron a

un nivel bajo. Por otra parte, DAF-1 fue incapaz de producir quitosanasas.

Tabla 5.- Perfil exoenzimático de B. subtilis DAF-1

ACTIVIDADES ENZIMATICAS

PRODUCIDAS EN MAYOR

CANTIDAD QUE LA

OBSERVADA EN LAS CEPAS

DE REFERENCIA

ACTIVIDADES

ENZIMATICAS

PRODUCIDAS EN

CANTIDADES MEDIANAS

ENZIMAS PRODUCIDAS EN

BAJA CANTIDAD

ENZIMAS NO

PRODUCIDAS

Caseinasas Amilasas Nucleasas (DNasas) Quitosanasas Elastasas Lipasas Celulasas Colagenasas Fosfolipasas Quitinasas Queratinasas Esterasas Pectinasas

Discusión

��

6.2 Espectro antimicrobiano de la cepa Bacillus subtilis DAF-1

Se conoce que las cepas de la especie B. subtilis son capaces de secretar una gran

variedad de sustancias antibióticas. Para estudiar el espectro de acción de los antibióticos

producidos por DAF-1, se empezó por integrar una colección microbiana, en la cual se

incluyeron microorganismos de interés médico, agrícola y biotecnológico. Las evaluaciones

se realizaron sobre “placas césped” de cada uno de los microorganismos-blanco.

En el presente estudio se utilizó como prototipo de bacteria Gram (+) a S. aureus

ATCC2593. Este microorganismo es importante en el área médica, ya que puede producir

infecciones con inflamación en las heridas, que pueden llegar a ser de tipo sistémico y

ocasionar la muerte; esto ocurre, cuando la infección no es tratada correctamente y el

microorganismo llega al torrente sanguíneo (5). Con respecto a las bacterias Gram (-) se

conoce que su pared celular está compuesta de lipopolisacáridos (LPS), lo cual les confiere

ciertas características patogénicas. Dentro de los microorganismos utilizados en este trabajo

se encuentran algunas enterobacterias de importancia médica por producir infecciones

nosocomiales y septicemia. La bacteria Gram (-) utilizada como representativa fue

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

No obstante que todas las bacterias utilizadas como blanco fueron sensibles, el

aspecto y el tamaño de los halos de inhibición fue diferente, aún sobre cepas de la misma

especie de A. hydrophila y de S. marcescens. Esto puede deberse a que la sensibilidad de

una especie bacteriana varía de una a otra cepa, aunque también pueden contribuir detalles

técnicos como la cantidad de células que se inoculan, según pudo apreciarse por el tamaño

de las colonias de DAF-1. En todo caso, desde el punto de vista cualitativo, todas las

bacterias ensayadas fueron sensibles a los antibióticos secretados por DAF-1.

Para estudiar el efecto antibiótico sobre hongos levaduriformes se utilizó la misma

metodología que con las bacterias. También en este caso todas las cepas presentaron

inhibición de su crecimiento. Este resultado es relevante pues C. albicans y C. neoformans

tienen importancia médica.

Discusión

��

Con respecto al espectro de acción de los antibióticos de B. subtilis DAF-1 contra

catorce especies de hongos filamentosos, se encontró que nueve de ellas fueron sensibles,

aunque en distinto grado. Éstas fueron: Alternaria sp.; Aspergillus niger (2

cepas); Curvularia sp.; Fusarium sp.; Helmintosporium sp.; Mucor rouxii; Trichoderma

reesei y Paecilomyces fumosoroseus (3 cepas) y Trichophyton rubrum.

Los hongos filamentosos que no mostraron sensibilidad a los antibióticos de DAF-1

fueron: Aspergillus flavus sp. (2 cepas), Aspergillus fumigatus, Metharizium anisopliae

(3 cepas) y Verticillium lecanii.

En suma, se encontró que B. subtilis DAF-1 secreta antibióticos con un amplio

espectro de acción antibacteriana y antifúngica. Algunos de los microorganismos sensibles

tienen gran interés médico por ser patógenos primarios como es el caso de S. aureus,

S. typhi y C. neoformans, o bien oportunistas como A. hydrophila, S. marcescens y algunas

especies de Aspergillus. Otros sin ser productores de infecciones graves, causan molestas

enfermedades difíciles de combatir, como las micosis producidas por T. rubrum. En la

Tabla 6 se resume la información recabada de esta parte de la investigación.

Tabla 6.- Espectro de acción de los antibióticos secretados por B. subtilis DAF-1

Microorganismos sensibles

Bacterias Hongos y levaduras

Microorganismos

resistentes

Aeromonas hydrophila (5 cepas) Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Salmonella typhi Salmonella typhimurium Serratia marcescens (3 cepas) Staphylococcus aureus ATCC 25923

Alternaria sp. Aspergillus niger (2 cepas) Curvularia sp. Fusarium sp. Helmintosporium sp. Mucor rouxii Paecilomycyces fumosoroseus (3 cepas) Trichophyton rubrum Trichoderma reesei Candida albicans (2 cepas) Cryptococcus neoformans

Metharizium anisopliae (3 cepas) Aspergillus flavus (2 cepas) Aspergillus fumigatus Penicillium sp. Verticillium lecanii

Discusión

��

En la Figura 4 se correlacionan la cinética de crecimiento de DAF-1 en caldo

nutritivo, con el tamaño de los halos de inhibición observados al ensayar los sobrenadantes

de los cultivos obtenidos a diferentes tiempos sobre Candida albicans. Puede verse que los

halos de inhibición mostraban diferente tamaño, indicando que existen fluctuaciones en el

efecto inhibitorio. Estos datos sugieren que pudieran estar formándose diferentes

antibióticos cuya concentración pudiera estar fluctuando, probablemente porque

desaparecen o se transforman en otras moléculas antibióticas.

