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MATRICULA

ASESOR

IZTAPALAPA

CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

BlOLOGlA EXPERIMENTAL ’- L\CEoC\R?ch

INFORME FINAL DEL SERVICIO SOCIAL

EFECTO DE LA EXPOSICION DE LINFOCITOS HUMANOS EN CULTIVO A PARTICULAS DE ZINALCO EN SUSPENSION

OCTUBRE 1997

ESPINOSA GOMEZ SAUL

87329282

M. en C. MARIA DE LOS ANGELES AGUILAR SANTAMARIA

INFORME FINAL

BIOLOGIA EXPERIMENTAL

LABORATORIO

ESTE TRABAJO SE REALIZO EN EL LABORATORIO DE GENETICA EVOLUTIVA DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD EN LA UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA, BAJO LA DlRECClON DE:

M. en C. MARIA DE LOS ANGELES AGUILAR SANTAMARIA.

I

INDICE

INDICE

O INTRODUCCION

13 JUSTlFlCAClON

O OBJETIVO

O HIPOTESIS

O METODOLOGIA

O RESULTADOS

INDICE MITOTIC0

ABERRACIONES CROMOSOMICAS

ALTERACIONES NUMERICAS

ENSAYO COMETA

O DISCUSION

O CONCLUSION

O BlBLlOGRAFlA

PAGINA

1

8

9

9

10

13

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INTRODUCCION

EFECTO DE LA EXPOSICION DE LINFOCITOS HUMANOS EN CULTIVO A PARTICULAS DE ZINALCO EN SUSPENSION.

INTRODUCCION.

Debido a que el hombre ha estado aplicando la tecnología a su vida diaria, se encuentra cada vez más a merced de una serie de accidentes, los cuales lo pueden afectar de diferentes formas y, entre las más frecuentes, se encuentra la fractura de huesos.

La sustitución de articulaciones naturales por otras artificiales es un campo que se ha estudiado y perfeccionado continuamente en los últimos años.

Este tipo de articulaciones son normalmente fabricadas con aleaciones de metal y son utilizadas para reforzar, cubrir o, en algunos casos, reemplazar fragmentos de hueso (1 ).

Para poder hacer este tipo de implantes son necesarios materiales que al estar en contacto interno con el organismo no desaten una respuesta química o fisiológica por parte del receptor, es decir que sean biocompatibles y debido a que su aplicación como implante y colocación en el organismo es por periodos muy variados, que pueden ser desde días hasta años, deben cumplir con las normas de un biomaterial.

Hoy en día se conoce a los biomateriales como aquéllos que son utilizados clínicamente para reemplazar una parte específica del cuerpo con el que va a interactuar por un tiempo. Los biomateriales se distinguen de otros materiales debido a que al ser implantados en el organismo armonizan en un alto grado con el medio fisiológico interno en el que se encuentran, es decir, que no provocan una respuesta que pudiera originar alguna forma de rechazo.

Se han determinado varias características que debe poseer un material para que pueda ser considerado como biomaterial y entre ellas destacan (2):

I) BlOCOMPATlBlLlDAD. Que se refiere a que el material implantado no afecte ni sea afectado por el organismo 2) ESTABILIDAD QUIMICA.-El material debe tener determinada estructura que evite al máximo su degradación o señas de corrosión. 3) PROPIEDADES FlSlCAS Y MECANICAS ADECUADAS.- Que van a estar de

acuerdo al sitio o parte que van a sustituir en el organismo.

INTRODUCCION

4) COSTO.- Presentar un precio accesible para la mayoría de la población.

Los biomateriales pueden tener diferentes presentaciones ( placas, polvos, discos, etc.) y entre los más comunes o más utilizados en medicina se encuentran los elaborados con : acero, titanio, tantalio, oro, platino y aleaciones como el vidrio, alúmina, fosfato de calcio, de cobalto y cromo, polisiloxanos y polisulfanos, mezclas carbón-carbón y carbón-.cerámica; además, aquéllos en donde el centro es metálico y el exterior tiene una capa de cerámica como protección.

Todos los anteriores cuentan con las características propias de los biomateriales y por ello son utilizados ampliamente en la vida diaria (3)

Como se había mencionado, la biocompatibilidad es la interacción de un biomaterial con su entorno biológico y en la cual no hay ningún mecanismo de daño o rechazo.

Existen diferentes pruebas para determinar la biocompatibilidad de un material, y para tal efecto, se han relacionado diversas áreas de estudio como la Física, Química, Biología, Medicina, Ingeniería, etc.

En los Estados Unidos de NorteAmérica, "The American Society for Testing and Materials" ( ASTM-Standard ), estableció una serie de pruebas para determinar la biocompatibilidad de un material que abarca aspectos como corrosión, resistencia y aspectos mecánicos, entre otros. Además la ASTM-Standard y la Sociedad Ortopédica Alemana ( DGOT ) establecen que los materiales cuyo fin sea el de implantes ortopédicos deben ser probados también en diferentes tejidos por periodos que varíen desde días hasta varios meses y las pruebas deben ser realizadas tanto in vivo como & m. Es importante puntualizar que para obtener resultados más completos, se analizan respuestas locales y generales en el organismo (1,4,5).

En lo referente a pruebas in vivo, el material es colocado en el organismo a diferentes niveles (subcutáneo, muscular y óseo); este tipo de pruebas se realiza en diferentes animales de laboratorio como son ratas, conejos, perros, cerdos, etc.

