Presentacin de PowerPoint

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUDESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MDICALABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA

Pruebas Rpidas para la deteccin de TuberculosisCatedrtico : Lic. T.M. Gerson Llallico

Ctedra :Microbiologa Clnica

Presentada por los alumnos: Huanca Vila Geraldine Roco Puente Navarro Lenyn

TAXONOMIA Y CARACATERSITICAS DE GENRALES DE LASMICOBACTERIASLas mico bacterias se describen taxonmicamente al gnero Mycobacterium, nico de la familia de Mycobacteriaceae, perteneciente al orden Actinomicetales. Las micobacterias son consideradas bacilos acido alcohol resistente por presentar resistencia ala decoloracin con alcohol acido ala 3% durante la tincin de Ziehl-NeelsenEsta resistencia se cree que depende de la integridad de la cubierta de ceraMorfolgicamente, son bacilos o cocobacilos ligeramente curvos o rectos, en pocas ocasiones ramificados, miden entre 0.4 por 3.0 um, no esporulan, no tienen flagelos ni capsulasLas micobacterias son microorganismos aerobios estrictos y obtienen la energa de la oxidacin de compuestos sencillos del carbono.Tienen una velocidad de crecimiento mucho ms lento que la mayora de las bacterias. M. tuberculosis tiene un tiempo de generacin de 18 horas, por lo que necesita de 3-4 semanas de incubacin a 37C para formar colonias visibles macroscpicamenteENVOLTURA CELULAR DE LAS MICOBACTERIASse consideran diferentes del esto de las bacterias, debido a la particular estructura y composicin qumica de su pared celular. La envoltura celular de las micobacterias, al igual que la de las bacterias grampositivas y gramnegativas incluye la membrana citoplasmtica que est formada por una bicapa lipdica rodeada por un espacio periplasmatico y cantidades variables de peptidoglicano, siendo este ltimo el responsable de la forma celular.Presenta una capa de peptidoglicano, arabinogalactano (complejo polisacrido covalente unido al peptidoglicano, formado por unidades de arabinosa y galactosa) y cidos miclicos.Los cidos miclicos, uno de los componentes ms distintivos de la pared micobacteriana, son largas cadenas de cidos grasos de 60-90 tomos de carbono, perpendiculares a la superficie de la clula, presentan pocos dobles enlaces, lo cual le confiere la hidrofobicidad a la capa y la convierte en una efectiva barrera contra la penetracin de nutrientes hidrofilicos y antibiticosLa porcin ms externa de la pared microbiana est compuesta por glucsidos fenlicos, glicolipidos (principalmente trehalosa unida a las fracciones de cidos miclicos) y glicopeptidolipidos. Otros componentes lipdicos importantes son los lipoarabinomananos, los cuales se extienden desde la membrana citoplasmtica hasta la superficie celular y cuya estructura parece jugar un papel importante en la patogenicidad de M. tuberculosis.

La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa que se extiende a travs del aire; si no se trata, una persona que presente TB activa infecta alrededor de 10 a 15 indivduos. Mas de 2 billones de personas, cifra equivalente a un tercio de la poblacion mundial, esta infectada con el Mycobacterium tuberculosisLa tuberculosis (TB) es una enfermedad respiratoria que est cobrando cada vez ms importanciaLa OMS est enfocada en reducir el aumento de la TB para el ao 2015. Su estrategia para lograrlo se basa en la DOTS (Direct Observation of Therapy Short Course), terapia directamente observada de corta duracin. El proyecto de la estrategia DOTS asegura el entrenamiento a personal de salud para el adecuado diagnstico y tratamiento apoyados en la microscopa de esputo, disponibilidad de frmacos para el tratamiento, apoyo de las instituciones gubernamentales y la administracin supervisada de frmacos de primera lnea. T U B E R C U L O S I SLos mtodos diagnsticos que se utilizan en la actualidad tiene la desventaja que se tardan un promedio de 30 das para determinar la positividad de la pruebaLas tasas encontradas en el Per de TB-MDR son de 5,3% en pacientes sin episodio previo de TB y de 24% en aquellos previamente tratados, lo cual muestra un escenario en donde es un problemas creciente en nuestro pas; por lo que se hace necesaria la bsqueda de diagnsticos ms rpidos de los patrones de resistencia, que permitan la identificacin rpida del paciente y su inmediato inicio de tratamiento. La estrategia DOTS-Plus, es la recomendada para TB-MDR e incluye esquemas de tratamiento con drogas de segunda lnea; en este caso las pruebas rpidas de susceptibilidad podran permitir determinar el patrn de resistencia, permitindole al mdico brindar un tratamiento adecuado lo ms pronto posible (esta estrategia ya existe en el Per, siendo adems pioneros a nivel mundial).Estos mtodos diagnsticos son directos o indirectos: directo es cuando se usa la muestra de esputo directamente en la prueba, e indirecto es aquella prueba que se necesita una cepa previa (hay que realizar un cultivo de la muestra de esputo, de donde se sacar la respectiva cepa en la que se realizar la prueba de sensibilidad).Existen dos pruebas contempladas en la actual Norma Tcnica Nacional 2006 que pueden ser utilizadas para el diagnostico rpido de TB MDR fuera del INS:

