Q-PCR: Ventajas, desventajas y limitaciones para validar ...

Daniel Mauricio Bilbao

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Q-PCR: Ventajas, desventajas y limitaciones para validar CNVs del locus 4q22.1 en pacientes con depresión Resumen El Trastorno Depresivo Mayor (MDD) es uno de los desordenes mentales más comunes del mundo moderno caracterizado por una apatía generalizada y baja autoestima. El MDD tiene un componente genético que ha generado dificultades para entenderlo debido a su alta heredabilidad. El grupo de trabajo CIGEn en un proyecto previo encontró una microdeleción que afecta el gen SPARCL1 en pacientes con MDD. Este gen es necesario para el desarrollo normal de sinapsis durante el crecimiento, lo que lo convierte en un posible factor de riesgo para el MDD. Se usaron dos técnicas de cuantificación para validar si esta variación en el número de copia podría ser un factor de riesgo para el desarrollo del Trastorno Depresivo Mayor, Q-PCR con SYBR Green y con sondas UPL. El uso de estas técnicas sirvió para validar la presencia de un CNV que involucra el gen SPARCL1, a la vez generando un mejor entendimiento de los usos y limitaciones de la Q-PCR con SYBR Green, y de la importancia de la eficiencia de la reacción. Introducción Depresión como enfermedad genética compleja y heredable Las depresiones unipolares se consideran los trastornos mentales más comunes del mundo moderno. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha identificado a una de ellas, el trastorno depresivo mayor (MDD por sus siglas en inglés) como una de las enfermedades que tendrá más incidencia en los humanos para el año 2020, aumentando el estrés y costos de los diferentes servicios de salubridad en el mundo (OMS, 2011). La depresión resulta cuando es activada una vulnerabilidad preexistente debido a circunstancias estresantes de la vida diaria. De acuerdo con Haeffel et al (2008), esta vulnerabilidad preexistente puede ser genética, implicando una interacción entre lo innato y lo adquirido y como situaciones estresantes pueden tener un impacto mucho mayor en personas genéticamente predispuestas al MDD. Al investigar las posibles causas genéticas de la depresión, se encontró que el MDD se caracteriza por presentar una heredabilidad de aproximadamente un 33% (Kendler et al 2001). La depresión ocurre debido a un desbalance en varios neurotransmisores como la serotonina (Risch et al, 2009), por lo que en el estudio genético de la depresión es ventajoso tomar como genes de interés aquellos que por literatura estén relacionados a la síntesis y transporte de neurotransmisores, al igual que en genes que tengan un papel en la formación y regulación de las sinapsis durante el desarrollo fetal y de la primera infancia, pues la deficiencia sináptica es un factor de riesgo en MDD (Krishman, 2008).


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Sin embargo, a pesar de que se sabe tiene un componente genético, no se han descubierto asociaciones genéticas de significancia global. Esto se debe a que a pesar de varios estudios de genoma completo (GWAS) y estudios con genes candidatos los resultados no han sido concluyentes (Wray et al, 2012). Se cree que esto es debido a que existen muchos genes actuando juntos y cada uno de estos jugando un papel muy pequeño dentro de la condición, lo que dificulta el hallazgo de estos genes con baja penetrancia. En estudios más recientes se han encontrado asociaciones entre MDD y factores de riesgo para el desarrollo de dolor crónico (McIntosh et al, 2016) no solo en pacientes, sino que también en su descendencia. Estos estudios de asociación de todo el genoma (GWAS por sus siglas en inglés), a pesar de ser relativamente nuevos, soportan el argumento de la depresión como una enfermedad con un componente genético heredable. Genética de la depresión De acuerdo con Lohoff et al (2010), un gran obstáculo en el estudio de la genética de la depresión es la heterogeneidad de los genes que pueden ser factores de riesgo en el desarrollo de trastornos depresivos. Como estos genes cada uno contribuyen solo una pequeña fracción del riesgo genético total, la interacción entre varios genes es necesaria para el desarrollo del MDD. Aun así, los genes que aportan susceptibilidad al MDD también están ligados a otras enfermedades mentales, comúnmente la esquizofrenia y el autismo. Los genes candidatos principales en los estudios de la genética de la depresión son los que codifican para receptores de serotonina, el factor neurótico derivado del cerebro (BDNF), el transportador de serotonina (5HTT) y el triptófano hidroxilasa (TPH) entre otros. De estos genes candidatos, solo el BDNF no se encuentra directamente relacionado con la producción y transporte de serotonina, aunque todos se encuentran relacionados de alguna forma con este neurotransmisor cuya concentración es inversamente proporcional al nivel de estrés que padece una persona. Bajos niveles de serotonina en el cerebro implican una baja tolerancia a eventos estresores que pueden causar MDD. El BDNF, por otro lado, es un factor de crecimiento neuronal secretado por células endoteliales en el cerebro, que fomenta el desarrollo de la materia cerebral como la sinaptogenesis y la dendritogenesis. Sin embargo, existen otras proteínas y células encargadas de estos procesos que han tenido relativamente poca atención en genética de la depresión (Lohoff et al, 2010). Una investigación usando datos más recientes en proteínas y células con un papel en el desarrollo de sistema nervioso central y las conexiones neuronales podría ser de gran ayuda para entender mejor los mecanismos de herencia de genes que podrían ser factores de riesgo en transtornos depresivos unipolares como el MDD.