Para realizar pruebas in vitro han sido utilizados cultivos de fibroblastos, macrófagos y linfocitos de sangre periférica, colocando en ellos el material a investigar inmerso en el cultivo celular y dando un periodo de tiempo para que interactúe y posteriormente se analicen los resultados para determinar si hay o no algún tipo de daño celular (5,6,7).

En la búsqueda de nuevos materiales, el Instituto de Investigaciones de Materiales de la UNAM, desarrolló una aleación eutectoide que presentó características físicas, químicas y mecánicas muy similares a las que poseen el acero y el titanio (tabla I), conocidos biomateriales que son ampliamente utilizados en ortopedia y con la característica de tener un elevado costo (I ,4,6,8,)

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INTRODUCCION

TABLA 1

PROPIEDADES MECANICAS DEL HUESO COMPARADAS CON OTROS MATERIALES USADOS ACTUALMENTE EN ORTOPEDIA.

de Zinalco. Ciencia 46 (1 995): 524-532

La aleación de la UNAM está Constituida por 78% de Zinc, 20% de Aluminio y 2% de Cobre, de allí su nombre: ZINALCO; sus propiedades físicas y mecánicas (tabla 2 y 3) hacen de este material un buen candidato para la elaboración de prótesis ortopédicas y además puede ser producido a un bajo costo, debido a que no se importa ninguno de sus elementos (4,5,8).

TABLA 2

PROPIEDADES MECANICAS DEL ZINALCO Y EL ACERO INOXIDABLE 316L

Tomado de: Pifia &t &, Evaluacidn de la respuesta tisular ante implantes de Zinalco. Ciencia 46 (1 995): 524-532

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INTRODUCCION

TABLA 3

ALGUNAS PROPIEDADES FlSlCAS DEL ZINALCO

Con el surgimiento del Zinalco, se procedió a realizar pruebas tanto in vitro como

como un biomaterial que pueda reemplazar a las costosas prótesis ortopédicas ya existentes (1,4,7).

- vivo para determinar si la aleación podría ser biocompatible y por tanto ser utilizada

Para conocer el efecto del Zinalco, se han realizado estudios en los que se han implantado placas de esta aleación de forma subcutánea e intramuscular en ratas de la cepa Wistar por periodos de hasta 8 meses, sin encontrar ningún tipo de daño o de respuesta inmune en las células adyacentes, además se logró determinar que las placas de Zinalco presentan una velocidad de corrosión de 0.0075 mm al año, lo cual no produce alteración alguna en la estructura de la aleación, es decir, no hay liberación de iones en el medio (4,5,8).

En otros experimentos se utilizaron larvas de Drosophila melanoaaster, a las que se administró Zinalco sonicado en su dieta, sin que provocara ningún tipo de alteración en su ADN (5).

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INTRODUCCION

Los estudios han sido realizados únicamente a nivel de citotoxicidad, utilizando cultivos de linfocitos y fibroblastos, en los cuales se ha concluido que el Zinalco en diferentes concentraciones no es tóxico para las células (57).

Como es sabido, el cultivo de linfocitos es utilizado ampliamente para determinar genotoxicidad pues con ellos se han podido obtener datos de algunos biomarcadores importantes como en nuestro caso: el índice mitótico (IM), aberraciones cromosómicas (AC) y migración del ADN (ensayo cometa), que nos permiten determinar si un agente es cito y/o genotóxico.

Biomarcadores como el IM, se basan en el grado de proliferación celular como respuesta a la presencia de algún agente y se define como el porcentaje de células que contienen cromosomas condensados en un momento determinado del ciclo celular, la mitosis (9,IO); para determinar el porcentaje de células que se encuentran en mitosis (IM), el número analizado varía de laboratorio en laboratorio, sin embargo en algunas citas se menciona el análisis de 1000 células por cultivo.

Debido a la facilidad para determinar IM, este ha sido utilizado ampliamente como biomarcador para detectar tanto in vitro como in vivo los efectos de agentes químicos y físicos (1 1 ).

Por su parte las AC sólo pueden ser detectadas y analizadas fácilmente cuando los cromosomas están en metafase y han sido utilizadas para determinar la clastogenicidad (cuando se rompe o se altera la estructura del cromosoma) de algún agente. Las A C son el resultado de la discontinuidad en la doble hélice de ADN y de las proteínas que constituyen la cromatina de los cromosomas y han sido clasificadas en dos grupos: estructurales y numéricas (12,13,14).

El tipo de aberración va a depender de la etapa del ciclo celular en la cual se indujo la alteración; se han observado AC en que las mitosis presentan un gran número de gaps y rompimientos y se les han llamado mitosis fragmentadas o pulverizadas (Figura I), este fenómeno ocurre en células que de forma natural o artificial son multi o micronucleadas y en las cuales, uno o varios núcleos de manera asincrónica entran en mitosis. Estas alteraciones son registradas pero no contadas como A C y son consideradas como un fenómeno indirecto que ocurre en células micro y multinucleadas (9, 14,15,16).

Las aberraciones estructurales también se dividen en dos: cromatídicas (involucra una cromátida) y cromosómicas (toman parte ambas cromátidas). En ambos casos se incluyen gaps, rompimientos e intercambios simétricos y asimétricos (ver figura 1) (16).

