RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO. ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE...
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RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO
DEENSAYO
ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE
DIVERSIDAD MOLECULAR
Problemática:1. Necesidad de nuevas actividades2. Métodos basados en la estructura: gran requerimiento
Mediante la evolución dirigida pretendemos mimetizar los procesos naturales de selección
Ventajas:1. Empleo de elevado número de
variantes2. Posibilidad de resumir siglos de
evolución en días3. Amplio uso en biología molecular
Inconvenientes:1. Necesidad de un buen sistema
de selección
GENERACIÓN DE DIVERSIDAD
Librería (población de individuos)
Individuos
Identificación
Generación de diversidad
Selección
Análisis
Materia origen
EL PROBLEMA DE LA DIVERSIDAD
Repertorio natural de Ab 1012
Oligonucleótidos degenerados (8 aa´s) 208=2x1010
Electroporación E. coli 109/µg ADN
Librería de phage display 108
Librería de ribosome display 1012
Librería combinatoriales >1012
GENERACIÓN DE DIVERSIDAD
1. Mutagénesis química
2. Mutagénesis con cepas hipermutadoras
3. PCR
4. “DNA shuffling”
5. Phage display
6. Ribosomal display
MUTAGÉNESIS QUÍMICA
* Mutágeno: EMS, HA, ...
* Supervivencia: 0,1-10%
CEPAS HIPERMUTADORAS
* E. coli XLI-red (mutD mutS mutT)
PCR
* Taq pol: error 1/10000 por ciclo
* sales de manganeso
* nucleótidos desbalanceados
“DNA SHUFFLING”
The structure of FabsThe structure of Fabs
Antigen binding by Antigen binding by CDRs in scFvsCDRs in scFvs
Expression of antibody Expression of antibody fragments in fragments in E. coliE. coli
VH CH1
VL CL
Anchor-protein
IM
PFab
OM
VH VL
NH2NH2
CH1 CL
SS
COO-COO-
Fab
Expression of antibody Expression of antibody fragments in fragments in E. coliE. coli
Anchor-proteinVH VLlinker
OM
IM
PscFv
NH2
VH VL
COO-
scFv
Massive cloning of V-Massive cloning of V-genes by PCRgenes by PCR
B-cellsB-cells
cDNAcDNA
PCRPCR
mRNAmRNA
SpleenSpleen
HybridomaHybridoma
BloodBlood
Combinatorial synthesis
Assembly of V genes as Assembly of V genes as scFvsscFvs
VH fragments
VL fragmentsLinker
Homology drivenamplification
Sfi I Not I
Assembly of V genes as Assembly of V genes as scFvsscFvs
Assembly of V genes as Assembly of V genes as scFvsscFvs
The filamentous phages: The filamentous phages: M13 life cycleM13 life cycle
N CN1 N2 CTSP
GS-rich linkers
Length in aas 67
19
131 150
39
Function TolA binding F-pili binding Phage morphogenesis
s-s s-s
The protein gp3 of The protein gp3 of M13phageM13phage
Cloning of scFv genes into Cloning of scFv genes into phagemidsphagemids
bla
Sfi I Not I
ColE1 ori
M13 ori
gene 3
VH VL
(Apr)
pCANTAB-5E
plac
scFv
pIII
M13 phage
pVIII coat
Phagemid DNA
scFv-SELECTION MIMICS THE scFv-SELECTION MIMICS THE IMMUNE SYSTEM IMMUNE SYSTEM
Antigen
Infect E. coli
****
****
Amplification
**
Binding
**
Phab library
**
****
****
Expression of scFv
Elution
ARM (RIBOSOME) DISPLAY