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Astrocitos y SPARCL1 La formación del número y tipo correcto de conexiones sinápticas es crucial para el desarrollo y funcionamiento del Sistema nervioso. En la ultima década, los astrocitos emergieron como reguladores importantes de la conectividad sináptica. Los astrocitos segregan trombospondinas (TMP), que regulan la formación de conexiones sinápticas en el Sistema Nervioso Central. SPARC y hevin, también conocida como SPARCL-1 son proteínas segregadas por los astrocitos, aunque no se clasifican como trombospondinas (Kucukdereli, 2011). Aunque SPARCL1 es un gen que inicialmente fue asociado al control del cáncer pulmonar (Isler et al, 2001) varios estudios recientes han encontrado relaciones entre su producto, hevin, y los astrocitos, células cerebrales que se encargan de refinar las conexiones del córtex a nivel de las espinas dendríticas (Risher et al, 2014). A pesar de que la proteína hevin se encuentra en todo el cerebro, esta proteína es solo secretada por los astrocitos, y en experimentos en ratones vivos e in vitro, se encontró una deficiencia en el número de sinapsis que se dan a nivel córtex y del tálamo al hacer un Knock-Out del gen SPARCL1 en los astrocitos (Kucukdereli, 2011). Los astrocitos regulan la conectividad sináptica en el sistema nervioso central a través de señales secretadas. Hevin induce la formación de sinapsis entre cultivos de ganglios retinales de rata. SPARC no es sinaptogénica, pero antagoniza la función sinaptogénica de hevin. Esto se debe, principalmente, a que hevin es una proteína que modula la adhesión extracelular durante la infancia temprana, lo que le da más estabilidad a las sinapsis, que son conexiones entre neuronas. Esta relación ha sido estudiada principalmente en casos de esquizofrenia y autismo (Risher et al, 2014; Wang et al, 2013) Antecedentes Este proyecto se encuentra enmarcado bajo el proyecto interfacultades 2015 “Microarreglos cromosómicos como posibles responsables del trastorno depresivo mayor en una muestra clínica de Bogotá” y el proyecto de Colciencias “Estrés percibido y marcadores genéticos y epigenéticos en el trastorno depresivo mayor”. En estudios anteriores del grupo CIGEn, realizados con pacientes con depresión, se encontraron zonas del genoma variaciones en el número de copia (CNV) al compararlos con controles sanos, por lo que pueden ser factores de riesgo para el desarrollo del MDD. Los CNV son segmentos de ADN que difieren en longitud al compararlos con un genoma de referencia, que poseen un mayor o menor número de copias de secuencias de ADN (Redon et al, 2006). La mayoría de los CNV son heredables y estables, aunque varias mutaciones de novo pueden ocurrir durante el desarrollo. Estos pueden estar asociados


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a la estabilidad del genoma o a la cantidad de producto necesaria para el funcionamiento sano y normal del organismo (Pawel & Lupski, 2010). Los CNV son muy variados, y pueden servir como marcadores genéticos debido a que tienden a heredarse y mantenerse por generaciones, lo que los hace fáciles de rastrear e identificar (de Vicente & Fulton, 2003). En el estudio piloto realizado por CIGEn se identificaron varias microdeleciones por medio de microarreglos que podrían estar asociadas con MDD (Nuñez et al, 2015). Una de estas zonas es una microdeleción de 46kb en la región 4q22.1, que incluye los genes NUDT9 y SPARCL1, presente en varios pacientes analizados. De los genes afectados en el locus 4q22.1, SPARCL1 está asociado a transporte del ion calcio y a movimiento de las neuronas durante el desarrollo (Hambrock et al, 2003). Este gen ha sido asociado anteriormente a enfermedades como la esquizofrenia y el autismo (Medway et al. 2011). Esta deleción se considera como posible factor de riesgo para el desarrollo del MDD ya que en la prueba piloto, 12/19 pacientes con depresión presentaron esta microdeleción de 46kb en este locus, mientras que no se presentó en ningún control (Imagen 1).

