ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE LA COMPOSICIÓN DE

LA LECHE SEMIDESCREMADA DOS PINOS

Martínez, E.a y Villalobos, A.

b

Laboratorio de Bioquímica General

Escuela de Química, Universidad Nacional, Costa Rica

a. Escuela de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica.

Teléfono: (+506)2277 3351 Fax: (+506) 2277 3579 Correo-e: erime89@gmail.com b. Escuela de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica.

Teléfono: (+506)2277 3351 Fax: (+506) 2277 3579 Correo-e: alevu_07@hotmail.com

RESUMEN

La leche es un alimento de consumo diario en la dieta humana y este representa un gran potencial benéfico para la

salud humana. Debido a las propiedades de la leche es necesario realizar investigaciones en las que se torna de suma

importancia conocer la composición química de este alimento. A nivel experimental se realizó la extracción de los distintos

compuestos de los que está compuesta la leche, por medio de la precipitación de la caseína de la leche en medio ácido,

posteriormente se realizó una extracción metanólica-etérea para la separación de los esteroles de los ácidos grasos, y por

último se realizó una extracción alcalina para realizar la separación de los componentes proteicos. Posteriormente se realizó

un análisis cualitativo y cuantitativo tanto de carbohidratos y azúcares. Los esteroles se analizaron por el método de

Liebermann-Bouchard y el análisis de ácidos grasos por el método de la Sulfo-fosfovainillina. Los resultados obtenidos

indican que se la leche analizada contiene 20 µg de grasa por mililitro, 480 µg de carbohidratos por mililitro, 32 µg proteína

por mililitro y no contiene una cantidad analizable de lípidos en su composición. Producto de las operaciones realizadas se

concluye que la leche eta compuesta de diversos compuestos desde distintas grasas, además de carbohidratos y proteínas

principalmente, y que se torna de suma importancia realizar estudios sobre la leche debido a la importancia de ella en el

consumo humano.

Palabras Clave: Leche, Acido Graso, Esterol, Liebermann-Bouchard, Vainillina.

ABSTRACT

Milk is a food for daily consumption in the human diet and this is a great potential to benefit human health. Due to the

properties of milk research is needed in which it becomes extremely important to know the chemical composition of this

food. For the experiment was extracted from the various components of milk which is made by means of precipitation of

milk casein in acid, then was extracted in methanol-ether to separate the sterols of fatty acids, and finally made an alkaline

extraction for the separation of protein components. Subsequently conducted both qualitative and quantitative analysis of

carbohydrates and sugars. The sterols were analyzed by the method of Liebermann-Bouchard and fatty acid analysis by the

method of Sulpho-phosphovainillin. The results indicate that the milk samples containing 20 µg of fat per milliliter, 480 µg

of carbohydrate per ml, 32 µg protein per milliliter and does not contain a parsable number of lipid composition. Product of

operations is concluded that milk it´s composed of several compounds from different fats, carbohydrates and protein as well

mainly, and that becomes very important studies on the milk because of the importance of her human consumption.

Key words: Milk, fatty acids, sterols, Liebermann-Bouchard, Vanillin.

INTRODUCCIÓN

La leche se compone principalmente de agua,

grasa, proteína, lactosa con pequeñas cantidades de

ácidos orgánicos y minerales [9]

.

La leche es una emulsión de glóbulos, donde

cada glóbulo está rodeado de grasa por una membrana

compuesta de fosfolípidos y proteínas por el que la

grasa se mantiene en una fase acuosa en forma de

emulsión sumamente fina. Las vitaminas liposolubles

A, D, E y K se encuentran dentro de la porción de

grasa de la leche [9].

La grasa de la leche se compone

principalmente de los triglicéridos (98%), que se

encuentran dentro de los glóbulos y otros lípidos (2%)

en la leche que incluyen diacilglicéridos,

monoacilglicéridos, fosfolípidos, colesterol,

glicolípidos y ácidos grasos libres. Los ácidos grasos

(AG) en la leche muestran una variación considerable

y más de 400 diferentes (AG) se han identificado en la

leche, que varían en longitud de la cadena y el

número, posición y geometría de los dobles enlaces.

