Puesta al día en D. Prenatal. Aplicación Clínica de nuevas ... · MLPA (Múltiple...
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Dr. José A. Sainz U.M.Fetal. H.U.Valme
U.M.Fetal. Diagnóstico Prenatal y Ginecología. H. Viamed
Puesta al día en D. Prenatal.
Aplicación Clínica de nuevas
técnicas diagnosticas en Genética
Donde estamos en Diagnóstico Prenatal ?
A que nos ayudan las nuevas técnicas de Genética ?
OBJETIVOS
“Toda anomalía del desarrollo morfológico, estructural, funcional o
molecular, presente al nacer (aunque pueda manifestarse más
tarde), externa o interna, familiar o esporádica, hereditaria o no,
única o múltiple”
DEFECTO CONGENITO (OMS)
2-4% 7%
Primera causa de mortalidad-morbilidad infantil: 20% en 1º año
DIAGNÓSTICO PRENATAL
ICBDSR EUROCAT ECEMC
Creado 1.979 1,7 mill. nacimientos anuales 43 miembros (23 países) 358.396 casos de anomalías congénitas desde 1.980 a 2.010 95 defectos ---- +/- cromosomopatía
cardíacas 71,33/10.000 gest. cromosomopatías 31,96/10.000 gest. (18,77/10.000 SD)
EUROCAT
Cualquier actuación encaminada a la identificación
de los DC se denomina Diagnóstico Prenatal
Tipo de D C Incidencia por nacimiento en %
Incidencia por D C %
Anomalías Cromosómicas 0.6 12
Enfermedades hereditarias
monogénicas
1.4 28
Malformaciones 3 60
Total 5 100
DIAGNÓSTICO PRENATAL
ECEMC 2004
Cribado de Malformaciones Eco morfológica
Cribado de Cromosomopatías
80-85 (datos base) 86-2001 2002
2,22% 1,55% 1,1%
MALFORMACIÓN
MAYOR
nº Tasa de Diagn antes
Diagnóstico de las 24 s
Radius (1987-91) 15151 11-35% 17%
Eurofetus (1990-93) 170800 56.2% 55%
Mayores es del 66%
Menores es del 40.7%
Eurofetus 98
Malf. SNC 88.5%
Sist. Génito-urinario 88.1%
Sist. Respiratorio 66.7%
Sist. Digestivo 55.5%
Sist. Esquelético 38.1%
Sist. Cardiovascular 28.9%
Alts. Faciales 18.7%
D. PRENATAL DE MALFORMACIONES ESTRUCTURALES
Chitty et al., 1991
Levi et al., 1991
Shirley et al., 1992
Luck, 1992
Crane et al., 1994
Carrera et al., 1995
Levi et al., 1995
Skupski et al., 1996
Magriples et al., 1998
Lee et al., 1998
Van Dorsten et al., 1998
Boyd et al., 1998
Instituto Dexeus, 2002
1988-89
1984-89
1989-90
1988-91
1987-91
1970-91
1990-92
1990-94
1997-98
1990-94
1993-96
1991-96
1970-02
8745
15654
6512
8844
7575
33192
9601
860
911
3004
1611
33376
62592
18-20
16-20
19
19
15-22
18-22
16-20
18-20
16-20
18-20
15-22
18-22
18-22
1.5
2.3
1.4
1.9
2.30
3.03
2.45
1.16
3.07
0.76
1.30
2.17
2.9
71.5
21
57.3
85.3
16.6
78.33
25.6
15.0
71.4
13.5
47.6
41.1
87.2
Autores Periodo n Prevalencia (%)
Sensibilidad (%)
Edad gestacional
(sem.)
D. PRENATAL DE MALFORMACIONES ESTRUCTURALES
- Aportación de los marcadores ecográficos de segundo nivel al Cribado Combinado de Primer Trimestre-
H.U.
VALME RADIUS
EUROFE
TUS Levi et al.
Chitty
et al.
Salvador
et al.
Nº fetos 12746 7685 200000 16353 8432 99753
Tasa de
diagnóstico
prenatal
80,75% 35% 61,4% 40% 71% 56%
Tasa de
diagnóstico
antes de la
semana 24
77,12% 17% 44% 21% 71% 36%
Diagnóstico ecográfico de 95% de Malf Mayores
Diagnóstico ecográfico de 68,15% de Malf Menores
Prevalencia al nacimiento de Malf Mayores : 0,34%
SINDROME DE DOWN (10.000 nacimiento)
1980-1985 1986-2004 2002 2005
Andalucía 15,37 13,61 15,25 5,30
Media Nacional 14,78 10,95 8,20 7,40
?
Modelos de Cribado ? • Cribado por Edad (37 años) • Cribado Bioquímico del 2 T • Cribado con TN • Cribado con Test Combinado
Control del Cribado ?