Imagen 1. Deleción encontrada en 4q22.1, de especial interés por abarcar una sección de SPARCL1 y no estar presente en ninguno de los controles. Aunque la cantidad de datos de la prueba piloto es muy pequeña para determinar su significancia, los resultados sugieren que los CNV en este locus pueden estar asociados al desarrollo del MDD. Por tal razón, este estudio pretende validar los datos obtenidos durante el estudio piloto realizado por CiGEn por medio de Q-PCR. La Q-PCR es una técnica molecular de detección cuantitativa que se monitorea en tiempo real por medio de constantes escaneos de florescencia en la muestra de PCR. Comparado con la PCR tradicional, la Q-PCR permite determinar la concentración relativa o absoluta de ADN amplificado en la muestra (Sigma-Aldrich, 2008), y puede usar tanto ADN como ARN como templado. Casas comerciales anuncian que la Q-PCR es una técnica muy sensible, capaz incluso de notar variaciones en el número de copia de uno. Es decir, que con Q-PCR podríamos notar si esta microdeleción, que solo tiene una copia menos que un genoma de referencia, se encuentra en los pacientes con MDD como lo sugieren los análisis por aCGH realizados previamente en la prueba piloto. Métodos.


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Para este proyecto se utilizaron muestras de ADN ya recolectadas por estudios anteriores en el proyecto interfacultades y que cuentan con consentimiento informado de todos los pacientes y controles y con el aval del comité de Ética de la Universidad. Se diseñaron primers que se acoplan en varias áreas del gen SPARCL1 (Imagen 2), para luego realizar una Q-PCR, una técnica de PCR en tiempo real para cuantificar ADN por medio de fluorescencia por SYBR Green.

Imagen 2. Mapa de la microdeleción en 4q22.1, con las zonas a amplificar señaladas

Q-PCR Para poder obtener resultados con una diferencia de copias tan pequeña, era necesario que las muestras estuvieran a la misma concentración de 50 ng/ml. La forma en que funciona la cuantificación relativa es por medio de un gen normalizador, un amplificado que es igual en el control negativo y en el paciente, para así poder comparar si hay variaciones en el sitio de interés. En nuestro caso, el gen normalizador fue el amplificado 1, que se encuentra en el Exon 1 de SPARCL1 y que, por la prueba piloto, sabemos que no es afectado por la microdeleción. Este gen normalizador fue llamado SPA. El sitio de interés es el amplificado 3, que se encuentra en el exón 8 de SPARCL1 y sabemos con seguridad que cae dentro de la deleción gracias a la prueba piloto con microarreglos. Este amplificado fue llamado SPE. Para esta práctica se usó un control negativo como referencia para una Q-PCR relativa, comparándolo con un paciente que presento la microdeleción en la prueba piloto. Estos resultados estandarizarían el procedimiento de las demás muestras a futuro. La Q-PCR se realizó en dos equipos. El primer ensayo se realizó en un equipo CFX 96 (Bio-Rad) y los ensayos siguientes fueron realizados en el equipo Fast 7500 Real-Time (applied biosystems) de la universidad. En ambos casos se usaron los mismos parámetros: 10 minutos de denaturación a 95 °C, seguidos por 35 ciclos de 95 °C, 60 °C y 72 °C con 45 segundos en cada temperatura y con una lectura de fluorescencia al final de cada ciclo.


