Recuento de células mononucleares, método directo en cámara de Neubauer

Propósito: Recuento de células mononucleares por método directo en cámara de Neubauer, con el fin de realizar cálculos matemáticos necesarios para otros procedimientos.

Alcance: Todas las células mononucleares utilizadas en el Laboratorio de Monoclonales.

Responsables: Coordinador y profesionales que laboran en el laboratorio de Monoclonales.

Definiciones, Abreviaciones y/o Traducciones

Desarrollo del Procedimiento

Materiales: Camara de Neubauer

Reactivos: azul de trypán al 0.4%

Actividades:1- Se combina un volumen de suspensión que contiene las células con un

volumen igual de una solución de azul de trypán al 0.4%2- Previo al llenado de la cámara de Neubauer la misma se limpia con una

mezcla a partes iguales de alcohol-éter, se utiliza para ello un material suave como gasa o algodón,

2.1- a continuación la cámara debe ser secada con papel absorbente, preferentemente papel facial, se debe evitar el contacto de los dedos con el área donde se encuentra el retículo de la cámara (zona plateada).

3- Llenado o montaje de la cámara, con una micropipeta depositamos aproximadamente 10 ul de la suspensión que contiene las células que van a ser contadas, esto se hace en la ranura que se forma entre la base de la cámara y el cubre objeto que se coloca encima de área donde se encuentra el retículo. Dicha área debe quedar llena, pero sin desbordarse de los limites del área plateada y sin la presencia de burbujas de aire,. En la la Fig.- 2 se ilustra la cámara de Neubauer así como el llenado incorrecto de la misma.

Fig. 2.- Arriba se muestra la cámara y sus partes, el retículo es la zona milimetrada, visible al microscopio óptico. Abajo se muestra el llenado incorrecto de la misma

4- Una vez que la cámara se encuentre bien montada, se procede al recuento de las células, para ello se coloca la cámara sobre la platina de un microscopio de luz visible y pasado 3 minutos de haber sido llenada (con el fin de que todas las células sedimenten) se procede a realizar el enfoque de la preparación, el cual se hará con el objetivo de menor aumento, para evitar dañar o romper la cámara. Luego de enfocada la preparación se podrá usar el objetivo de preferencia.

5- Las células mononucleares se cuentan en cada uno de los 16 cuadrados medianos que conforman cada uno de los cuatro cuadrados grandes externos en que se divide la cámara, o sea serán contados un total de 64 cuadrados medianos. En la Fig. se muestran los cuadrados a que se hace referencia así como la trayectoria a seguir

para realizar un recuento óptimo; las células que se encuentren sobre los rayados del retículo serán contadas una sola vez.

6- La estimación del número de células por mililitro en una suspensión celular utilizando cámara de Neubauer se obtiene aplicando la siguiente fórmula.(1)

No. de Células ContadasFactor de Dilución X Factor de Conversión X

No. de Cuadrados Contados = Células / ml

6.1 - En el siguiente Ej. Debido a que la suspensión celular se encontraba muy concentrada se procedió ha realizar una dilución 1:5, previo al recuento, por lo tanto el Factor de Dilución se convirtió en 5 X 2 = 10

7- Cálculos matemáticos

7.1 - Cálculo de porciento % de viabilidadSe diluye la suspensión celular V/V en solución de azul de tripán al 0,4% (colorante vital) y se lleva al hematocímetro.

Ejemplo: 200

4X 10,000 X 2 = 1,000,000 Células / ml

Ejemplo: 200

4X 10,000 X 10= 5,000,000 Células / ml

7.1.1 - Ej. Cámara de Neubauer y se cuentan no menos de cien células entre teñidas y no teñidas. Las células vivas tienen la membrana celular íntegra y por tanto el azul de tripán no penetra, las células muertas presentan poros por lo tanto el colorante penetra y las tiñe.

7.2.-Determinación del número total de célulasNo. de células/ml X volumen total = Total de células en la suspensión

7.3.- Dilución de suspensiones y soluciones con altas concentración. La siguiente formula resuelve problemas tanto de volumen como de concentración.

CI X VF = CF X VI

CI = Concentración Inicial

VI = Volumen del concentrado

CF = Concentración deseada (Final)

VF = Volumen Final

7.3.1 Ejemplo: Entonces:

CI = 30000,000 células/ml 3,000,000 X VI = 500,000 X 54

VI = Volumen desconocido 3,000,000 X VI = 27,000,000

CF = 500,000 células/ ml VI = 27,000,000 / 3000,0000 VF = 54 ml VI = 9 De forma semejante con esta formula podemos calcular también los parámetros de concentración.

7.4.- Utilización de la Regla de Tres, para añadir compuestos en concentraciones exactas a diferentes soluciones:

7.4.1 - Ejemplo: Adición de antibiótico al Medio de Cultivo:

Células Viables (no teñidas)X

Células Viables + Células Muertas (teñidas)=100 % Células Viables

El antibiótico utilizado es la Gentamicina (farmacéutica), la misma se añade al medio a razón de 50 ug/ml, la cantidad necesaria para un litro es = 50,000 ug.La presentación comercial de la gentamicina de que disponemos es de ampollas de 2 ml que contienen 80 mg. Cuatro ampollas contendrán 320 mg Se prepara una solución concentrada de Gentamicina que contiene 4 ampollas = 8 ml y se agregan 22 ml de medio de cultivo 1 X. El volumen final es = 30 ml .Luego entonces aplicamos la regla de Tres

30 ml ---------------------- 320,000 ug de gentamicina X ----------------------- 50,000 (requerimiento para un litro)

X = 30 x 50,000/320,000 = 4,7 ml

7.4.2 - Esta regla también se aplica para realizar las preparaciones de Molaridades y Normalidades partiendo del hecho de que una solución 1 M es aquella en que su peso molecular esta disuelto en 1 litro de solvente y una solución 1 N es aquella en que el equivalente gramo se encuentra diluido en igual volumen.