Un tipo curioso de aberración ha sido la presencia de fragmentos porción del telómero, que se observan como puntos diminutos de un

pequeños en la grosor cercano o

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INTRODUCCION

igual al de una cromátida y de allí su nombre de diminutos. El cromosoma que presenta estos fragmentos tiene un aspecto parecido al que tienen los cromosomas con satélites, este tipo de AC se incluye en los rompimientos cromosómicos (17).

Las aberraciones numéricas se clasifican en dos tipos: aneuploidías y poliploidías.

Las aneuploidías se observan cuando hay variaciones en el número cromosómico que no incluyen al juego cromosómico completo y, en consecuencia, se pueden encontrar organismos monosómicos que presentan una fórmula cromosómica 2n-1

(que han perdido un cromosoma de un solo par), trisómicos 2n+l (tienen un cromosoma extra), nulisómicos 2n-2 (se pierde un par cromosómico). Los agentes que causan las aneuploidías se denominan aneugénicos (1 4,18,19).

Las poliploidías están presentes en aquellas células que tienen replicado por completo su juego haploide en tres o más veces; por lo general no se encuentran organismos animales con niveles más altos que los tetraploides (18).

Con la finalidad de conocer de una manera más precisa el efecto de algún agente directamente sobre el ADN del núcleo celular, se ha utilizado una prueba que surgió apenas la década pasada, que se conoce como electroforesis alcalina unicelular, también denominada ensayo "cometa" debido a la forma que adquieren los núcleos dañados por efecto de la electroforesis; así una mayor migración de ADN representa un mayor grado de daño en alguna de sus cadenas (20,21,22).

Este ensayo ofrece la ventaja de que se puede conocer el daño al material genético por núcleo y de forma individual con un alto grado de sensibilidad además de que se requiere un número de células muy pequeño (aproximadamente 10000 cel) y puede aplicarse a casi cualquier tipo de población, ya sea acuática o terrestre y especialmente ha sido utilizado como un biomarcador en cultivos de linfocitos humanos de sangre periférica (22,23,24).

Los tipos de daños que se pueden detectar con esta prueba son principalmente rompimientos de una cadena, algunas lesiones conocidas como sitios álcali-Iábiles debido a la aplicación del álcali de la electroforesis; también se puede detectar la reparación incompleta del ADN y gaps. Es por ello que desde su publicación en 1988 por Singh et a/, esta prueba es ampliamente utilizada en genética toxicológica así como para biomonitoreo ambiental en células de mamíferos (20,22,25,26).

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INTRODUCCION

FIGURA 1 PRINCIPALES TIPOS DE ABERRACIONES CROMOSOMICAS (Tomado de: Barile, F. 1994. Introduction to in vitro

cytotoxicology mechanisms and methods. Ed. CRC Press Inc.Boca Ratón. Florida. USA.)

G' - Gaps cromatídicos, B' - Rompimientos cromatidicos, RR - Rearreglos cromosómicos G" - Gaps cromosómicos, B' - Rompimientos cromosómicos, Pvs - Pulverizaciones o fragmentos.

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JUSTIFICACION

JUSTIFICACION.

En México las investigaciones sobre biocompatibilidad tanto in vivo como in vitro, se realizan en distintos centros de investigación; los diferentes tipos de estudio tienen por finalidad determinar si los materiales a prueba, que generalmente son producidas en esos centros, presentan características físicas y químicas que les permitan ser utilizados como prótesis (1 ).

En el caso particular del Zinalco, como ya se mencionó antes, presenta características favorables para la elaboración de prótesis óseas y las diferentes pruebas de biocompatibilidad que se han realizado hasta el momento parecen favorecer su uso como biomaterial; estas pruebas incluyen las de cito y genotoxicidad realizadas en la UAM.

Sin embargo, también se sabe que esta aleación se corroe y aunque su velocidad de corrosión es muy pequeña se consideró conveniente determinar si los productos de ésta, pudieran afectar al material genético y por ello se planteó el presente trabajo.

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OBJETIVO E HIPOTESIS

OBJETIVO.

El objetivo de este trabajo es determinar el efecto que tiene una suspensión de Zinalco con 2, 4 y 6 meses de haberse preparado, en concentraciones de O, 5, 50 y 200 pglml, sobre cultivos de linfocitos utilizando como biomarcadores el lndice Mitótico, la frecuencia de Alteraciones Cromosómicas (estructurales y numéricas) así como el desplazamiento de la molécula de ADN dañada mediante la electroforesis unicelular o ensayo "cometa".

HIPOTESIS.

Si el Zinalco es un material biocompatible, entonces los valores del índice mitótico (IM), frecuencia de aberraciones cromosómicas (AC) y de migración de ADN, no diferirán de manera significativa ni dentro ni entre los distintos lotes.

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METODOLOGIA.

En la determinación del efecto del Zinalco sobre las células se emplearon tres biomarcadores que fueron: el índice mitótico (IM), frecuencia y tipo de aberraciones cromosómicas (AC) y la electroforesis unicelular, también conocida como ensayo “cometa”, descrita por Singh et al. (1988) (26). Para ello se utilizó el cultivo de linfocitos de sangre periférica, descrito por Arakaki y Sparkes (1963) (27) y Moorhead et al. (1 960) (28).