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Cada reacción se preparó en strips con 8 pozos, que contenían 10 μl de Master Mix con SYBR Green, 1 μl de primer forward y 1 μl de primer reverse a 10 μM, 2 μl de muestra de ADN cuya concentración fue de 200 ng/μl en el primer ensayo, 25 ng/μl en el segundo y 50 ng/μl en el último ensayo, y 6 μl de agua purificada sin DNTPasas. Para validar los datos del segundo y tercer ensayo, donde se obtuvieron resultados más congruentes que en el primero, se calculó con el método 2-ΔΔCt. descrito por Ferreira et al (2006). Uno de los valores que provee el 7500 Fast real time es ΔCt, la diferencia entre el Ct del gen normalizador y el Ct del amplificado de interés. Este valor se debe tomar para el control negtivo y para el paciente, y luego restar el ΔCt del control negativo al ΔCt del paciente. Este nuevo valor es ΔΔCt, que luego se usa en la fórmula 2-ΔΔCt. De acuerdo con Ferreira et al (2006), no hay diferencia en el número de copias si 2-ΔΔCt esta entre los valores 0.7 y 1.3. UPL Para validar nuestros resultados y observar las ventajas y desventajas de usar Q-PCR utilizamos la Universal Probe Library o UPL, una técnica que usa el mismo principio de las sondas TaqMan que fue desarrollada por Roche. Estas sondas tienen secuencias comunes en varios sitios del ADN, por lo que no es tan costosa como diseñar sondas específicas para hacer PCR en tiempo real. UPL tiene la ventaja de que viene con un programa que hace PCR in silico, por lo que es más sencillo diseñar los mejores primers para las sondas, que ya están diseñadas por UPL. Se diseñaron 3 nuevos pares de primers con el programa gratuito de la Universal Probe Library. Estos amplicones tienen una longitud de entre 65 y 70 pb y su eficiencia y temperatura se comprueban por medio de un programa diseñado por Roche, por lo que se puede asegurar la eficiencia de la PCR en tiempo real con las sondas que proponen. En esta ocasión se escogieron amplificados en el primer intrón, en el exón 5 y en el intrón 12, estos amplicones se les dieron los nombres de Par 1, Par 2 y Par 3, respectivamente. Se escogieron 3 zonas de SPARCL1 no solo para validar la presencia de la microdeleción sino para tratar de delimitarla. Estos amplicones todos tienen una sonda previamente diseñada por UPL. Esta RT-PCR se realizó en el equipo Fast 7500 Real-Time (applied biosystems) de la universidad, con los mismos parámetros que la Q-PCR. La reacción se preparó en strips con 8 pozos, que contenían 10 μl de Master Mix con SYBR Green, 1 μl de primer forward y 1 μl de primer reverse a 10 μM, 2 μl de muestra de ADN cuya concentración fue de 50 ng/μl, 1 μl de la sonda a 1x y 5 μl de agua purificada sin DNTPasas. Para sondas TaqMan y UPL, el equipo Fast 7500 tiene una opción de hacer un diagrama de cajas para comparar las concentraciones relativas de los amplicones, tomando el Ct menor del control negativo, es decir, la señal que debería ser más fuerte, como la concentración más alta, 1, y lo usa como valor de referencia para las demás muestras y


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dar una cantidad inicial relativa de los pacientes, para ver si hay variaciones en el número de copia. Resultados Q-PCR El primer ensayo se realizó con una curva de amplificación tanto en SPA como en SPE para observar si la amplificación se comportaba de un modo normal. Es decir, que a concentraciones menores el Cq, el ciclo en el que se nota una señal significativa sería mayor. Sin embargo, aunque los resultados fueron congruentes con lo esperado, se encontró que el SYBR Green deja de dar resultados confiables a concentraciones mayores de 100 ng/uL, por lo que no es posible hacer una cuantificación total con los resultados de este primer ensayo (imagen 3). Además de esto, la eficiencia, que se mide en porcentajes, llegó a más del 100% tanto para SPA como para SPE, lo que no debería suceder si se busca la concentración absoluta. Habiendo validado la hibridación de los primers y su comportamiento con SYBR Green en nuestro primer ensayo, el segundo ensayo utilizó las mismas muestras de control negativo y paciente, esta vez haciendo uso de la cuantificación relativa y asegurándose de que la concentración de ambos fuera la misma y dentro del rango de 0 a 100 ng/uL. Los resultados, sin embargo, no son concluyentes (imagen 4), pues la fórmula 2-ΔΔCt para encontrar diferencia en número de copias (Ferreira et al, 2006) fue de 1.23, lo que significa que no hay diferencia entre el control negativo y el paciente (Imagen 5). Por este motivo, se decidió hacer una validación de la microdeleción con sondas de la Universal Probe Library (UPL), que funcionan bajo el mismo principio que las sondas TaqMan, es decir, que producen una señal fluorescente cuando la sonda se rompe y se separa del templado de ADN durante la PCR.