Siguiendo el mismo procedimiento, se estudió el efecto de los antibióticos de DAF-1 sobre

S. aureus ATCC 25923. En la Figura 5 se muestra que en este caso el perfil inhibitorio fue

muy distinto al observado con C. albicans.

Figura 4.- Cinética de producción de los antibióticos secretados por B. subtilis DAF- 1 (� ) cultivado en caldo nutritivo y su efecto inhibitorio sobre C. albicans (�).

Discusión

��

Los resultados sugieren que en este caso se produjeron tanto antibióticos

ribosomales (fase logaritmica), como no ribosomales (fase estacionaria). Del mismo modo,

en la Figura 6 se muestra el efecto antibiótico de los sobrenadantes de los cultivos de

DAF-1 colectados a diferentes tiempos, sobre la cepa de referencia P. aeruginosa

ATCC 27853. En este caso el efecto inhibitorio se presentó durante la fase logaritmica y la

fase estacionaria temprana, y a las 132 h de incubación donde se mantiene casi constante

alrededor de 12 h.

Figura 5.- Cinética de producción de los antibióticos de B. subtilis DAF- 1 cultivado en caldo nutritivo (�) y su efecto inhibitorio observado en las placas césped sobre S. aureus ATCC 25923 (�).

Discusión

��

Los resultados descritos mostraron que los 3 microorganismos estudiados fueron

inhibidos en su crecimiento por los antibióticos producidos por DAF-1, aunque con un

perfil de inhibición diferente y en distinto grado. En el caso de C. albicans los episodios de

inhibición fueron más numerosos y definidos; por esta razón se decidió continuar con este

microorganismo como única cepa blanco. Cabe agregar que posteriormente se realizaron

dos repeticiones de los estudios cinéticos descritos, confirmándose que existen

fluctuaciones tanto en la población de DAF-1 durante la fase estacionaria, como

variaciones en los niveles de producción del o de los antibióticos, y que para cada

microorganismo blanco hay un perfil de sensibilidad particular.

Figura 6.- Cinéticas de producción de los antibióticos de B. subtilis DAF- 1 cultivado en caldo nutritivo (� ) y su efecto inhibitorio sobre placas césped con P. aeruginosa ATCC 27853 (�).

Discusión

��

6.4 Cinética de producción de los antibióticos de DAF-1 activos contra C. albicans,

en dos medios diferentes

Considerando que más adelante se intentaría purificar el o los antibióticos

producidos por DAF-1, se investigaron los niveles de antibiótico que se producían en dos

medios de diferente complejidad. De producirse altos niveles en un medio sencillo se

facilitaría su purificación. Como punto de referencia se consideró la producción en caldo

nutritivo, el otro era un medio sintético que contiene diversas sales, así como glicerol y

citrato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno. Para acelerar el crecimiento

microbiano el medio sintético se le adicionaron casaminoácidos y extracto de levadura al

0.02 % .

Al comparar las cinéticas de crecimiento de la cepa DAF-1 en los medios referidos.

Se pudo apreciar que la concentración inicial de células en ambos casos fue cercana a 105

UFC/mL, y en un lapso de 18 h se alcanzó la fase estacionaria en ambos cultivos. Fue

evidente que en ningún caso se obtuvieron curvas de crecimiento típicas. Las fluctuaciones

en las cuentas viables fueron evidentes, probablemente porque son reflejo de ciclos

“esporulación-germinación”. Sin embargo, para los propósitos del presente estudio puede

decirse que el crecimiento en ambos medios fue similar. Por otra parte resultó evidente que

los antibióticos producidos en ambos medios eran activos contra C. ingens, aunque con un

perfil diferente, lo que sugiere que el tipo y la cantidad de antibióticos dependen también de

la composición del medio del cultivo.

Como el propósito de este experimento era escoger el medio de cultivo más

conveniente y definir el tiempo de máxima producción, aspectos que no pudieron

establecerse, se decidió seguir trabajando con ambos medios. Por razones prácticas se

adoptaron tiempos de cosecha cercanos. En base al tamaño y tipo de halo y a las

consideraciones mencionadas, los tiempos de producción escogidos fueron 168 y 174 h para

caldo nutritivo y medio sintético, respectivamente.

��

Discusión

��

6.5 Caracterización parcial de los antibióticos presentes en los extractos crudos

Con objeto de diseñar un proceso de purificación del antibiótico presente en los

cultivos de DAF-1 en los dos medios citados, se colectaron cultivos a los tiempos

seleccionados, y se procesaron como ya fue indicado. En los extractos crudos obtenidos se

estudió el efecto del pH, la temperatura y diversos solventes sobre la actividad antibiótica.

También se hizo un estudio cromatográfico, con la intención de conocer la naturaleza

química de los antibióticos.