METODOLOGÍA CRIBADO SENSIBILIDAD
(TFP 5%)
CRIBADO POR EDAD (70’S)
Amniocentesis >35 a 30%
CRIBADO BIOQUÍMICO 2ºT (DATN)
Marcadores bioquímicos en suero materno
DOBLE TEST AFP+hCG 55-60%
TRIPLE TEST AFP+hCG+uE3 60-65%
CUADRUPLE TEST AFP+hCG+uE3+inhA 70-75%
SONOGRAMA GENÉTICO (90’S)
AE+MB 65-75%*
CRIBADO BIOQUÍMICO 1erT βhCG+PAPP-A 65%
TRASLUCENCIA NUCAL (TN) Medición TN 75%
TEST COMBINADO βhCG+PAPP-A +TN 80%
Gold Estándar: Precoz, Sensible (SURUSS, FASTER)
SINDROME DE DOWN (10.000 nacimiento)
1980-1985 1986-2004 2002 2005
Andalucía 15,37 13,61 15,25 5,30
Media Nacional 14,78 10,95 8,20 7,40
Análisis Cromosómico: “Gold Standard” en prenatal
Cariotipo Bandas-G
Tamaño 5MB
Error del 0.01-0.02%
Incorporación de genética molecular : Detección Rápida
FISH
Sonda gen específica
Sonda centromérica
Sonda telomérica
Pintado cromosómico
Di George
Incorporación de genética molecular : Detección Rápida
QF-PCR
Fácil, Rápido pero Caro equipos y Personal Entrenado
Incorporación de genética molecular : Detección Rápida
MLPA (Múltiple Ligadura-Dependiente de la sonda de Ampliación)
Unión de Sonda a gen y ampliación por PCR
Trastorno cromosómico, Delecciones, Duplicaciones,
Amplificaciones, Reordenamiento
Arrays
Arrays: Técnica molecular que permite diagnosticar cambios
en la cantidad de ADN
de expresión, de metilación, de dosis (a-CGH)
Prenatal: Array-CGH “Hibridación genómica comparativa”
Array-CGH Oligonucleótidos // BAC
SNP-array “Polimorfismos de nucleótido único”
Combinación
Oligonucleotidos
BACs-on-Beads
• Medio líquido
• ADN procedente de bacterias
o BAC fijado en microesferas
• En < 24 horas
• Precio más bajo que arrays
Principales aneuploidias
Chr 21 (5 sondas)
Chr 13 (5 sondas)
Chr 18 (5 sondas)
Chr X (5 sondas)
Chr Y (5 sondas)
Síndromes de microdeleción
DiGeorge 1 (4 sondas)
DiGeorge 2 (4 sondas)
Williams-Beuren (5 sondas)
Prader-Willi /Angelman (7 sondas)
Smith-Magenis (4 sondas)
Wolf-Hirschhorn (5 sondas)
Cri du Chat (8 sondas)
Langer-Giedion (7 sondas)
Miller-Dieker (6 sondas)
SNP-Array “Polimorfismos de nucleótido único”
90% de variaciones del genoma
1 cada 1.300 Pb
Variante de A-oligonucleótidos donde se incluyen SNP
Identifica deleciones-duplicaciones y además disomías
uniparenterales y perdida de heterocigosidad
Arrays según tamaño de la sonda:
Dirigidos o “Targeted”
De Genoma Completo “Whole genome array”
Array ¿ Que detecta?
Todas las anomalías cromosómicas diagnosticadas por
cariotipo convencional donde sobran o faltan cromosomas
o segmentos de este
En teoría una resolución x 100 al caritipo
Pero esas deleciones o duplicaciones (CNV “variación en
el número de copias”) aparecen el 12% del ADN de un
individuo sano
Arrays. Recomendaciones de Sociedades Científicas
Post natal A C Medical Genetics 2010:
Discapacidad intelectual inexplicable
Autismo
AC múltiples no explicable
Array ¿ Porqué?
En teoría una resolución x 100 al caritipo
De 3-10 millones PB a 50.000 PB
Cualquier muestra de DP y tejido de feto + aunque superior
la cantidad de ADN y calidad
Resultado en 48-72 h y se automatiza
Array Limitaciones
No detecta reordenamientos estructurales equilibrados
(aunque los reordenamientos de novo es de 0.05%)
Poca capacidad para diagnosticar Poliploidias
(SNP-arrays si). Se detectan por ecografía.
Array Limitaciones
Mosaicismo solo diagnostica >20-30% (SNP-arrays <10%)
Caros
CNV de significado incierto en el 1-3%
Tipos de Array
Array-CGH más sensible (0.1-10MB)
Array-SNP 1.5KB pero menos CNV,
Ploidias
Disomías parenterales
Mosaicismos (?)