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Imagen 3. Curvas de amplificación de los dos sitios de SPARCL1. A y B muestran los resultados de SPA y SPE, respectivamente, y C y D muestran los resultados con una regresión lineal para determinar su eficiencia.


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Imágenes 4 y 5. Resultados de cuantificación relativa de SPA y SPE con Q-PCR usando SYBR Green. Todas las amplificaciones tienen un Cq extremadamente similar, lo que significa que no hay variación en el número de copia o que la prueba no tiene la sensibilidad requerida para detectar variaciones de una sola copia.

UPL Los resultados obtenidos con UPL usando el amplicón en el intrón 1 como normalizador, muestra que no hay diferencias significativas entre las concentraciones de ADN del exón 5 para el control negativo y el paciente, lo que indica que el punto de corte de la microdeleción se encuentra después del exón 5 (imagen 6). Además de esto, se pudo notar una diferencia entre el control negativo y el paciente para el exón 12 (imagen 7). Aunque no es una relación exacta, ya que, teóricamente debería haber una diferencia del 50%, la diferencia en cuantificación de 33% es muy alta para tratarse de un error de medición, por lo que podemos confirmar la presencia de un CNV en SPARCL1. Sin embargo el 2-ΔΔCt que se calculó fue de 0,62 lo que confirma la presencia de una diferencia en el número de copia


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Imagen 6. Cuantificación relativa del exón 5 de SPARCL1 usando UPL. No se puede observar diferencia entre ambos amplicones, por lo que la deleción se encuentra en un exón posterior hasta la parte terminal.

Imagen 7. Cuantificación relativa del exón 12 de SPARCL1. Se puede notar una diferencia de cerca del 33% entre el control negativo y el paciente. Al ser demasiado para ser un error de medición, podemos confirmar una variación en el número de copia.

Discusión Ventajas y desventajas de la Q-PCR en este ensayo La Q-PCR es una técnica en tiempo real que es comparativamente poco costosa, con buena especificidad y muy sensible a cambios en las concentraciones iniciales de los amplificados. Esto la hace ideal para validar CNVs conocidos, sin embargo, los ensayos realizados en este proyecto muestran varios inconvenientes al momento de encontrar diferencias de una sola copia entre diferentes genomas. Aunque este tipo de PCR puede dar una cuantificación absoluta usando diluciones o una cuantificación relativa usando un gen normalizador y es relativamente fácil de reproducir, se encontraron varias limitaciones en nuestros ensayos.


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Los resultados del primer ensayo muestran resultados congruentes y de acuerdo con lo esperado. Sabemos que SPA y SPE son amplificados específicos de la zona de SPARCL1, y que no hay otros sitios donde estas secuencias hibriden, y que se comportan de manera normal durante la PCR. Sin embargo, la cuantificación total es mucho más costosa, pues la serie de diluciones gastan mucho más producto y la diferencia entre los genomas siendo de solo una copia requiere mucha más exactitud en la preparación del Master Mix que otras técnicas similares. El segundo ensayo, ya con una cuantificación relativa, es más sencilla y se basa en la comparación de concentraciones iniciales del gen normalizador comparadas con el sitio de interés. Aunque se hizo varias veces con una alta reproducibilidad, los resultados mostraban que no había diferencia en el número de copia. Incluso, en algunas ocasiones mostraba que el paciente presentaba una concentración inicial ligeramente mayor de ADN que el control negativo, aunque estos resultados aún entraban dentro del margen de error que provee la literatura (Ferreira et al, 2006), por lo que no podemos decir que haya habido un error en la prueba piloto y que los pacientes con depresión tengan varias copias de SPARCL1. Por este motivo, se investigó exhaustivamente sobre Q-PCR (Lebuhn et al, 2016; Thierry, 2016; Smith & Osborn, 2009) y se encontraron 3 factores necesarios para tener resultados más precisos y confiables: Pureza, Concentración inicial y especificidad. Pureza y concentración inicial Aunque la Q-PCR puede trabajar correctamente con una concentración inicial de hasta 100 ng/uL, las casas comerciales recomiendan trabajar con concentraciones iniciales pequeñas, pues la diferencia de una sola copia se mide en un ciclo de diferencia (Sigma-Aldritch, 2008). Esto quiere decir que esperamos que la concentración inicial sea tan baja que el control negativo solo tome un ciclo de más en dar la señal de fluorescencia necesaria para que el equipo lea la señal en comparación con el paciente. La literatura recomienda tener una concentración inicial de 30 ng/uL (Smith & Osborn, 2009), pero incluso al usar concentraciones más bajas de 30 ng/uL, los resultados no cambiaban respecto a los ensayos donde se usaron muestras de 50 ng/uL. El otro factor que descartamos con los ensayos de baja concentración fue el de pureza, la cantidad de contaminantes que pueden estar presentes en la solución de ADN. Para cuantificar el ADN se usó el NanoDrop, que mostraba un alto nivel de pureza en las muestras. Por tanto, la eficiencia era el único factor que no se podría descartar de los factores encontrados que afectan negativamente la sensibilidad de la Q-PCR. Eficiencia