Para la realización de las pruebas de cito y genotoxicidad se empleó Zinalco en partículas de 5 pm obtenidas por el método de sonicación; se prepararon suspensiones en agua destilada en cuatro diferentes concentraciones: O, 50, 500 y 2000 pg/ml, que fueron guardadas en recipientes de policarbonato y aplicadas 2, 4 y 6 meses después de preparadas, a cultivos de linfocitos humanos de 6 donadores adultos y sanos (3 hombres y 3 mujeres).

Los donadores fueron los mismos en los tres tiempos del experimento, todos ellos, mayores de 25 años y se cuidó que no hubieran ingerido ningún medicamento al menos una semana antes de tomarles la muestra sanguínea y ninguno de ellos presentó hábitos de tabaquismo ni alcoholismo; con estas características a estos donadores se les consideró como un grupo estable y confiable para obtener datos a lo largo de seis meses.

CULTIVO DE LINFOCITOS HUMANOS DE SANGRE PERIFERICA.

Para realizar la siembra se colectaron 8 ml de sangre por donador con una jeringa previamente heparinizada (Microlab) y se colocaron 0.5 ml de la muestra en un frasco ámpula que contenía medio de cultivo (Gibco BRL), fitohemaglutinina (Gibco BRL) y antibiótico (Microlab), dejando incubar por 72 hr. a 37°C.

Transcurridas las primeras 24 horas se formaron 4 lotes, de 3 cultivos cada uno, y se les agregó 0.5 ml de la suspensión de ZinalcoMR antes preparada para así obtener una concentración final, por lote, de O, 5, 50 y 200 pg/ml respectivamente; se reincubaron nuevamente por 48 horas.

La cosecha se inició a las 71 horas agregando a cada cultivo 0.125 ml de colcemida (Microlab) y reincubando por 1 hora más a 37°C. Transcurridas las 72 horas se hizo la separación de la fracción celular por centrifugación a 1500 rpm durante 10 min., enseguida de pasar cada cultivo con pipeta Pasteur a un tubo de centrífuga; se retiró el

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METODOLOGIA

sobrenadante y se agregaron 5 ml de solución hipotónica (agua destilada a 37°C) incubando a 37OC, durante 30 minutos para inducir el hinchamiento de las células facilitando su rompimiento y la mejor observación de los cromosomas.

Después de retirar el sobrenadante, a las células se les fijó con una solución de Carnoy (metanol-ácido acético en proporción 3: l ) con la finalidad de mantener la estructura de los cromosomas. El lavado con este fijador se realizó hasta obtener un sobrenadante incoloro y un paquete celular blanco.

La elaboración de las preparaciones se hizo por la técnica de secado a la flama; una vez secas, las laminillas se tiñieron con Giemsa (Merck) al 10% y se montaron con resina sintética (SIGMA) al 60% en Xilol para hacerlas permanentes.

Las laminillas fueron etiquetadas con una clave y se procedió entonces a su revisión en el microscopio óptico (Zeiss) por dos personas, empezando por el lndice Mitótico (IM), seguido por tipo y frecuencia de Aberraciones Cromosómicas (AC) y, por último, se determinó la frecuencia de alteraciones numéricas (mitosis con número cromosómico distinto de 46).

BIOMARCADORES.

INDICE MITOTICO.

La determinación del IM se llevó a cabo contando 1000 células por preparación teniendo un total de 6000 células por concentración por donador; esta revisión consisitió en contabilizar las células que se encontraron en división (mitosis), las que ya se habían dividido (células transformadas) y las que no respondieron al estímulo del mitógeno (no transformadas), obteniendo al final un valor porcentual de mitosis en cada preparación.

ABERRACIONES CROMOSOMICAS.

Para el caso de AC se buscaron mitosis de excelente calidad, es decir, con los 46 cromosomas dispersos y bien condensados. En este análisis se contabilizaron el número y la frecuencia de aberraciones (gaps, rompimientos y rearreglos, principalmente) en 10 mitosis por preparación, teniendo así un total de 60 mitosis por

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METODOLOGIA

concentración por donador; por último se tabuló el porcentaje de células dañadas por laminilla.

La determinación de alteraciones numéricas se realizó contando el número de cromosomas en 20 mitosis de buena calidad por laminilla, registrando números distintos o iguales al número diploide (46) en cada mitosis; la cantidad final fue de 120 mitosis analizadas por concentración por donador.

Las pruebas estadísticas de F, tanto para AC como para alteraciones numéricas se realizaron utilizando los valores promedio finales por donador, por lote a 2, 4 y 6 meses con una confianza a = 0.05.

ELECTROFORESIS UNICELULAR (ENSAYO "COMETA").

Se aplicó la técnica descrita por Singh et al. (1988) (26) la cual requiere una muestra de sangre de 15Opl que se obtuvo a partir de los cultivos destinados para AC e IM, tomando para ello una alícuota de 1 ml de los cultivos antes de ponerles colcemida. Las células fueron centrifugadas a 1000 rpm por 10 min con PBS (Microlab) libre de Ca2+ y Mg2' y resuspendidas para poder obtener los linfocitos.