Arrays versus cariotipo convencional en prenatal
Alt Totales 7.5-9% Δ 2.5-3.5%
Δ 5.2-12% ME
CNV 1-3%
Emanuel 2007, Ahn 2010 , Wapner 2012
Arrays versus cariotipo convencional Muerte Perinatal
arrays Bandas-G
Total 8.3% 5.8% Δ 42%
Anteparto 8.8% 6.5% Δ 35%
Con ME 30% 19% Δ 54%
Éxito de Resultados 87% versus 70%
Reddy 2012
Arrays con alteración ecográfica y cariotipo normal
Shaffer 2012 (2858 casos)
1 ME 5.6%
2 o + 9.5%
CIR aislado 2.6%
Holoprosencefalia 10.6%
Fosa Posterior 14.6%
A Esquelética 10.7%
CIV 10.6%
Hvi 16.2%
Llep/PH 10.3%
Arrays. Recomendaciones de Sociedades Científicas
Post natal ACMedicalGenetics 2010:
Discapacidad intelectual inexplicable
Autismo
AC múltiples no explicable
Prenatal ACOG 2009 indica Bandas-G primera línea
pero abre la posibilidad en:
ME y cariotipo normal
Muerte fetal con AC e incapacidad Banda-G
TN aumentada
SNC Cardiopatia
MEsq
CIR Marcadores Ecograficas
Unidad de Medicina Fetal
- Aportación de los marcadores ecográficos de segundo nivel al Cribado Combinado de Primer Trimestre-
Diagnóstico ecográfico de 95% de Malf Mayores
Diagnóstico ecográfico de 68,15% de Malf Menores
Ya no nos vale
Tipo de D C Incidencia por
nacimiento en %
Incidencia por D C %
Anomalías Cromosómicas 0.6 12
Enfermedades hereditarias monogénicas 1.4 28
Malformaciones 3 60
Total 5 100
DNA fetal en sangre materna
Método de Cribado
No método de diagnóstico prenatal no invasivo
ADN materno de apoptosis de eritrocitos
ADN fetal de apoptosis Trofoblasto
Supone 10-20% del ADN en sangre materna
Representado todo el genoma
150PB
Dura poco tiempo (min)
Desaparece rápido tras nacimiento
ADN materno versus fetal: Como se distingue ?
• Tamaño
• Inmunoprecipitado con Hipo-Hipermetilación
• Enlace del nucleosoma
• Muestreo por formaldehido
No utilizado
Es la secuenciación masiva
Secuenciación masiva en paralelo
• Diferencia de ADN es del 10%
• Resultado en z-score
• C 21 es el 1.5%, secuenciar
millones de fragmentos
Secuenciación masiva dirigida en paralelo
Solo amplifica las secuencias
seleccionadas
Menor secuenciación y costo
Resultado en LR con edad…
Análisis dirigido de SNPs
• Solo amplia las regiones de los cromosomas que interesan
• 19488 SNPs de 21,18,13,X,Y
• Menos secuenciación y costo
• Resultado en LR con edad…
Otros:
• Selección de ADN fetal por la hipermetilación
• PCR digital
• Basados ARN (que solo lo expresa el trofoblasto)
Test Prenatal no invasivo o evaluación cfDNA
No método de diagnóstico prenatal no invasivo Benn 2013
SNP studies
242 gestaciones con 32 cromosomopatías
Resultados en el 95%
S 100% E 100% T 21, 13, 18, X, Y
Secuenciación masiva. Sin resultados
Fallo de resultado del 6.1% (0.8-9.9%)
Escaso cfDNA fetal 2% (nueva muestra 32%)
Tiempo 10-14 dias y re-respuesta 10-15 dias
Gestación Múltiple ?
En teoria SNPs mejores resultado
Secuenciación en G Múltiples con S 99% (Canick 2012, Lau 2013)
Evanescente (?)
Futuro de cfDNA
• Anomalias de cromosomas sexuales (80%)
(mosaicos, Y poca cantidad, X se pierde con la edad)
• Mosaicismo (50%, confinado a la placenta?)
• Translocaciones (Tecnologia SNP)
• Triploidias (Basada en z-score no, SNP)
• Genotipo completo
(Fan, Kitzman 2013)
Estamos preparados para la metodología
contingente
Tiene sentido aquí cfDNA
Todo coordinado desde UMFetal
El primer paso es el Test Combinado
S > 95% F+ < 0.5%
Conclusiones cfDNA
En caso de ME y cariotipo normal Δ 5.2-12%
En caso de Muerte fetal Δ 8.5%
CNV 1-3%
Debemos incorporarlo en las UMFetal
Conclusiones Arrays