6.5.1 Efecto del pH sobre la actividad antibiótica

La estabilidad a diferentes valores de pH (1h de tratamiento) del antibiótico producido

en caldo nutritivo, se puede observar en la Figura 7. El intervalo de pH donde se conservó

el efecto inhibitorio fue de 6 a 8.5, en base al tamaño de los halos de inhibición. Para cada

tiempo se realizó un blanco de reactivos, con el medio de cultivo sin inocular ajustado al

pH de interés. Estos resultados delimitan el intervalo de pH, en el que debe procesarse el

antibiótico para su purificación. En el caso del antibiótico producido en medio sintético, el

intervalo de pH de máxima estabilidad abarcó de 6 hasta 7.5.

Figura 7.- Estabilidad al pH del antibiótico producido por DAF-1 cultivado durante 168 h en caldo nutritivo (�) y 174 h en medio sintetico (�).

B

pH

Discusión

��

6.5.2 Estabilidad térmica

Los extractos crudos de los cultivos de DAF-1 en ambos medios y que se sometieron

a un tratamiento térmico como ya fue explicado; no presentaron en ambos casos una

disminución considerable en el tamaño de los halos de inhibición. La estabilidad térmica es

una característica deseable en un antibiótico, pues podría utilizarse para la eliminación de

las enzimas y proteínas presentes en el extracto crudo.

6.5.3 Estabilidad en presencia de solventes hidrofílicos e hidrofóbicos.

Con frecuencia, una de las etapas iniciales en la purificación de antibióticos es su

extracción con solventes. Como se indicó en la parte introductoria, muchos antibióticos de

B. subtilis tienen un carácter peptídico, con una estructura cíclica, y están unidos a

moléculas de carbohidratos (glicopéptidos), o a un ácido graso (lipopéptidos). En el primer

caso la estructura resultante es polar e hidrofílica, y en el segundo el antibiótico posee tanto

una región polar hidrofílica, como otra no polar o hidrofóbica. Por eso pueden ser extraídos

en un sistema bifásico inmiscible, formado por una capa acuosa o polar y otra no polar o

hidrofóbica. En el presente caso se mezclaron los extractos acuosos crudos de los

antibióticos de DAF-1, con un volumen igual de n-butanol (Gray et al. 2006), o de acetato

de etilo (Fguira et al. 2005), sin lograr extraer los antibióticos en la fase no polar, lo que

sugiere que tienen carácter hidrofílico. Cuando se agregó etanol frío, se consiguió

desproteinizar el extracto sin afectar la actividad del antibiótico, lo que sugiere nuevamente

que su estructura es hidrofílica. La adición de etanol para desproteinizar los extractos

crudos del antibiótico, fue adoptado en lo sucesivo como una etapa conveniente en la

purificación de los antibióticos de DAF-1.

Discusión

��

6.5.4 Estudio cromatográfico en capa fina

En busca de información acerca de la posible naturaleza de los compuestos

antibióticos producidos por B. subtilis DAF-1 en los dos medios de cultivo, se realizaron

estudios cromatográficos en capa fina de las muestras colectadas a diferentes tiempos, y

luego concentradas 10 veces. Cuando los extractos provenían de cultivos en medio sintético

se aplicaron 20 µL en el cromatograma, y sólo 5 µL si provenían de cultivos en caldo

nutritivo. El solvente de desarrollo fue una mezcla de n-butanol-metanol-amoniaco al 25

%-agua destilada (5:4:2:1 v/v). Después de correr en forma ascendente durante 6 h, las

placas se secaron a 90 ºC por 10 min, y se revelaron con ninhidrina para detectar

aminoácidos y péptidos; con el reactivo de Morgan-Elson que contiene

p-dimetilaminobenzaldehido que es útil para detectar compuestos aminados, y con

2,3,5 trifeniltetrazolium para distinguir sustancias reductoras. En el caso de la ninhidrina se

observó que conforme aumentó el tiempo de incubación, el tipo de manchas y sus colores

fue modificándose haciendo más evidentes algunas de color amarillo. El cromatograma

revelado con el reactivo de Morgan- Elson dió también una serie de manchas de color

verdoso-anaranjado, y ocasionalmente de color violeta. El reactivo de Morgan-Elson

permite detectar sustancias con grupos amino, sean estos aminoácidos o aminoazucares. Es

probable que las manchas observadas sean también debidas a la presencia de compuestos

peptídicos, más que a la de aminoazúcares.

La importancia de estos ensayos fue explorar el tipo de compuestos que podrían ser

los antibióticos producidos por DAF-1, para poder monitorearlos durante su purificación.

Los datos referidos de la cromatografía en capa fina sugieren que la reacción de la

ninhidrina es recomendable para este propósito, y más aún cuando la bibliografía

disponible indica que la mayoría de los antibióticos producidos por B. subtilis son de

naturaleza peptídica.

Discusión

��

6.6 Purificación del antibiótico por cromatografía en columna

Los perfiles cromatográficos de los extractos de antibióticos producidos en en caldo

nutritivo y en medio sintético (Figura 8) son diferentes en forma y concentración,

principalmente en lo referente a las sustancias ninhidrina-positivas, entre las que se

presume pudiera encontrarse el o los antibióticos de DAF-1, probablemente de naturaleza

peptídica y de bajo peso molecular. Concretamente, en caldo nutritivo se observó un pico

máximo en la fracción 11, cuya concentración de aminoácidos, expresada como µg de

leucina es 10 veces superior al obtenido en medio sintético, cuyo máximo correspondió a la

fracción 9. El hecho que las fracciones dieran también una reacción colorida con el reactivo

de Bradford, no necesariamente indica que sean proteínas. Por su bajo peso molecular

puede pensarse que son péptidos que probablemente contienen aminoácidos con radicales

polares, cuyas cargas al pH ácido al que se desarrolla la reacción, permiten la unión por

atracción de cargas contrarias al azul de Comassie que contiene el reactivo de Bradford.