Griess: Basado en el principio de reduccin bioqumica de nitrato por el M tuberculosis. Prueba colorimtrica

MODS: Su nombre se deriva de sus siglas en Ingls que significan Sensibilidad a Drogas por Observacin Microscpica.Caractersticas de la pruebas rpidas: Son pruebas que detectan la resistencia a isoniacida y rifampicina de 1 a 4 semanasSon pruebas directas ya que realizan de muestras de esputo, sin necesidad del aislamiento de la bacteriaLas pruebas rpidas facilitan la eleccin de un esquema adecuado de diagnostico o para descartar la TB en forma precoz

PRUEBAS DE XIDO - REDUCCINEstas pruebas estn basadas en la reduccin de un indicador aadido al medio de cultivo luego de que el M. tuberculosis ha sido expuesto in vitro a diferentes antibiticos . La prueba de Griess fue inicialmente desarrollada en el Instituto Central de Investigacin de Tuberculosis en Mosc, Rusia.logrando detectar la resistencia con el cambio del color del indicador, por este motivo son tambin llamadas pruebas colorimtricaspruebas est la prueba de GriessMTODO DE NITRATO-REDUCTASA (GRIESS) PARA LA DETECCIN RPIDA DE LA SUSCEPTIBILIDAD AISONIACIDA Y RIFAMPICINAFUNDAMENTO DEL MTODOEste mtodo utiliza la determinacin de la actividad de la enzima nitrato reductasa de la bacteria que en cultivos de crecimiento activo de M. tuberculosis reduce el nitrato a nitrito y que se puede evidenciar por la formacin de un color rojo grosella con el reactivo de Griess. Este cambio de color permite la deteccin temprana del crecimiento de M. tuberculosis al comparar los tubos controles sin frmacos con tubos que contienen frmacos antituberculosos.Los organismos sensibles crecern y, de esta manera, desarrollarn un cambio de color en el medio sin frmaco, pero no crecern en el medio con frmacos y, por lo tanto, no producirn un cambio de color. Las cepas resistentes crecern y cambiarn de color en tubos control sin frmacos y en tubos que contienen frmacos.EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOSEquipos- Autoclave- Balanza analtica y pesas certificadas- Potencimetro (medidor de pH)- Cocinilla (Hot-plate) con barras de agitacin magnticas- Coagulador (para la preparacin de medios) (80-85 C)- Refrigeradora (4 C)- Congeladora (-20 C y -70 C)- Bao Mara (37 C)- Centrfuga refrigerada- Termmetros (0 a 100 C)- Jeringa dispensadora (10 mL)- Cabina de bioseguridad de Clase II, Tipo A2- Horno (60 C)- Microscopio binocular (10X* 100X)- Vortex Mixer- Micropipetas automticas (1000 , 100 , 20 )- DesecadoresMateriales- Tubos de vidrio estriles con tapa rosca de 16 x 125mm- Tubos de vidrio con tapa rosca de 20 x 150mm o 20 x 125 mm- Tubos para centrfuga de 50 mL- Pipetas serolgicas de 1 mL- Pipetas serolgicas de 10 mLProbeta graduado de 500 mLProbeta graduado de 1000 mL- Beaker de 2000 mL- Matraz Erlenmeyer de 250 mL- Matraz Erlenmeyer de 500 mL- Matraz Erlenmeyer de 1000 mL- Matraz Erlenmeyer de 2000 mL- Propipetas de jebe de 50 mL- Embudo de vidrio de 15 cm de dimetro- Portatubos de 20 x 150 mm- Portatubos de 16 x 125 mmReactivos- Fosfato de potasio dihidrgeno anhdrido (KH2PO4 )- Sulfato de magnesio (MgSO4 7 H2O)- Citrato de magnesio (C6H6Mg 07)- L-Asparagina- Glicerol PA- Verde de Malaquita- Huevos enteros (libres de antibiticos y que no tengan ms de siete das)- Detergente en polvo (OMS recomienda un jabn alcalino simple)- Nitrato de sodio (NaNO3)- 70% v/v etanol- Metanol puro (QP)