Sin embargo, hay sólo unos pocos de estos ácidos

grasos que están presentes en niveles de interés

(Cuadro 1). Los ácidos grasos se componen de

carbono (C), hidrógeno (H) y oxígeno (O) dispuestos

como un esqueleto de la cadena de carbono con un

grupo carboxilo (-COOH) en un extremo [7]

.

Cuadro 1. Distintos ácidos grasos presentes en la

leche ovina [9]

Los ácidos grasos de leche de vaca contiene un

promedio de 70% de ácidos grasos saturados, un 25%

de ácidos grasos monoinsaturados y un 5% de ácidos

grasos poli-insaturados. Los ácidos grasos más

abundantes son el C16:0 (ácido palmítico) y el C18:1

(ácido oleico) [6]

, como se observa en el Cuadro 1.

En la Figura 1 se muestra una conformación

detallada de la composición de la grasa en su forma de

glóbulos en la leche ovina.

Figura 1. Estructura general de la grasa de la leche ovina [2]

En comparación con la leche de otras especies

leche de vaca también contiene una gran proporción

de ácidos grasos de cadena corta, de los cuales C4:0 y

C6:0 son únicos a la leche de los rumiantes. La

composición de la grasa de leche es esencial para

muchas de las propiedades de los productos lácteos.

El equilibrio entre los ácidos grasos de cadena corta

insaturados y ácidos grasos de larga cadena puede

afectar a las propiedades de transformación, la calidad

del producto y las características organolépticas de la

leche [9].

Además de las grasas, otro gran constituyente

de la leche son las proteínas, Se considera que existen

dos tipos fundamentales de proteínas lácteas. Una

cantidad relativamente pequeña, se haya adsorbida en la

película que rodea a los glóbulos grasos, se le denomina

proteínas de la membrana del glóbulo de grasa

(MFGM por sus siglas en Inglés) como se observa en el

cuadro 2, no se conocen muy bien la naturaleza de estas

proteínas pero parece ser que algunas actividades

enzimáticas de la leche se hayan localizadas allí. La

eliminación de esta película suele dar lugar a la

aparición de “grasa libre” capaz de alterar las

características de solubilidad de la leche. La mayor parte

de las proteínas lácteas son retenidas en la leche

descremada tras la separación de los glóbulos grasos.

Las proteínas de la leche descremada se pueden separar

en varias fracciones: Caseína en un 80% y en un 20%

Albúmina y globulina, además de Proteasa-Peptona y

Nitrógeno no proteico en fracciones muy pequeñas [14].

En el cuadro 2 se observa la composición de la

leche en términos de las proteínas y grasas

constituyentes de un glóbulo de grasa de leche bovina:

Cuadro 2. Composición del glóbulo de grasa en la

leche ovina (mg/Kg de leche) [3]

Los carbohidratos de la leche están

representados en su mayoría por la lactosa (Figura 2),

el único carbohidrato libre presente en todas las

leches, que se encuentra en cantidades importantes. Se

sintetiza en la glándula mamaria y tiene un sabor que

es relativamente poco azucarado, poco soluble y posee

un efecto reductor [5]

. La lactosa es muy estable frente

al ataque enzimático; sin embargo, es la más sensible

a la acción microbiana. Dentro de la composición

química de la leche, la lactosa representa el 4.9%

aproximadamente, y es conocida como el azúcar de la

leche [3]

.

Figura 2. Estructura de lactosa es un disacárido formado por una

molécula de D-galactosa y otra molécula de D-glucosa, unidos por un

enlace glicosídico [13].

La caseína es una proteína conjugada de la

leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche

por acidificación y forma una masa blanca. Las

fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están

químicamente unidas a una sustancia que contiene

ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos

fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los

aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche

se encuentra en forma de sal cálcica(caseinato

cálcico). La caseína representa cerca del 77% al 82%

de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en

composición de la leche líquida [1]

.