Discusión

��

��

��

��

Figura 8.- Perfiles de elución en una columna de Sephadex G-10-120, de los concentrados con acción antibiótica producidos por B. subtilis DAF-1 cultivado durante 168 h en caldo nutritivo (A) y durante 174 h en medio sintético (B). La linea (�) corresponde a la medición de las sustancias que reaccionaron con el colorante azul de Coomassie (Bradford), y (�) corresponde a las sustancias que reacción con ninhidrina

Discusión

��

Con objeto de purificar aun más los antibióticos en estudio, se reunieron las fracciones

correspondientes a los picos que reaccionaron con el reactivo de ninhidrina, las cuales se

concentraron por liofilización, se disolvieron en 1 mL de agua destilada y nuevamente se

pasaron a través del mismo soporte cromatográfico y el mismo eluyente. De esta primera

cromatografía se tomaron las fracciones 7, 8, 9, 10 y 11 provenientes del caldo nutritivo

(Figura 8A) y las fracciones 8, 9 y 10 para las provenientes del medio sintético (Figura

8B). De esta segunda cromatografía en la columna de Sephadex G-10-120, las

fracciones obtenidas de los extractos provenientes de ambos medios mostraron un solo

punto máximo de la reacción con la ninhidrina y que coincidía con el punto máximo de la

reacción con el reactivo Bradford (Figura 9). A cada fracción se le realizó la prueba de

acción antibiótica sobre placas césped de C. albicans, así como un análisis de

cromatografía en capa fina. Para esta prueba se utilizaron 5 µL de las muestras provenientes

de caldo nutritivo y 20 µL de las provenientes del medio sintético, utilizando como solvente

de desarrollo una mezcla de n-butanol-metanol-amoniaco al 25 %-agua destilada (5:4:2:1

v/v) y ninhidrina como agente revelador. Para el caso de las fracciones provenientes del

caldo nutritivo se encontró que era necesario utilizar otro solvente de desarrollo, por lo que

se decidió utilizar uno con carácter ácido (butanol saturado con agua y ácido acético), que

contrasta con el solvente alcalino usado anteriormente.

Discusión

��

Figura 9.- Segunda cromatografía en Sephadex G-10-120 de los concentrados con acción antibiótica producidos por B. subtilis DAF-1 en caldo nutritivo (A) y en medio sintético (B).

��

Discusión

��

7.0 DISCUSIÓN

7.1 Perfil exoenzimático de Bacillus subtilis DAF-1

Las enzimas extracelulares son ampliamente utilizadas, por su alto grado de

especificad y adaptabilidad a las variadas condiciones en que los procesos industriales

deben llevarse a cabo. En ese rubro las proteasas son las enzimas más utilizadas (40 %

del total) por su versatilidad, pues las hay activas a diferentes valores de fuerza

iónica, pH y temperatura (Rao et al. 1998). Le siguen en importancia las amilasas,

lipasas, invertasa, glucosa oxidasa, pectinasas, celulasas y muchas otras, utilizadas

para elaborar gran variedad de productos de interés biotecnológico (2, 3).

Por otra parte, entre las enzimas extracelulares de origen bacteriano, las más

utilizadas son las del género Bacillus. Su importancia queda manifiesta al considerar que en

2002, el mercado mundial de las enzimas fue estimado en 1.6 billones de dólares y el 50 %

provenía del genero Bacillus (Schallmey et al. 2004). Cabe añadir que dentro de este

género la especie prototípica es B. subtilis, la cual por otro lado es considerada como

generalmente segura (GRAS), y por tanto ideal para la instauración de procesos de interés

biotecnológico.

En este contexto, el perfil de exoenzimas encontrado en la cepa B. subtilis DAF-1

mostró que secreta niveles importantes de proteasas, capaces de hidrolizar sustratos tan

distintos como caseína, queratina, elastina y colágeno, cuyas características ya fueron

brevemente mencionados en resultados. Al respecto la evidencia disponible parece indicar,

que las proteasas formadas en presencia de una proteína dada tienen más bien un carácter

inespecífico. Son abundantes los reportes donde se demuestra que la enzima producida en

medios con desechos de plumas, degradan queratina y también caseína. La actividad se

demostró evaluando con ninhidrina la producción de aminoácidos y péptidos, o usando

sustratos cromogénicos para proteasas (Lin et al. 1996; Manczinger et al. 2003 y

Rozs et al. 2001). Un caso extremo fue la queratinasa extracelular de Trichophyton

mentagrophytes, que ya en estado puro pudo hidrolizar pelo, caseina, colágeno, elastina,

fibrina, fibrinogeno, gelatina, hemoglobina, insulina, ovoalbúmina y hasta 47 sustratos