Rifampicina (RIF), qumicamente puro (Sigma Cat. R-3501).- Isoniacida (INH), qumicamente puro (Sigma Cat. I-3377).- cido clorhdrico concentrado (HCl)- Sulfanilamida (C6H8N202S)- N-(1-Naphtyl) ethylenediamine dihydrochloride(C12H14N22HCl) al 0.1% (w/v)- N-Acetil-L-Cistena (C5H9N03S)- Hidrxido de sodio en lentejas (Na0H)- Citrato de sodio HOC(COONa)(CH2COONa)22H2O- Fosfato disdico (Na2HP04)- Fosfato monopotsico (KH2P04)- Fucsina bsica- Azul de metileno- Fenol critalizado PADESARROLLO DEL MTODO GRIESSRECOLECCIN DE LA MUESTRATodas las muestras de esputo debern ser recolectadas en envases de plstico de boca ancha y tapa roscaLas muestras de esputo sern recolectadas en establecimientos de salud bajo la supervisin de trabajadores de salud capacitados, quienes instruirn a los pacientes sobre la forma de obtener la muestra de esputo adecuada, durante la consulta con el mdico (primera muestra ) y la segunda muestra tomada en la maana siguiente despus de la consultaSELECCIN DE LA MUESTRATodas las muestras de esputo recolectadas de pacientes primarios sintomtico respiratorio con riesgo de estar infectados con tuberculosis resistente o mutirresistente (MDR) que tengan como resultado baciloscopia positiva del esputo con una carga bacteriana igual o mayor a una cruz (BK1+ ), pueden ser analizadas mediante el mtodo Griess.La cantidad mnima de muestra requerida es de 3 mL (3-5 mL de preferencia).En caso de que la muestra no se procese el mismo da de la recoleccin, deber conservarse en refrigeracin (4 a 8 C) y ser enviada al laboratorio dentro de las 72 horas (tres das) de haber sido recolectada. Adems, no deber mantenerse sin refrigerar por ms de cuatro horas.ETAPA ANALTICA: PROCEDIMIENTOLa N-Acetil-L-Cistena (NALC) es un agente mucoltico utilizado para una rpida digestin del esputo. El hidrxido de sodio al 4% es el agente descontaminante.El citrato de sodio 2,9% se incluye en la mezcla de digestin para aglutinar los iones de metales pesados que podran estar presentes en la muestra y que podran desactivar la acetil cistena.El acetil cistena pierde su actividad rpidamente en solucin, por lo que debe prepararse diariamente. Despus de la digestin y de la descontaminacin, el buffer fosfato estril (0,067M, pH 6,8) se aade para minimizar la accin del NaOH y reducir la gravedad especfica de las muestras antes de la centrifugacinUsando pipetas de vidrio de punta gruesa coloque de 3 a 5 mL de esputo en un tubo plstico de tapa rosca para centrifuga de 50 mL y aadir un volumen equivalente de la solucin de NALC-NaOH, proporcin 1:1.Cerrar la tapa del tubo y mezclar en un vortex por aproximadamente diez segundos. Evitar la agitacin excesiva para minimizar la oxidacin y la inactivacin de la N-acetil, L-Cisteina.Fundamento de la descontaminacinProceso de digestin y descontaminacionMantener los tubos a temperatura ambiente por aproximadamente quince minutos para la descontaminacin.Aadir 0,067M buffer fosfato estril (pH 6,8) al volumen total de 50 mL para minimizar la accin del NaOH y reducir la gravedad especfica de la muestra antes de centrifugar.Ajustar las tapas de los tubos y mezclar agitando o por inversin.Centrifugar a 3000 x por quince minutos utilizando una centrfuga refrigerada para evitar el sobrecalentamiento durante la centrifugacin de las muestras.Decantar el sobrenadante en un recipiente que contenga el desinfectante fenol 5% .Aadir 1- 2 mL de buffer fosfato para resuspender el sedimento.Realizar un frotis (usando una gota del sedimento resuspendido) siguiendo el protocolo estndar de laboratorio.Despus de obtener los resultados del frotis, solamente las muestras de esputo con una carga bacteriana igual o mayor a una cruz (BK1+) sern apropiadas para la prueba de sensibilidad rpida mediante el mtodo Griess.Para cada esputo, preparar el siguiente juego de cinco tubos de medio L-J3 tubos