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La eficiencia en términos de PCR en tiempo real es el porcentaje de la concentración inicial que se hibrida en el primer ciclo (Svec et al, 2015). Esta se puede determinar por medio de una curva de amplificación, donde se calcula haciendo una regresión lineal del Cq de cada dilución. La eficiencia es dependiente de la concentración inicial y longitud del amplificado, la temperatura de hibridación y la composición de los primers. En nuestro primer ensayo la eficiencia fue superior a 100%. Esto se debe a que había tanta concentración inicial del templado de ADN que El Cq era muy bajo en la concentración inicial, pero funcionaba normalmente en las diluciones más bajas. Esto crea una línea con una pendiente muy alta, lo que resulta en una eficiencia elevada. En el segundo ensayo, con concentraciones más bajas, sin embargo, se encontró que la eficiencia con la que estábamos trabajando era un poco menor al 80%. Ferreira et al (2006) recomendaban una eficiencia de más del 95% para poder detectar variaciones de una copia en Q-PCR. Las razones por esta baja eficiencia son variadas. Entre las mencionadas por Svec et al (2015) podemos descartar la presencia de inhibidores de la PCR y la formación de dimeros de los primers. Para validar los primers se realizó una PCR tradicional que no mostró indicios de dimeros, y el método de purificación se encarga de eliminar los inhibidores de la muestra. Estos inhibidores, además, tienden a subir la eficiencia en concentraciones iniciales por encima de 100%, mientras que nuestros amplificados tienen una eficiencia de 82% para SPA y 78% para SPE. Sin embargo, no se puede descartar la longitud de los amplificados. SPA tenía una longitud de 439 pb, y SPE de 290 pb. Estas longitudes pueden hacer que la polimerasa se denature más fácilmente en presencia de agentes como SYBR Green o sondas TaqMan. Aun así, esto no explica del todo porque la eficiencia de SPA, que tiene una secuencia más larga, es mayor a la de SPE, con una secuencia más corta. El último factor que afecta la eficiencia es el diseño subóptimo de primers. Aunque sabemos por la PCR tradicional que los primers no se hibridan en otros sitios, la presencia de SNPs (variaciones de un solo nucleotido) no reportados en su secuencia o de una hibridación pobre debido a la secuencia de los primers podría causar que haya menor hibridación de la requerida para la Q-PCR. Dieffenbach (1993) sugiere que los primers no deben tener un contenido mayor al 50% de Adenina-Timina, y que el primer, de ser posible, no debe tener adenina en el extremo 5’, para mejorar la hibridación. Los primers reverse de SPE y SPA fueron diseñados con Adenina como su base terminal en el extremo 5’, lo que puede explicar que su eficiencia sea más baja que la de SPA.