Discusión

��

peptídicos sintéticos de estructura conocida (Yu et al. 1969). Estos datos parecen avalar la

idea más extendida, de que las proteasas extracelulares son simplemente enzimas inducibles

digestivas, que los microorganismos utilizan parta obtener aminoácidos que sirvan como

fuentes de carbono y nitrógeno. Sin embargo, parece ser mucho más complejo, puesto que

generalmente se secreta un conjunto de proteasas que aparentemente pudieran coadyuvar en

la acción hidrolítica. Su concentración parece tener relación con la fase de crecimiento,

pues según encontró Schaeffer en 1969, la actividad proteolítica se incrementaba en la fase

estacionaria. Igualmente Rao et al. (1998) encontraron que B. subtilis 168 secreta al menos

seis proteasas al final de la fase exponencial, entre las que se encuentran las serín-proteasas

(subtilisinas), proteasas neutras A y B, una proteasa extracelular en menor cantidad,

bacilopeptidasas y metaloproteasas. Por su parte Corvey et al. (2003) encontraron que la

producción de serín-proteasas estaba controlado por varios genes involucrados en la

esporulación. Similarmente, cuando B. thuringiensis Bt-121 se cultiva en medios con

proteínas solubles como caseína, gelatina y hemoglobina, o de proteínas insolubles como

elastina y colágeno, o aún en presencia de materiales queratinosos (plumas), o quitino-

proteicos (desechos de camarón), se produjeron seis proteasas extracelulares diferentes

(Pérez García 2002). Los datos anteriores indican que aún quedan muchos aspectos a

investigar en torno a las proteasas extracelulares microbianas, y por ende, de las proteasas

extracelulares de B. subtilis DAF-1.

Dentro de las polisacáridasas, las que se produjeron en mayor cantidad fueron las

pectinasas, las cuales se consideran una característica de interés taxonómico en B. subtilis.

En cuanto a las amilasas, su producción fue apenas mediana. Cabe señalar que éstas, en sus

diversas categorías, son una característica ubicua del género Bacillus (Priest 1977). Esto no

significa sin embargo, que todas las cepas de las diferentes especies de este género tengan

que ser buenas amilolíticas. En cuanto a la producción de quitinasas y celulasas, DAF-1

produjo niveles muy modestos, que pudieron evidenciarse sólo cuando ésta se cultivó en un

medio líquido, adicionado de los correspondientes substratos coloidales teñidos con azul de

coomassie, y en condiciones de agitación, ya que su evaluación en placa fue negativa.

Dentro de este grupo de enzimas se demostró finalmente que DAF-1 no producía

quitosanasas.

Discusión

��

En cuanto a las tres lipasas-esterasas estudiadas, su producción fue apenas mediana,

lo más destacable fue el hallazgo de que DAF-1 produce lecitinasas de tipo A, evidenciadas

por la formación de halos transparentes en torno a las colonias crecidas en un medio con

yema de huevo, debido a que separan el ácido graso presente en el carbono 1 del glicerol,

produciendo un monoglicérido relativamente soluble en agua, por poseer fosforil-colina.

Con respecto al último tipo de hidrolasas, se demostró que DAF-1 produce muy

bajos niveles de DNasa.

Considerando el perfil enzimático en conjunto, podría afirmarse que DAF-1 es

principalmente proteolítica y además pectinolítica. Ambos tipos de enzimas tienen usos ya

establecidos, pero sería ingenuo proponerles las mismas aplicaciones biotecnológicas, ya

que este es un rubro adecuadamente atendido por compañías nacionales e extranjeras. Sería

más interesante sugerir nuevos usos. En este sentido se podrían estudiar las proteasas de

B. subtilis DAF-1 para el aprovechamiento de subproductos proteicos, por ejemplo las

plumas de pollo, que en gran cantidad se acumulan en los rastros avícolas. Las plumas son

un sustrato muy resistente a la hidrólisis química y enzimática por estar formadas casi

totalmente por queratina, una proteína fibrosa y estructural con un alto contenido de cistina.

Este aminoácido permite la formación de abundantes puentes disulfuro intra e intercadenas

polipeptídicas. Estudios pioneros en este campo fueron llevados a cabo desde 1955 por

Wilder y por Slinger (citados por Block & Weiss 1956), en los que las plumas de pollo se

sometieron a un tratamiento con vapor a alta presión y después fueron molidas finamente.

La harina resultante dio sin embargo pobres resultados para la alimentación de aves. La

composición porcentual de aminoácidos de la harina de plumas indica que contiene arg 7.3;

his 1.7; lis 2.6; tir 2.3, trip 0.9; fen 6.8; cis 7.6; met 0.7; tre 7.5; leu 8.5; iso 6.2; val 7.3; gli

8.9 y ala 5.3 (Block & Weiss 1956). Más recientemente el interés por aprovechar la

queratina presente en las plumas de aves se ha incrementado notablemente mediante el uso

de enzimas queratinolíticas. Los resultados han sido contradictorios, pues por una parte

sigue considerándose que las plumas son sustratos pobremente digeribles, que su

composición en aminoácidos es variable, y que en general tienen bajo contenido de

aminoácidos esenciales como metionina, lisina, histidina y triptofano. Sin embargo, se han

logrado resultados positivos en el crecimiento de ratas y pollos usando harinas de plumas

Discusión

��

pretratadas enzimaticamente (Onifade et al. 1998). Podría concluirse por lo tanto, que dada

la abundancia de los desechos queratinosos, y no estando aún resueltas las formas más

rentables y convenientes para su aprovechamiento por vía enzimática, sigue siendo

atractivo estudiar el posible uso de las queratinasas con este propósito. Al respecto ya se

cuenta con una técnica cuantitativa para evaluar su actividad, usando lana teñida con azul

de coomassie como sustrato (Cedillo Robles 1998). La separación de los péptidos

resultantes de la hidrólisis enzimática podría realizarse también por cromatografía en gel,

usando soportes como sephadex G-10 y G-25, como se hizo en el caso de hidrolizados

enzimáticos de desechos cárnicos y de harinas de pescado (Rojas Avelizapa 1994).