control de crecimiento1 tubo con RIF1 tubo con INH2 tubos L-J para otras pruebasIncubar a 37 C (leer a los 14, 21 y 28 das, segn sea necesario)Lectura de la pruebaA los 14 das aadir 0,5 mL de reactivo Griess recin preparado en uno de los tubos Control y observar el cambio del color a rojo grosella.Si no hay ningn cambio o hay cambio de color leve en el tubo control, incubar por siete das adicionales.A los 21 das, repetir el paso (1) utilizando otro tubo control. Si en el tubo control no hay cambio de color o el cambio de color es muy leve, seguir incubando los tubos.Cuando la intensidad del color sea evidente en el tubo control, aadir 0,5 mL del reactivo Griess a los tubos con el frmaco.Comparar intensidad de color en el tubo que contienen el frmaco con los del tubo control.Interpretacin de resultadosSe considera que un aislamiento es sensible a un determinado frmaco, si al comparar el tubo control con los tubos que contienen el frmaco, no se observa ningn cambio de color o el cambio es muy leve.Un aislamiento se clasifica como resistente a cierto frmaco si hay un cambio de color en el tubo que contiene el frmaco igual o mayor al del tubo control.La prueba no se considerar vlida si hay muy poco o ningn cambio de color en el tubo de controlSUSCEPTIBILIDAD A DROGAS DE Mycobacterium tuberculosis MEDIANTEOBSERVACIN MICROSCPICA (MODS)El mtodo se basa en la observacin de cordones caractersticos de Mycobacterium tuberculosis cuando crece en medio liquido, los cuales son visualizados tempranamente mediante el uso de un microscopio luz invertida.FUNDAMENTO DEL MTODOEl mtodo, ha sido diseado para la deteccin del crecimiento de MTB y la susceptibilidad a INH y RIF.La simplicidad de la tcnica, la gran sensibilidad, la especificidad y el bajo costo son las mayores ventajas para su uso en pases en vas de desarrolloDesarrollo del mtodo de ensayoSe debe realizar el mantenimiento y la calibracion de los equipos que se van utilizar tales como las micropipetas, la balanza analitica, los equipos controlados por temperatura (autoclave, centrifuga, incubadora), el potenciometro y las cabinas de seguridad biologica clase II tipo A2, de acuerdo con el programa de mantenimiento preventivo establecido para estos instrumentos y equipos. La balanza analitica debe ser calibrada antes de su uso y verificada usando pesas patrones certificadas.Insumos- Caldo Middlebrook 7H9.- Casitona (caseina pancreatica digestiva).- PANTA.- OADC.- ADC.- RIF quimicamente puro (Sigma Cat R-3501).- INH quimicamente puro (Sigma Cat. I-3377), DMSO.- Hidroxido de sodio en lentejas (Na0H).- Citrato de sodio tribasico, dihidratado.- N-acetil L-cisteina (NaLC).- Fosfato de sodio dibasico anhidro (Na2HPO4).- Fosfato de potasio monobasico en cristales (KH2PO4).- Hipoclorito de sodio al 10%.- Glicerol QP.- Agua destilada esteril.- 70% v/v etanol.Equipos, insumos y materiales- Autoclave.- Balanza analitica (200 g 1 g).Potenciometro (medidor de pH).- Calentador (Hot-plate) con barras de agitacion magneticas.- Refrigeradora (4 C).- Congeladora (-20 C o -70 C).- Microscopio de luz invertida (objetivos 4x y 10x).Retirar de la congeladora la solucin stock de los antibiticos (8 mg/mL), dejar descongelar a temperatura ambiente.Preparacin de la solucin de trabajo de los antibiticos en la micro placa de 24 pozosDisponer de dos tubos con 10,8 mL de caldo 7H9, anadir a estos tubos 1,2 mL del suplemento OADC. (volumen total 12 mL)Dispensar 1 mL del caldo 7H9+OADC a los pozos C y D de la columna 1 de la microplaca.Empleando una micropipeta, retirar del pozo C 5 L de medio y anadir 5 L de la solucion stock de INH. Mezclar bien (0,04 mg/mL = 40 g/mL INH dilucion 1)Empleando una micropipeta, retirar del pozo D correspondiente a rifampicina 12,5 L de medio y luego anadir 12,5 L de la solucion stock de RIF; mezclar bien (0,1 mg/mL =100 