Las preparaciones se hicieron colocando en un portaobjetos esmerilado una capa de 1 10 pI de agarosa de punto de fusión normal (Gibco BRL) dejando enfriar hasta que solidificara el gel; a continuación se colocó una segunda capa de 1661.11 de agarosa de bajo punto de fusión (Gibco BRL), a 37OC, mezclada con 100 pl de la muestra celular dejando enfriar a 4°C; una tercera y última capa de agar de bajo punto de fusión (9Opl) se aplicó y se enfrió a 4°C.

Una vez solidificado el gel, las preparaciones fueron sumergidas al menos durante 1 hr, en una solución de lisis (pH IO) con la finalidad de relajar y/o desenrrollar el ADN; posteriormente las preparaciones fueron colocadas en una cámara de electroforesis horizontal (Bio- Rad) que contenía un buffer de electroforesis pH 10 a 4OC, donde se dejaron por 20 min., se procedió a hacer la electroforesis aplicando una corriente eléctrica de 25 V y 300 mA con una fuente de poder compacta (E-C) por 20 min.; las laminillas fueron sacadas de la cámara y lavadas por 5 min con un buffer Tris (pH 7.5) para neutralizar el álcali (este paso se realizó 3 veces); a continuación se tiñeron con 50 pI del colorante fluorescente Bromuro de Etidio (SIGMA) en concentración de 2 pg/ml, se cubrieron con un cubreobjetos y se mantuvieron en una cámara húmeda, protegida de la luz, y en refrigeración a 4OC, hasta su observación en el microscopio de fluorescencia (Olympus) conectado a un analizador de imágenes VlDS IV (Synoptics).

De cada lote fueron revisadas 150 células, cuyo análisis consistió micrones) de la longitud del largo de sus caudas.

en la medición (en

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METODOLOGIA

Finalizado el análisis de las preparaciones se procedió a tratar los datos obtenidos con una prueba estadística ( U de Mann Whitney ) que nos permitió determinar el efecto de la suspensión de Zinalco en los linfocitos humanos in vitro, con un a = 0.05.

RESULTADOS

RESULTADOS.

Como se ha visto, este trabajo incluye tres biomarcadores con diferentes niveles de sensibilidad en la detección de daño; los resultados se presentarán desde el nivel celular hasta el que involucra la cadena de ADN.

INDICE MITOTICO.

En la tabla 4 están registrados los IM promedio obtenidos de cultivos de linfocitos que estuvieron expuestos por 48 h a diferentes concentraciones de Zinalco en suspensión, de distintos tiempos de haber sido preparadas. Los datos se obtuvieron contando 6000 células por lote y por donador.

En la tabla 4A se encuentran los valores del IM obtenidos con una suspensión de 2 meses de preparación. AI comparar los datos de cada donador se observa que el IM disminuyó con respecto al testigo conforme la concentración se incrementó y, por consiguiente, en los lotes de 200 pg/ml se obtuvieron valores del IM de casi la mitad de los lotes testigo; de igual forma el comportamiento de los valores promedio por lote fue similar. Aún con estas variaciones en el IM, al aplicar la prueba estadística de F no se encontró diferencia significativa (a =0.05) entre los distintos lotes.

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RESULTADOS

La tabla 46 contiene los datos del IM obtenidos con una suspensión de 4 meses; de la misma forma que en la tabla 4A, se observa que los valores por individuo y los promedios por lote también disminuyeron conforme se incrementó la concentración. Cuando se trataron estadísticamente los datos (prueba de F) se encontró que, al igual que a los 2 meses, tampoco se presentó diferencia significativa (a =0.05) entre los distintos lotes.

Por último en la tabla 4C, se presentan los datos del IM de 6 meses, que son de casi la mitad del valor de los que se obtuvieron a 2 y 4 meses; el IM continuó con la misma tendencia a disminuir a mayor concentración y al aplicar la prueba estadística de F se determinó que no existe diferencia significativa (a =0.05) entre los distintos lotes.

Es evidente que conforme se incrementó la concentración, los valores del IM promedio por lote mostraron una disminución. En un trabajo anterior (7) se utilizó una suspensión recién preparada de Zinalco y también se observó que el IM disminuyó conforme la concentración aumentó sin haber diferencia significativa (a =0.05).

Las preparaciones por donador, lote y tiempo de preparación de la suspensión de Zinalco (tabla 4), fueron revisadas al microscopio de luz y se observó que las preparaciones con Zinalco de 2 meses de preparación presentaron buena tinción, nítidas, en general muy buena calidad, lo que facilitó su análisis. Estas características se observó que fueron disminuyendo conforme se incrementó la concentración y el tiempo de elaboración de la suspensión de Zinalco; no obstante el análisis se logró realizar aunque requirió de mayor esfuerzo y tiempo al microscopio.

Como se ha visto la tabla 4, en general, contiene los valores de los IM de los distintos tiempos de tratamiento; se puede distinguir cómo estos datos difieren de un individuo a otro, tanto en el lote testigo como también en los demás lotes. Esto último concuerda con lo reportado por otros investigadores (7,12,20,30), quienes también reportaron sensibilidad interindividual.

La diferencia en los valores del IM de los lotes testigo nos hizo pensar que además de una sensibilidad individual, también hay una sensibilidad estaciona1 ya que los cultivos fueron realizados en meses distintos. En la grafica 1 y tabla 5, se presenta el comportamiento del IM de los lotes testigo obtenido en los 3 meses del año en que fueron realizados los cultivos. Se puede observar que efectivamente el IM varía de un mes a otro lo que confirma que además de la sensibilidad individual de los donadores también influye la época del año sobre los datos del IM.