El alto número de residuos de prolina en la

caseína causa un especial plegamiento en la cadena de

proteína e inhibe la formación de una fuerte y

ordenada estructura secundaria. La caseína no

contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta

de estructura secundaria es importante para la

estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización

por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la

situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo

que facilita la unión entre unidades proteicas y la

convierte en prácticamente insoluble en agua. En

cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y

en soluciones salinas tales como oxalato sódico y

acetato sódico [1].

La propiedad característica de la caseína es su

baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6

aproximadamente, estando a ese pH la caseína

cargada negativamente y solubilizada como sal

cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa

de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos

fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita [11]

,

como se observa en la ecuación 1:

Ec, 1.

La caseína precipitada puede tornarse

nuevamente soluble por la adición de calcio o una

base, por el cambio del pH más allá del punto

isoeléctrico. De hecho la caseína se purifica por su

precipitación con ácido y disolución con bases por

varias veces. A pesar que la caseína no se coagula

comúnmente en el hervido, podrá haber coagulación,

si la leche estuviera ligeramente ácida o si se emplean

temperaturas elevadas. Así la leche fresca ligeramente

ácida tiene tendencia a coagular [14]

.

El método químico de Liebermann-Burchard

para la determinación de colesterol en una muestra

lipídica se basa en el desarrollo de una coloración

verde en presencia de anhídrido acético y ácido

sulfúrico concentrado con temperatura, después de 30

min de reacción [12]

. La intensidad de la coloración es

medida por absorción en el espectrofotómetro a 620

nm. La intensidad tiene una relación lineal con la

concentración de colesterol entre 100 y 600μg, se

debe realizar una solución control de colesterol de

diferentes concentraciones para realizar una

comparación [10]

. El mecanismo de la reacción que

ocurre entre el colesterol y el reactivo de Liebermann-

Bourchard se muestra en la Figura 3.

Figura 3. Mecanismo de reacción del colesterol con anhídrido acético en

medio ácido (Reacción Liebermann-Bourchard). El compuesto formado

absorbe de 600-620nm [4] n

La especificidad de la reacción de la sulfo-

fosfovanillina con los lípidos fue determinada para

estos metabolitos por su potencial para el análisis de

lípidos, esta reacción es comparable con la reacción

de ninhidrina para los aminoácidos. La sulfo-

fosfovainillina muestra su versatilidad en que se

aplica tanto a los extractos de lípidos como de las

soluciones de lipoproteínas. La reacción de este

compuesto cromofórico con los lípidos brinda una

coloración rojiza clara que absorbe a 530-540 nm [10]

.

El mecanismo de reacción de la sulfo-

fosfovainillina es complejo y se ha propuesto el que se

muestra en la Figura 4.

Figura 4. Mecanismo de reacción de los lípidos con el reactivo de la

sulfo-fosfovainillina. El compuesto formado absorbe de 530-540nm [10].

Día a día la investigación encuentra nuevos

componentes tanto del núcleo como de la membrana

del glóbulo de grasa de la leche ovina, relacionados

con la salud humana. Por lo tanto, el potencial

benéfico de la grasa de la leche continúa siendo

atractivo para su exploración y de ahí la importancia

de llevar a cabo estos análisis [2]

.

SECCIÓN EXPERIMENTAL

El análisis de lípidos en leche se realizó en tres

etapas, la primera parte correspondió a la extracción

de las fases acuosa, metanólica, etérea y alcalina.