7.2 Actividad antimicrobiana de B. subtilis DAF-1

Cuando se inició el presente estudio se sabía que la cepa Bacillus sp. DAF-1 tenía

acción antimicrobiana contra T. rubrum, aunque se desconocía la naturaleza del compuesto

activo, que en teoría podía ser de alto o de bajo peso molecular. Se ha descubierto al

respecto que una gran variedad de proteínas como β-glucanasas, quitinasas, proteínas PR-1,

proteínas fijadoras de quitina, defensinas, proteínas similares a las ciclofílinas, proteínas

ricas en glicina/histidina y muchas otras, tienen carácter antifúngico (Selitrennikoff 2001).

Pronto se aclaró que el compuesto activo de DAF-1 era termoestable y dializable, por lo

que debía ser no enzimático y de bajo peso molecular. También pudo identificarse el

aislado DAF-1 como B. subtilis, gracias a pruebas bioquímicas (API 50 CHB) y

secuenciación de bases en su 16SrDNA. Esta fue una afortunada circunstancia, pues dicha

especie bacteriana es considerada generalmente segura (GRAS).

El primer aspecto abordado con B. subtilis DAF-1 en el presente estudio, fue

investigar su espectro inhibitorio, encontrando que todas las bacterias utilizadas: S. aureus,

P. aeruginosa, 5 cepas de Aeromonas hydrophila, E.coli, S. typhi, S. typhimurium y tres cepas de

S. marcescens, fueron sensibles. El dato es interesante porque todas tienen interés médico. Se

ensayaron también diversos hongos filamentosos, encontrando inhibición de su crecimiento

en: Alternaria sp, A. niger (2 cepas); Curvularia sp., Fusarium sp., Helmintosporium sp.,

Discusión

��

M. rouxii, P. fumosoroseus (3 cepas), T. rubrum y T. reesei. Algunos de estos

microorganismos pueden ser patógenos oportunistas. No fueron sensibles: M. anisopliae

(3 cepas), A. flavus (2 cepas), A. fumigatus, Penicillium sp. y Verticillium lecanii.

También fue relevante demostrar que dos levaduras de interés médico: C. albicans

y C. neoformans eran sensibles. La primera es un patógeno oportunista causante de

candidiasis y la segunda origina micosis sistémicas en pulmones, piel, huesos, vísceras y

sistema nervioso central (Dolande 2001). Los resultados referidos permiten concluir que

B. subtilis DAF-1 secreta algunas substancias de bajo peso molecular y termorresistentes,

que tienen un amplio espectro inhibitorio sobre el crecimiento de bacterias Gram (-) y

Gram (+), y también sobre hongos microscópicos filamentosos y levaduriformes. Respecto

a estos resultados se pueden comentar dos aspectos: Primero que no existe norma alguna

respecto a cuáles y cuántos son los organismos que debieran ensayarse para establecer si

una cepa productora de antibióticos merece la pena de ser estudiada. Tan importante puede

ser que el espectro de acción sea muy amplio, como ocurrió en este caso, sobre todo si se

incluyen microorganismos de interés médico, veterinario o agrícola; como también sería

importante que el espectro de acción fuera muy restringido, a condición de que involucrase

microorganismos de gran importancia y particularmente resistentes. En este sentido se

puede generalizar que todas aquellas cepas productoras de antimicóticos serán siempre de

interés, puesto que las infecciones por hongos han aumentado de una manera preocupante

(Giono-Cerezo comunicación personal; Wu et al. 2004).Volviendo al punto de comentar la

no existencia de normas oficiales, que validen cuándo una cepa tiene interés para ser

estudiada como productora de antibióticos, la literatura muestra gran diversidad de

resultados en cuanto al número y tipo de microorganismos blanco, los cuales son casi

siempre cepas de colección, y rara vez proceden de aislamientos hospitalarios recientes.

Estos aislados por su parte pueden ir perdiendo virulencia a medida que se someten a

repetidas resiembras en los medios de cultivo convencionales.

El espectro antimicrobiano tan amplio mostrado por B. subtilis DAF-1, podría

deberse en parte a que esta especie microbiana produce gran cantidad de metabolitos con

acción insecticida, antifúngica y antibacteriana, por lo que se han patentado algunas de sus

cepas y ciertos procesos de producción (Heins et al. 2003). Es muy probable que

Discusión

��

dependiendo de la cepa, del medio de cultivo y de las condiciones ambientales ensayadas,

el número y tipo de sustancias antibióticas sea diferente. En una revisión reciente se

menciona que B. subtilis produce más de dos docenas de antibióticos, de una asombrosa

variedad química, aunque la familia predominante son los péptidos, que a su vez pueden

diferir en su estructura (Stein 2005). Sobre la fórmula química de tales antibióticos ya se

hizo una breve descripción en la Introducción del presente trabajo. Cabría agregar que

B. subtilis produce incluso antibióticos volátiles, los cuales son activos contra hongos

fitopatógenos como Rhizoctonia solani y Pythium ultimum. Tales antibióticos son solubles

en agua y permanecen adsorbidos en un medio de Sabouraud glucosa agar (Fiddaman &

Rossall 1993).