g/mL RIF dilucion 1)Pre anlisisDispensar 2 mL de caldo 7H9+OADC a los 4 pozos A, B, C, y D de la columna 2 de la microplaca.Empleando una micropipeta, retirar 200 L del pozo C de la columna 2 y anadir 200 L de la dilucion 1 de INH al mismo pozo C de la microplaca; mezclar bien (4 g/mL INH solucion de trabajo).Empleando una micropipeta, retirar 200 L del pozo D de la columna 2 y anadir 200 L de la dilucion 1 de RIF al mismo pozo D de la microplaca; mezclar bien (10 g/mL RIF solucion de trabajo).Empleando una micropipeta multicanal cargar 100 L de la solucin de trabajo de los pozos A, B, C, y D de la columna 2 y dispensar a los pozos A, B, C, y D de la columna 1 de una nueva microplaca destinada para las muestras.Repetir el mismo procedimiento hasta llenar todos los pozos de la microplaca. (incluyendo el control negativo de la columna 3).Preparacin de la solucin de trabajo.Separar en tubos de polipropileno de 15 o 50 mL, el volumen requerido de la solucion buffer fosfato (pH 6,8, para enrasar de acuerdo a la capacidad del tubo utilizado en proceso de cada muestra de esputo.Separar en tubos de polipropileno de 15 o 50 mL la solucion stock de NaOH+citrato de sodio, para la descontaminacion de las muestras de esputo)Cada 2 mL de muestra de esputo requiere 2 mL de solucion NaOHcitrato de sodio.Pesar la cantidad necesaria de NaLC que se va a anadir a la solucin NaOH - citrato de sodio .Dispensar 4,5 mL de caldo 7H9 a los tubos 16 x 100 mm para las muestras de esputo y anadir 0,5 mL de OADC a cada tubo. Reconstituir PANTA y anadir 0,1mL a los tubos con 4,5 mL caldo 7H9+OADC para muestras y controles negativosSeparar dos tubos con 5 mL de 7H9+OADC para los controles positivos (estos no requieren PANTA).Muestras de esputo. La cantidad minima de muestra requerida es 2 mL, con tiempo de recoleccion no mayor a 72 h, de pacientes con diagnostico de TB pulmonar con baciloscopia positiva o negativa que aun no hayan iniciado tratamiento antituberculosis, pacientes nunca tratados, recaidas o abandonos recuperados.En caso de que la muestra no se procese el mismo dia de la recoleccion, conservar la muestra en refrigeracion de 4 a 8 C. Enviar la muestra al laboratorio dentro de las 72 h (3 dias) de haber sido recolectada.Todas las muestras de esputo deben ser recolectadas en recipientes plasticos de boca ancha y tapa rosca.Las muestras de esputo son recolectadas en establecimientos de salud bajo la supervision de trabajadores de salud capacitados, quienes instruyen a los pacientes sobre la forma de obtener lamuestra de esputo adecuada durante la consulta con el medico (primera muestra) y la segunda muestra tomada en la maana siguiente despues de la consulta. Las muestras deben ser transportadas siguiendo el protocolo establecido para la red delaboratorios.Procedimiento analticoProcedimiento de descontaminacion. Colocar 2 mL de esputo en un tubo de polipropileno de centrifuga de 15 mL o 50 mL.Anadir 2 mL de la solucion NaOH-NaLC a una proporcion (1:1).Asegurar bien la tapa y mezclar en el agitador por 20 s; mover el tubo por inversion para asegurar que la solucion NaOH-NALC este en contacto con todo el interior del tubo y con la tapa.Dejar reposar dentro de CSB por un minimo de 15 min. Puede prologarse por unos minutos mas si la muestra es demasiado mucoide.Evitar el tiempo de sobreexposicion, este no debe exceder los 20 min.Adicionar buffer fosfato (pH 6,8), para neutralizar la reaccion alcalina y terminar con el proceso de descontaminacion, mezclar bien invirtiendo el tubo por cuatro veces.Centrifugar a 3000 g por 15 min.Decantar cuidadosamente el sobrenadante, en un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 3% u otro desinfectante apropiado,mantener el sedimento de la muestra.Resuspender el sedimento de la muestra con 2 mL del medio 7H9-OADC-PANTA (5,1 mL).Homogenizar