Posteriormente se realizó el análisis cualitativo y por

último el análisis cuantitativo como se detalla a

continuación:

Parte 1: Extracción y separación de componentes

Extracción Acuosa

En dos tubos de 16×100 mm se colocaron 2,5

mL de leche, se agregó a cada tubo 5 mL de ácido

tricloroacético 9,0% m/v; se mezcló suavemente y se

dejó en reposo, se repitió la agitación cada minuto por

3 minutos. Luego de este tiempo se dio la aparición de

grumos, se tapó el tubo con tapón de hule y se

centrifugó a máxima velocidad en centrífuga clínica

por 5 minutos. Se separaron los sobrenadantes y se

transfirieron a una probeta de 25 mL. Se aforó a 25 mL

el volumen de líquido contenido en la probeta con agua

destilada. Se mezcló y se transfirió a un recipiente rotulado

como “extracto acuoso”.

Extracción Etérea – Metanólica

Se transfirieron los sedimentos del paso anterior

a un solo tubo de ensayo. Se agregó a los sedimentos

en el tubo, 2 mL de metanol 99% m/m, se agitó

enérgicamente durante 3 minutos y se dejó reposar

por 2 minutos. Se agregó otros 2 mL de metanol y se

repitió el proceso de mezclado. Se agregó 2 mL de éter

de petróleo (40:60), y se colocó el tapón de hule, se agitó

enérgicamente por 3 minutos y se dejó en reposo por 2

minutos. Se repitió este proceso agregando otros 2 ml

de éter de petróleo (40:60). Aparecieron tres fases

nítidamente separadas y se centrifugó por 5 minutos en

centrífuga clínica a máxima velocidad. Se trasladó la

fase líquida superior a una probeta de 25 mL rotulada

“extracto etéreo”. Se trasladó la fase líquida inferior a

una probeta de 25 mL rotulada “extracto metanólico".

Se aforó a 25 mL, con éter de petróleo el “extracto

etéreo” y se guardó dicho extracto en un recipiente

apropiado. Se aforó a 25 mL, con metanol el “extracto

metanólico” y se guardo dicho extracto en un recipiente

apropiado.

Extracción Alcalina

Al sedimento que se centrifugó de la extracción

etérea–metanólica en cada tubo, se le agregó 6 mL de

NaOH 1.0 M, se suspendió por agitación y se coloco en

baño maría por 10 minutos, y posteriormente se enfrió en

baño de agua. Se separó el sobrenadante y se transfirió

a una probeta de 25 mL. Se agregó al sedimento

centrifugado 6 mL de NaOH 0,1 M, se suspendió por

agitación y se colocó en baño maría por 10 minutos, se

enfrió en baño de agua. Se tapó el tubo con tapón de

hule y se centrifugó a máxima velocidad en centrífuga

clínica por 5 minutos. Se separó el sobrenadante y se

transfirió a la probeta de 25 mL con el sobrenadante

de la primera extracción con NaOH 1,0 M. Se

completó el volumen a 25,0 mL con NaOH 0,33 M, se

mezcló y se transfirió a un recipiente rotulado como

“extracto alcalino”. Se guardaron todos los extractos en

refrigeración.

Parte 2: Análisis Cualitativo

Se realizaron las siguientes pruebas cualitativas a los

cuatro extractos:

- Extracto acuoso: Molisch, Lugol, Nelson-

Somogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff y

Biuret.

- Extracto metanólico: Molisch, Lugol, Nelson-

Somogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff,

Biuret, Liebermann y Vainillina.

- Extracto etéreo: Liebermann y Vainillina

- Extracto Alcalino: Molisch, Lugol, Nelson-

Somogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff y

Biuret.

Para las pruebas de Molisch, Lugol, Nelson-Somogyi,

Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff y Biuret, se utilizó

los procedimientos ya antes conocidos de prácticas

pasadas, en el caso de las pruebas de Vainillina y

Liebermann se siguió el siguiente procedimiento:

- Prueba de Liebermann

A 50,0 µL de la incógnita se agregó 2,0 mL de

reactivo de Liebermann. Se colocó el tubo en un

sitio oscuro y se esperó 15 minutos. Hasta la

aparición de un color de azul al verde.