Debido a lo anterior y con el propósito de poder comparar los valores del IM de los distintos lotes en tiempos y concentraciones, se estandarizaron los datos tomando el valor de los lotes testigo como el 100% (tabla 6) . Estos porcentajes se graficaron (grafica 2) y se observó más claramente cómo el IM disminuyó de forma inversamente proporcional a la concentración, hasta un valor próximo al 50% en los lotes de 200 pg/ml de la suspensión de 2 , 4 y 6 meses respectivamente.

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RESULTADOS

TABLA 4

VALORES DEL IM EN CULTIVOS DE LINFOCITOS QUE ESTUVIERON EXPUESTOS POR 48 h A UNA SUSPENSION DE ZINALCO CON DIFERENTES TIEMPOS DE

PREPARACION: (A) 2 MESES, (6) 4 MESES Y (C) 6 MESES.

A

B

DE = DESVlAClON ESTANDARD EE = ERROR ESTANDARD

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RESULTADOS

Se pudo observar que el Zinalco a mayor concentración y tiempo de haber sido preparado redujo los valores del IM e incrementó la presencia de células de baja calidad, sin embargo al aplicar la prueba estadística de F se encontró que no hay diferencia significativa (a =0.05) con respecto al testigo. Se puede decir, en consecuencia, que el Zinalco en concentraciones de hasta 200 pg/ml no tiene un efecto dañino significativo sobre las células in vitro por periodos de hasta por 6 meses.

16

RESULTADOS

TABLA 5

VALORES DEL IM DE LOS LOTES TESTIGO ORDENADOS DE ACUERDO AL MES EN QUE FUERON REALIZADOS LOS CULTIVOS (Diciembre 1996- Febrero 1997).

GRAFICA 1

COMPORTAMIENTO DEL IM DURANTE LOS TRES 3 MESES DEL AÑO EN QUE SE REALIZO EL TRABAJO (Diciembre 1996- Febrero 1997).

% IM 6 ,

*> O Dic Ene Feb MES DEL AÑO

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RESULTADOS

TABLA 6

VALORES DEL IM ESTANDARIZADO DE LOS DIFERENTES LOTES EXPUESTOS A CUATRO CONCENTRACIONES DE ZINALCO CON DISTINTOS TIEMPOS DE

HABER SIDO PREPARADAS.

GRAFICA 2

COMPORTAMIENTO DEL IM PROMEDIO DE CULTIVOS DE LINFOCITOS EXPUESTOS A UNA SUSPENSION DE ZINALCO DE DIFERENTES EDADES

(DATOS EN PORCENTAJES).

% IM

25 -

o ! 1

+-2 MESES "1-4 MESES 1- -6 MESES I

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ABERRACIONES CROMOSOMICAS (AC).

Con el fin de determinar si el Zinalco en suspensión tiene además de un efecto citotóxico, un efecto clastogénico y aneugénico (14,19), se hizo un análisis de AC, el cual fue dividido en aberraciones estructurales que abarcó el análisis de 60 células/concentración/donador y alteraciones numéricas en el que se contaron los cromosomas de 120 céulas/concentración/donador.

En la tabla 7 se registraron los tipos de aberraciones observados en cultivos de linfocitos de distintos donadores que estuvieron expuestos por 48 h a una suspensión de Zinalco con 2,4 y 6 meses de haberse preparado.

Comparando los datos por donador de la tabla 7A se advierte un gran número de gaps sencillos y una menor cantidad de gaps dobles, así como también un número mayor de rompimientos de tipo cromatídico que cromosómico (ver fig. 1 ), por lo cual podemos decir que el Zinalco actúa solamente durante la fase G I del ciclo celular.

El promedio de la proporción de células dañadas (YO DC) excluyendo a los gaps (30,31) es similar en los distintos lotes y no se encontró diferencia significativa (a=0.05) al aplicar la prueba estadística de F entre ellos.

Cuando se revisaron las preparaciones al microscopio, se observaron células de muy buena calidad, nítidas, con buena tinción, los cromosomas bien condensados y dispersos que facilitaron su estudio.

En la tabla 7B se muestran los tipos de AC encontrados con una suspensión de Zinalco de 4 meses de preparación; de forma similar a la tabla 7A, se encontró un número de rompimientos sencillos mayor que el de rompimientos dobles, además tampoco se encontró diferencia significativa (a=0.05).

La revisión al microscopio mostró células menos nítidas, más pálidas, con cromosomas bien condensados y en su mayoría en anafase, sin embargo el análisis se realizó con facilidad.

El registro de la tabla 7C, muestra los datos obtenidos con una suspensión de 6 meses de preparación, al igual que a los 2 y 4 meses, no se observó diferencia significativa (a=0.05) entre los distintos lotes.

El análisis al microscopio requirió de mayor esfuerzo debido a que se observaron células débilmente teñidas, una disminución en el número de células mitóticas y cromosomas descondensados.

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O cu

RESULTADOS

La presencia no siginificativa de rompimientos cromatídicos, nos ayudó a inferir que el Zinalco en suspensión a concentraciones de hasta 200 pg/ml no tiene efecto clastogénico y, por lo tanto, la probabilidad de que contribuyera a un proceso de carcinogenesis o una alteración de la carga génica de la población al menos por periodos de hasta seis meses es muy baja; sin embargo, debido al aspecto que presentaron las células de los cultivos de este último mes, se recomendaría utilizar dicha aleación por periodos más cortos.