El segundo aspecto es que ya establecido el amplio espectro de DAF-1, interesó

instaurar un ensayo cuantitativo confiable. Para el caso se utilizaron como organismos de

prueba S. aureus, P. aeruginosa y C. albicans. Los ensayos turbidimétricos confirmaron

que los tres eran sensibles, y que DAF-1 producía sustancias antibióticas en intervalos

concretos de su curva de crecimiento; su efecto aparecía y desaparecía mostrando un perfil

diferente para cada microorganismo blanco. Como este tipo de ensayos es positivo cuando

ocurre un efecto lítico, se puede suponer que B. subtilis DAF-1 produce sustancias capaces

de lisar bacterias Gram (+), Gram (-) y también levaduras. Al respecto se conoce que

antibióticos de B. subtilis de carácter polipeptídico (21-38 aminoácidos), propician la

formación de poros en la membrana citoplasmatica de bacterias Gram (+), según fue

demostrado por McAuliffe et al. (2001). Otros péptidos, particularmente lipopéptidos

tienen acción antimicótico por su carácter anfipático; una parte de su molécula tiene carga

positiva y otra región es neutra e hidrofóbica. La naturaleza anfipática de estas sustancias

permite destruir la organización de la superficie membranal. Otros péptidos anfipáticos

propician la formación de poros de diferente tamaño, formando canales acuosos que

permiten al paso de iones y solutos polares. En otros casos los antibióticos peptídicos

interfieren en la síntesis de la pared celular, la cual contiene quitina y/o diversas glucanas.

(De Lucca & Walsh 1999).

El otro ensayo utilizado fue el de los discos impregnados con el extracto antibiótico

crudo, previamente concentrado por liofilización. Esta técnica, aunque más laboriosa,

Discusión

��

permitió evaluar el efecto midiendo los halos de inhibición del crecimiento, en placas con

un “césped” del microorganismo blanco. Los datos obtenidos confirmaron la

acción inhibitoria de los antibióticos de DAF-1, sobre los tres microorganismos

blanco: S. aureus, P. aeruginosa y C. albicans. Cada uno mostró un perfil con distinta

susceptibilidad a los compuestos antimicrobianos producidos en diferentes momentos de la

curva de crecimiento de DAF-1. La concentración de tales sustancias, por otra parte,

aumentaba y disminuía. Esta información es congruente con la idea de que B. subtilis no

produce moléculas antibióticas solitarios, sino “cocteles” de los mismos, lo que hace difícil

realizar estudios sistemáticos sobre el espectro completo de producción de antimicrobianos

por una cepa determinada (Stein 2005).

El trabajo fue continuado empleando como organismo de ensayo sólo a C. albicans,

y evaluando el efecto antibiótico de los sobrenadantes de cultivos de DAF-1 (crecido en

caldo nutritivo o en un medio sintético), colectados a diferentes tiempos (hasta 216 h) de

incubación. Las muestras recibieron un tratamiento térmico y luego fueron esterilizados por

filtración y concentrados por liofilización. En estos estudios quedó de manifiesto que la

curva de crecimiento en ambos medios era comparable y mostraba grandes fluctuaciones

en su fase estacionaria. Al respecto Shapiro (1998) reportaron que en los microorganismos

esporulados pueden ocurrir fluctuaciones poblacionales, particularmente en la fase

estacionaria, debido a procesos sucesivos de esporulación-germinación bajo condiciones de

estrés, por alteraciones paulatinas en la composición y el pH del medio de cultivo.

Adicionalmente González-Pastor et al. (2003) reportaron que durante los ciclos de

esporulación-germinación, ocurre un proceso complejo de canibalismo. La escasez

paulatina de nutrientes propicia que parte de la población entre en la fase de esporulación, y

libere enzimas líticas al medio; las cuales propician la lisis de las células que aún no

esporulan. La liberación de nutrientes celulares al medio propicia la germinación de las

células esporuladas. Estos eventos conducen a incrementos y decrementos sucesivos en la

población microbiana. A su vez se producen algunos antibióticos de naturaleza peptídica;

una parte es utilizada como nutrientes para la germinación, o incorporados en las esporas:

por lo tanto la concentración de antibióticos también se ve disminuido por lapsos durante

Discusión

��

los procesos de esporulación-germinación, y por lo tanto puede observarse disminución en

el poder antibiótico.

En esta parte de la presente investigación quedó nuevamente evidenciado, que la

mayoría de los antibióticos producidos por DAF-1 son de naturaleza no ribosomal, pues se

formaron en la fase estacionaria, y además su concentración y/o capacidad antimicrobiana

variaba notablemente a los diferentes tiempos de incubación. Los perfiles de acción

antimicrobiana fueron distintos para los dos medios utilizados, pero no se pudo definir cual

de ellos era más conveniente. En consecuencia se decidió continuar la investigación

cultivando a DAF-1 tanto en caldo nutritivo, como en el medio sintético adicionado de una

pequeña cantidad de extracto de levadura y casaminoácidos. Con respecto a la influencia

del medio de cultivo, se conoce que ésta es una de las variables más importantes en la

producción de antibióticos, aunque no se ha aclarado cual es la causa-.efecto, es decir qué

ingredientes propician la producción de determinado antimicrobiano, de modo que cada

autor desarrolla su propia investigación. De este modo Ahimou et al. (2000) encontraron

que en un medio de cultivo compuesto de peptona, sacarosa y sales, B. subtilis produce

surfactina e iturina A. En un medio con peptona, almidón y sales se producen los

antibióticos del complejo maltacina (Hagelin et al. 2004); y en un medio constituido de

glucosa, ácido glutámico y sales se puede producir bacilomicina L (Volpon et al. 2006).