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Validación por UPL Para las sondas UPL, se pidieron los primers que recomendaba el programa gratuito de Roche, la casa comercial que creó la Universal Probe Library, por lo que podemos confirmar su alta eficiencia. Los amplicones también son más pequeños, llamados Par 1, 2 y 3, que buscan validar la microdeleción y tratar de delimitarla. UPL contiene sondas con secuencias comunes que pueden hibridarse en varios lugares del genoma, pero solo dan señal si hay hibridación con los primers, que son específicos a SPARCL1, lo que en teoría previene el ruido, pero debido a que las sondas UPL no son diseñadascon “quencher”, los primeros ciclos presentan una señal de florescencia que el equipo tomo como ruido. Los resultados obtenidos nos ayudan a delimitar la zona de la deleción, ya que debido a que los resultados por medio de UPL no muestran diferencias entre el control nagativo y el paciente en el exón 5. Aunque es probable que los microarreglos de la prueba piloto hayan dado falsos positivos, los resultados de la PCR en el exón 12 confirman que hay una variación en el número de copia. Aunque la diferencia según teoría debería ser del 50% debido a que estamos comparando una muestra con 2 copias con una muestra que solo tiene 1, una diferencia del 33% es muy alta para ser descartada como un error estándar. Se podría obtener resultados más robustos si se varía la concentración de primers y de sonda hasta encontrar la mejor eficiencia, sin embargo, estos resultados corroboran la presencia del CNV. Validación del CNV Aunque los resultados de la Q-PCR no fueron satisfactorios, gracias a los varios errores se ha podido entender más los principios y limitaciones de las diferentes técnicas de PCR en tiempo real, especialmente cuando se requiere una sensibilidad alta para determinar una diferencia de una copia (Tabla 1). Con UPL, que es una prueba más sensible, se pudo identificar la microdeleción que ya se había definido en la prueba piloto, y se pudo delimitar al comprobar que no abarca el exón 5 de SPARCL1. Cabe notar que debido a que UPL usa sondas con secuencias muy comunes, los primeros ciclos de la PCR en tiempo real presentan cierto ruido debido a que se hibridan en varios sitios del genoma antes de que haya amplificación. Esto no cambia los resultados, pero puede causar ciertos problemas en equipos más antiguos de RT-PCR. Replicando la prueba piloto usando las mismas muestras mostró que 7/17 pacientes tenían la deleción, con un valor 2-ΔΔCt menor a 0,7. Todas estas muestras dieron positivas en la prueba piloto, por lo que es poco probable que hayan falsos positivos entre ellas. La cuantificación relativa en estas muestras tuvo una variación de 25% a 42% de diferencia al compararlo con el control negativo. Los 5 casos restantes que presentaron la deleción en la prueba piloto no la mostraron en este ensayo. Esto puede deberse a un error humano, ya sea en el aCGH de la prueba piloto o en la RT-PCR.


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Tabla 1. Comparación entre SYBR Green y sondas UPL.

SYBR Green Sondas UPL

+ La cuantificación puede ser absoluta usando diluciones o relativa usando un gen calibrador. + Menos costosa comparada con otros métodos de cuantificación real-time. + Sensible a la concentración inicial. + Relativamente fácil de reproducir. - Se requiere una alta precisión en las concentraciones de ADN iniciales. - Entre más pequeña la diferencia de las concentraciones iniciales, se debe ser más estricto con la preparación del Master Mix y la concentración inicial. - Funciona mejor con secuencias y concentraciones pequeñas.

+ Fácil de diseñar, con programas que hacen simulaciones de la PCR in silico, que aseguran una alta eficiencia y reproducibilidad. + Las sondas son secuencias comunes que solo dan señal si hay amplificación, reduciendo los costos de las mismas. + Sensible a concentración inicial de ADN. - Las sondas tienen un precio similar al SYBR Green, pero no incluye costos de la polimerasa o el Master Mix. - Debido a que son secuencias comunes, los primeros ciclos de la RT-PCR pueden presentar ruido que debe eliminarse manualmente en equipos más antiguos.

SPARCL1 y MDD Con el CNV validado, se pueden hacer varias conjeturas de SPARCL1 como factor de riesgo en el desarrollo del MDD. En primer lugar, Kucurelli et al (2011) demostró que Hevin, la proteína codificada por SPARCL1, es dependiente de la dosis, por lo que al tener una de las copias dañadas, se produce una cantidad menor de proteína en los astrocitos, y disminuye el número de sinapsis formadas durante el desarrollo y la primera infancia. Esta deficiencia en el número de sinapsis puede causar una incapacidad para responder a escenarios estresores, lo que haría a una persona con este CNV mucho más vulnerable a desarrollar MDD u otra enfermedad mental. De comprobar que este CNV es un factor de riesgo para la enfermedad, podría convertirse en una herramienta diagnóstica para identificar personas propensas al MDD, en especial considerando su creciente incidencia en el marco de salubridad mundial. A futuro, se debe aumentar el número de casos y controles para determinar si la microdeleción es un factor de riesgo en el desarrollo del MDD, y así poder entender mejor como identificar personas vulnerables a esta enfermedad.


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