Los datos de las alteraciones num6ricas por donador, lote y tiempo de preparación se encuentran en la tabla 8, en ella están registrados los porcentajes de células con número cromosómico igual a 46; el porcentaje se determinó tomando el número total de cromosomas observado por lote como el 100%.

En la tabla 8A, se observa por donador que, el porcentaje de células con número cromosómico de 46 está cercano al 90% y que éste no varía de forma notable ni entre los donadores ni conforme se incrementó la concentración, encontrando que los valores por lote no resultaron ser significativamente diferentes (a=0.05).

Los porcentajes observados con la suspensión de Zinalco de 4 meses (tabla 8B), resultaron ser similares a los de la tabla A y también se pudieron observar valores del 90%, los cuales tampoco variaron significativamente (a=0.05).

Como se mencionó anteriormente las células de los cultivos expuestas a Zinalco con 6 meses de preparación se observaron de menor calidad, aún así se pudieron analizar y contar los cromosomas, encontrando que en todos los lotes también el 90% de las células presentaron un número cromosómico de 46 y de igual forma no se encontró diferencia significativa (a=0.05).

Para observar el comportamiento de las células que presentaron un número distinto de 46 se hizo un análisis de número modal, los resultados fueron graficados (gráfica 3), y se puede comprobar la predominancia anteriormente mencionada de células con número cromosómico de 46 en los distintos lotes y en los distintos tiempos; también se puede observar que los números cromosómicos varían en intervalos de 40-90 con la suspensión de Zinalco de 2 meses (gráfica 3A), 39-50 con la suspensión de Zinalco de 4 meses (gráfica 3B), y por último de 41-47 con la suspensión de 6 meses (gráfica 3C).

Los resultados obtenidos de las aberraciones estructurales y numéricas nos animan a sugerir que la presencia del Zinalco como implante o como un posible producto de corrosión en concentraciones de 200 pg/ml, no produce ninguna alteración o daño significativo en su estructura o número cromosómico en un periodo de tiempo de seis meses.

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RESULTADOS

TABLA 8

PORCENTAJE DE CELULAS CON 2n = 46 POR DONADOR Y POR LOTE QUE ESTUVIERON EXPUESTOS POR 48 h A UNA SUSPENSION DE ZINALCO DE DIFERENTES EDADES: (A) 2 MESES,

(B) 4 MESES Y (C) 6 MESES.

A

B

C

. . . - . . . DE = DESVIACION ESTANDARD PORCENTAJES DEL NUMERO CROMOSOMICO TOMANDO

COMO EL 100%. EL NUMERO TOTAL DE CROMOSOMAS OBSERVADOS

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GMFICA 3. DlSTRlBUClON MODAL DEL NUMERO CROMOSOMICO EN CELULAS TRATADAS CON UNA SUSPENSION DE ZINALCO DE DIFERENTES TIEMPOS DE

HABERSE PREPARADO : A) 2 MESES, B) 4 MESES, C) 6 MESES A

CELULAS

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 55 60 65 77 79 85 90 91 92 94 No. CROMOSOMICO

B

C

CELULAS

39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 55 58 60 67 TO 75 a0 aa 92 93

No. cromosomico

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ELECTROFORESIS UNICELULAR (ENSAYO 'COMETA'').

En lo referente al ensayo "cometa" se tabularon los datos igual que para el IM y AC, esto es por donador, lote y por tiempos respectivamente; los datos se obtuvieron analizando 150 células/lote/donador.

En la tabla 9A, se muestran los datos de las migraciones de ADN obtenidas de los cultivos de linfocitos expuestos por 48 h a una suspensión de Zinalco de 2 meses. AI analizar los datos de cada donador por lote, se observó que la migración tuvo ligeras variaciones pero en general se mantuvo constante conforme se incrementó la concentración; se nota que los valores promedio totales también presentaron la misma tendencia y, al aplicar la prueba estadística de U de Mann-Witney a los datos, no se encontró diferencia significativa (a=0.05) entre los distintos lotes; además, al igual que en el IM, en este ensayo se observó una clara sensibilidad interindividual (29,32), que se puede ver al comparar los datos por lote y tiempo de elaboración del cultivo (ver tabla 9).

En la tabla 9B se encuentran los datos obtenidos con una suspensión de Zinalco de 4 meses de haber sido preparada, los valores promedio de migración de ADN por lote son muy similares a los de 2 meses y tampoco se encontró diferencia significativa (a=0.05) entre los distintos lotes; la similitud en los datos obtenidos a 2 y 4 meses con las suspensiones de Zinalco sugieren que un implante de este metal puede estar inmerso en el organismo sin que con ello se vea afectado el material genético de las células, al menos por 4 meses.

En los datos obtenidos de cultivos expuestos a la suspensión de Zinalco de 6 meses de preparación (tabla 9C), se observó que la migración del ADN por donador y por lote fue menor que con las de 2 y 4 meses, se observa un patrón de migración que aumentó conforme se incrementó la concentración. En el lote de 200 pglml se presentó el valor más alto de migración y es muy similar a los obtenidos en 2 y 4 meses en la misma concentración; de igual forma no se determinó una diferencia significativa (a=0.05) entre los distintos lotes, y agregando estos resultados a los anteriores, podemos afirmar que el Zinalco se podría utilizar en el organismo sin que produzca daño hasta por un periodo de tiempo de seis meses.