Muy probablemente además del medio de cultivo, también es importante la cepa de B.

subtilis utilizada.

La parte final de está investigación estuvo dirigida a la caracterización y

purificación de alguna de las sustancias antibióticas producidas por DAF-1, cultivándolo en

caldo nutritivo hasta las 168 h, o en el medio sintético hasta las 174 h. A estos tiempos

relativamente cercanos, los halos de inhibición eran notorios. La caracterización de los

compuestos activos demostró que su capacidad antibiótica no se perdía por calentamiento

en baño de agua en ebullición durante 3 h. Su estabilidad era máxima en un intervalo de pH

entre 6 y 8.5, si provenía de un cultivo en caldo nutritivo o entre 6 y 7.5 cuando se había

producido en el medio sintético, lo que puede indicar, nuevamente, que los antibióticos

producidos en ambos casos eran distintos. Este dato es congruente con el hecho de que los

halos de inhibición observados eran diferentes. Cuando la muestra procedía de un cultivo

Discusión

��

en caldo nutritivo los halos eran pequeños, pero transparente y bien definidos, en tanto que

eran grandes y formados por dos halos concéntricos, si provenían de un cultivo en el medio

sintético. De acuerdo a Mellouli et al. (2003), los compuestos que se acumulan

intracelularmente durante el metabolismo primario dependen de la composición del medio.

A su vez los metabolitos que habrán de formarse en la fase estacionaria (metabolitos

secundarios), dependerán de los precursores acumulados previamente.

Otros experimentos demostraron finalmente que los antibióticos de DAF-1 tienen

carácter hidrofílico y por tanto son solubles en etanol. Su naturaleza es peptídica pues

reaccionan con la ninhidrina, y pueden ser purificados mediante cromatografía en gel

usando soportes como Sephadex G-10-120, con un límite de exclusión de apenas 700

Daltones. Es posible sin embargo, que mediante esta estrategia se purifique sólo un tipo de

antibióticos con un peso molecular de 700 Daltones o aún más pequeño. Sería interesante

en un estudio posterior, hacer un fraccionamiento usando geles con diferentes límites de

exclusión, para separar diferentes tipos de moléculas, e intentar luego su identificación

molecular. Con los antibióticos así purificados podrían hacerse nuevos ensayos para

establecer si alguno de los antibióticos pueden actuar sobre algún microorganismo de gran

interés médico.

Conclusiones

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7.0 CONCLUSIONES

8.1 El perfil enzimático extracelular de B. subtilis DAF-1 es predominantemente proteolítico.

Produce altos niveles de caseinasa, queratinasa, elastasa y colagenasa. De sus

polisacáridasas, la más relevante es la pectinasa y en menor grado la amilasa; produce bajos

niveles de quitinasa y celulasa, y no secreta quitosanasa. Produce niveles medianos de

lipasas, fosfolipasa A y estererasa. Secreta muy poca cantidad de nucleasa.

8.2 El espectro de acción de los antibióticos producidos por B. subtilis DAF-1 es muy amplio,

incluyendo bacterias Gram-positivas y negativas, así como hongos filamentosos y

levaduriformes.

8.3 Los estudios cinéticos del crecimiento y la producción de antibióticos activos contra dos

bacterias y una levadura de interés médico demostraron que: a) las curvas de crecimiento de

B. subtilis DAF-1 son semejantes cuando se les cultiva en caldo nutritivo o en un medio

sintético. b) los antibióticos son principalmente de origen no ribosomal, pues se secretan en

su mayoría durante la fase estacionaria. c) ocurren grandes fluctuaciones en la concentración

celular durante la fase estacionaria y probablemente están asociados a los procesos de

esporulación-germinación. d) la producción de los antibióticos en los dos medios de cultivo

mostraron perfiles de inhibición diferente para cada microorganismo. e) cada pico podría

representar la acción de un antimicrobiano particular.

8.4 Los antibióticos de DAF-1 son termoestables, hidrofílicos y estables a pH 6-7.5. Su

naturaleza probable es polipéptidica.

8.5 La producción, recuperación y purificación de los antibióticos de DAF-1 fue posible

aplicando el siguiente proceso: a) producción a escala de 1 L en caldo nutritivo (168 h) o en

medio sintético (174 h). b) separación de las células por centrifugación y filtración en

membranas con poros de 0.22 µm. c) inactivación de las enzimas presentes por

calentamiento en baño maría a ebullición por 10 min. d) concentración a sequedad por

liofilización o en evaporador rotatorio. e) redisolución a un centésimo de volumen original.

f) desproteinización con etanol frío, clarificación por centrifugación y concentración por

evaporación hasta 1 mL. g) fraccionamiento por cromatografía en Sephadex G-10-120,

Conclusiones

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evaluación de las fracciones eluidas por su reacción con ninhidrina y verificación de su

acción antibiótica contra C. albicans.

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