bien la suspension evitando formar burbujas de aire.De esta suspension de la muestra extraer 1 mL y hacer la siembra en dos tubos con medio L-J a razon de 0,2 mL por tubo y el resto en un criovial para conservarlo a 2-8 C, como muestra de contingencia.Anadir el otro mililitro de la suspension de la muestra al resto del medio 7H9-OADC-PANTA que esta en el tubo; mezclar bien. Esta es la suspension final de la muestra lista para dispensarse en la placa.Los tubos que contienen PANTA (7H9-OADC-PANTA) se emplean para las muestras y para los controles negativos.Se emplea 7H9-OADC sin PANTA para los controles positivos y para la preparacin de la solucion de INH y RIF.Preparacin final de la placa de MODSDispensar 900 L de la suspension final de la muestra a cada uno de los cuatro pozos de la placa de 24 pozos. Excepto los pozos de la columna 3.Dispensar 900 L del medio 7H9-OADC-PANTA sin muestra en los 4 pozos de la columna 3 de cada placa de MODS (controles internos negativos).Cerrar la placa, colocar en una bolsa de polietileno tipo ziplock y cerrar (la bolsa no se debe abrir de ahora en adelante).Incubar a 37 C entre 5 a 21 dias.Preparacin de las cepas control positivo - Control de Calidad InternoCada vez que se procesan muestras, deben incluir dos cepas: control positivo, sensible y resistente INH y RIF.Mezclar 5 L de cada suspension de cepas (escala MacFarland N. 1) con 5 mL del medio 7H9+OADCEmpleando una pipeta multicanal, adicionar a los cuatro pozos, 100 L de caldo 7H9+OADC y la solucion de trabajo de antibioticos, igual que para las muestras.Alicuotar 900 L de cada suspension de cepas en los cuatro pozos de una columna en la placa separada para los controles positivos.Cerrar la placa y colocarla en la bolsa tipo ziplock.Incubar a 37 C junto con las otras placas procesadas el mismo dia.Lectura de las placasUn resultado positivo es definido como el crecimiento de dos o mas unidades formadoras de colonia (>2 ufc) en cada uno de los pozos sin droga.Las placas son retiradas de la incubadora para su observacin en el microscopio de luz invertida con las bolsas selladas, las cuales no deben abrirse.La lectura de las placas se inicia por los pocillos sin antibiticos en el dia 5 de incubacion.En sus inicios (entre los dias 5 a 9) el crecimiento de MTB se observa como pequenas curvas, comas o espirales.La formacion de las colonias, por lo general, progresa a la formacin de cordones y luego a un crecimiento irregular mas enmaranado.Para las lecturas iniciales, examinar los pozos con el objetivo 10X (aumento total de 100X) en el microscopio de luz invertida, buscando el temprano crecimiento de las microcolonias. Para subsecuentes lecturas se utiliza el objetivo de 4X (40X total de aumento) para examinar todo el contenido de cada pocillo.No es muy comn la contaminacion con bacterias u hongos, pero usualmente aparece al dia 5 un aspecto turbio y con crecimiento abundante. Si se produce la contaminacion se deben volver a descontaminar y reprocesar las alicuotas de la muestra de contingencia o solicitar una nueva muestra al paciente.Los medios de cultivo no deben tener un aspecto turbio con el crecimiento de MTB.Los desechos acompaantes en la muestra pueden dificultar la deteccion temprana de micobacterias, pero con el tiempo, las colonias mas maduras pueden ser detectadas, sobre todo en laperiferia de los pozos.El crecimiento en un solo pozo (con ausencia de contaminacin), o menos de 2 UFC en cada pozo, debe considerarse como un resultado indeterminado y se debe solicitar inmediatamente la repeticion del proceso de la muestra, y la bsqueda de evidencias de contaminacin cruzada.El intervalo entre las lecturas puede ser flexible para adaptarse al trabajo y calendario del laboratorio. Lecturas mas frecuentes conducen a obtener resultados mas rpidos.Interpretacin de resultados