En la gráfica 4 se observa el comportamiento de la migración de ADN en los distintos tiempos y concentraciones, observándose que con el Zinalco de 2 y 4 meses la migración se mantiene constante en todas las concentraciones; el tiempo de 6 meses fue el Único que presentó una tendencia dependiente de la concentración, es decir, a los 6 meses, se observó que la tendencia de la migración fue aumentando conforme la concentración se incrementó, aún así la migración a 200 pg/ml no sobrepasó los valores de los tiempos anteriores del mismo lote, mostrando con ello que a los 6 meses no se presenta un daño mayor.

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RESULTADOS

TABLA 9

VALORES DE MIGRACION DE ADN DE CULTIVOS DE LINFOCITOS EXPUESTOS A UNA SUSPENSION DE ZINALCO DE DISTINTOS TIEMPOS DE HABER SIDO

PREPARADA : (A) 2 MESES, (B) 4 MESES Y (C) 6 MESES.

A

B

C

EE = Error estándard PROM = Promedio general

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RESULTADOS

GRAFICA 4

DlSTRlBUClON DE LA MIGRACION DE DNA (pm) PRODUCIDA POR ZINALCO EN SUSPENSION A DISTINTOS TIEMPOS.

20

15

10

5

O O 5 50 200 Nglml

De los datos obtenidos a partir de las migraciones de ADN se pudo inferir que el Zinalco en suspensión con 2, 4 y 6 meses de haberse preparado y al igual que ocurrió en el IM y las AC, no produce daño en el material genético de las células (a=0.05) y, por lo tanto, esta aleación podría ser utilizada como biomaterial en la elaboración de prótesis ortopédicas que podrían utilizarse en el organismo por periodos de hasta 6 meses.

26

DISCUSION

DISCUSION

Los biomarcadores utilizados en este trabajo, el índice mitótico, aberraciones cromosómicas y migración de ADN son los más utilizados en estudios de cito y genotoxicidad, pues han probado su eficacia en la detección de daño a nivel celular, subcelular y molecular.

Los resultados obtenidos con los tres biomarcadores utilizados en este trabajo nos muestran que el Zinalco no tiene efecto negativo sobre la proliferación celular, ni altera la frecuencia basal de aberraciones cromosómicas, ni tampoco afecta al número diploide normal; más aún, a un nivel molecular, las diferencias encontradas en el ensayo cometa confirman que este material es inocuo. En virtud de que en este proyecto los donadores fueron siempre los mismos y que no cambiaron de manera significativa sus hábitos de vida ni enfermaron en los seis meses que duró la fase experimental, consideramos que los resultados aquí presentados son confiables y que tienden a apoyar la utilización del Zinalco como biomaterial.

Se sabe que los componentes de este material Zinc, Aluminio, Cobre , son por sí mismos elementos que alteran al menos la estructura de los cromosomas y por las observaciones realizadas es evidente que en forma de aleación su clastogenicidad desaparece y esto puede considerarse como un reflejo de su estabilidad.

Pudiera pensarse que no se registró daño alguno debido a que las partículas no hubieran podido ingresar a la célula, sin embargo, esto puede descartarse debido a que las partículas medían de 3 a 5 micras, por lo que cabría esperar que el tamaño de las partículas producto de la corrosión del material fueran todavía menores.

Otro aspecto interesante a considerar es que en caso de que la aleación tuviera que permanecer en el organismo por un tiempo prolongado y que los productos de la corrosión se acumularan, de acuerdo con nuestros resultados podrían alcanzar concentraciones tan altas como 200 pg/ml sin causar daño alguno; esto sin considerar que in vitro, la célula está más expuesta y que al estar en un organismo éste tiene sus propios mecanismos de defensa.

Por todo lo anterior podemos asegurar que con las pruebas realizadas con este trabajo la probabilidad de que el Zinalco le cause daño a la proliferación de las células a la estructura y cantidad de cromosomas y a la molécula de ADN, es casi nula.

27

DISCUSION

En virtud de la aplicación que quiere dársele al material se hace necesario ampliar las pruebas in vitro empleando también otros modelos celulares. Por ejemplo cultivos de fibroblastos en los que además de los biomarcadores aquí aplicados, podría obtenerse información acerca del efecto de la aleación sobre la morfología y la capacidad de adhesión de las células a la superficie sobre la que crecen; sería de particular interés hacerlo con este sistema celular ya que se ha observado que los implantes de Zinalco en animales de experimentación son recubiertos casi inmediatamente por este tipo de células.

Los otros estudios, los in vivo, también deben seguir realizándose con aquellos modelos experimentales que den resultados que puedan ser extrapolables al hombre, y así, si el Zinalco resulta ser un biomaterial, este pueda ser utilizado en la fabricación de implantes ortopédicos y quizá de algunos otros.

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CONCLUSION.

A partir de los datos obtenidos, podemos concluir que el Zinalco o el producto de su corrosión inmerso o depositado en el organismo, no provoca ningún efecto adverso en las células, estructura y número cromosómico ni en la cadena de ADN, por un periodo de tiempo que puede ser hasta de 6 meses.

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