Determinacin de la resistencia a medicamentos antituberculosisLos pozos con antibioticos solo deben examinarse cuando los pozos sin droga son positivos ( 2 UFC).La resistencia es definida como el crecimiento >2 UFC en los pozos con drogas (INH y RIF) el mismo dia en que ambos pozos sin droga son positivos.Si hubiese crecimiento en un pozo que contiene droga, la muestra es resistente a esa droga (a la concentracion especifica); si no hay crecimiento significa que la muestra es sensible.Si existe crecimiento en ambos pozos conteniendo INH y RIF, la muestra es considerada MDR.Los pozos con droga NO deben volver a examinarse despus del dia que los pozos sin droga hayan sido identificados como positivos. Despues de una incubacion prolongada, el progreso en el crecimiento en los pozos con droga no es indicativo de resistencia.El crecimiento de MTB resistente en los pozos que contienen drogas, suele ser facilmente identificable cuando los pozos sin droga son positivos.En pocas ocasiones es detectado una sola UFC en los pozos que contienen droga, si esto sucediera, la interpretacion es indeterminada.

Determinacion del crecimiento de micobacterias mediante cultivoPositivoNegativoIndeterminadoContaminadoDeterminacion de la resistencia a medicamentos antituberculosisResistenteSensibleMDRContaminadoIndeterminadoInforme de resultadosPRUEBAS DE AMPLIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS (NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TESTS; NAAT)Son mtodos para diagnstico de M. tuberculosis, siendo una de las tcnicas ms usadas para la amplificacin la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR); este grupo de pruebas demoran 3-6 horas en procesar una muestraUno de estos mtodos NAAT que permite ver patrn de sensibilidad es el llamado INNO-LiPA Rif TB(Innogenetics), el cual consiste en una amplificacin mediante la reamplificacin de una regin de 70 pbdel gen rpoB que codifica la subunidad beta de la ARN polimerasa presente en todos los miembros del complejo M. tuberculosis, seguida de una hibridacin reversa. La biotina que acta de marcador se incorpora durante la fase de amplificacin, as el producto amplificado biotinilado es posteriormente desnaturalizado e hibridado con 10 sondas oligonucletidas inmovilizadas en una tira reactiva a modo de lneas paralelas. El hbrido se detecta mediante una reaccin colorimtrica que est automatizada (AUTOLiPA) completndose el ensayo en aproximadamente 12 horas, sirviendo para detectar el M. tuberculosis y al mismo tiempo la resistencia a la rifampicina.En un metanlisis se encontr que INNO-LiPA tuvo una sensibilidad mayor al 95% y una especificidad del 100% en las pruebas realizadas en cepas aisladas; y en muestras directas tuvo una especificidad del 100% y una sensibilidad en el rango del 80% al 100%21.Como la prueba de INNO-LiPA, esta es una prueba de PCR que detecta M. tuberculosis y mutaciones especficas del gen rpoB, adems de mutaciones especificas en el gen katG (que indica resistencia de alto nivel para isoniacida) y en el gen inhA (que indica resistencia de bajo nivel para isoniazida).

GRACIAS POR SU ATENCION