- Prueba de Vainillina:

A 100,0 µL de la solución problema en un tubo de

13×100 mm, se le agregó 100,0 µL de ácido

sulfúrico concentrado. Se mezcló, se tapó el tubo

con una bola de vidrio y se puso en baño María

por 10 minutos. Se sacó el tubo del baño, se dejó

enfriar a temperatura ambiente. Se le añadió 4,0

mL de ácido fosfórico concentrado y se mezcló;

luego se le agregó 1,0 mL del reactivo de

vainillina. Se mezcló muy bien y se puso en baño

de agua a 35-40ºC por 15 minutos.

Parte 3: Análisis Cuantitativo

Se determinó cuantitativamente los azúcares

totales por fenol-sulfúrico, leída a 480 nm, el almidón

por Lugol, leída a 570 nm y las proteínas por Biuret,

leída a 550 nm, en aquellos extractos en que se

obtuvieron resultados cualitativos positivos para cada

caso. En el caso de estas pruebas se realizaron los

procedimientos conocidos con anterioridad de prácticas

pasadas, y en el caso de la determinación de lípidos

insaturados y esteroles se realizaron los procedimientos

cuantitativos de Lípidos Insaturados por Sulfo-

Fosfovainillina y de esteroles por el método de

Liebermann-Bouchard de la siguiente forma:

- Análisis de Lípidos Insaturados por Sulfo-

fosfo-vainillina

Se construyó una curva patrón conteniendo 3, 6, 9,

12 y 15 mg/mL de ácido oleico. Se agregó 10 µL

de etanol (blanco), patrón y muestra a un tubo de

ensayo de 16x100 mm. Se agregó 100 µL de ácido

sulfúrico concentrado a cada tubo y se mezcló bien

en un agitador vórtex. Se agregó 5 mL de reactivo

de Fosfovainillina y se mezcló en un agitador

vórtex, se espero la aparición de un color rosado y se

leyó a 540 nm en un lapso no mayor a 30 minutos.

- Análisis de Esteroles por Liebermann-

Bouchard

Se construyó una curva patrón conteniendo 2, 4, 6,

8 y 10 mg/mL de colesterol. Se colocó 6 mL de

reactivo de Liebermann-Bouchard en un tubo de

ensayo de 16x100 mm. Se agregó 100 µL de ácido

acético glacial, estándar y muestra, y se mezcló

bien con un agitador vórtex. Se leyó a 650 nm en

un lapso no mayor a 10 minutos.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

Cuadro 3. Resultados de las diferentes pruebas

cualitativas para los diferentes extractos obtenidos de

la leche.

Prueba/Fase Acuosa Etérea Metanólica Alcalina

Molisch Positivo *NA Negativo Negativo

Lugol Negativo *NA Negativo Negativo

Nelson Negativo *NA Negativo Negativo

Antrona Negativo *NA Negativo Negativo

Bial Positivo *NA Negativo Negativo

Seliwanoff Positivo *NA Negativo Negativo

Biuret Negativo *NA Negativo Positivo

Liebermann *NA Positivo Negativo *NA

Vainillina *NA Positivo Negativo *NA

*NA: No Aplica

Figura 5. Curva de calibración por Fenol Sulfúrico, utilizando patrones

de glucosa de diferente concentración, para la determinación de azúcares

totales en la leche, leída a 480 nm en un Spectronic 20 D+.

Figura 6. Curva de calibración por Lugol, utilizando patrones de

almidón de diferente concentración, para la determinación de almidones

en la leche, leída a 570 nm en un Spectronic 20 D+.

Figura 7. Curva de calibración por Biuret, utilizando patrones de

albúmina de suero bovino de diferente concentración, para la

determinación de proteínas en la leche, leída a 550 nm en un Spectronic

20 D+.

Figura 8. Curva de calibración por Sulfo-fosfo-vainillina, utilizando

patrones de ácido oleico de diferente concentración, para la

determinación de lípidos insaturados en la leche, leída a 540 nm en un

Spectronic 20 D+.

Figura 9. Curva de calibración por Liebermann-Bouchard, utilizando

patrones de colesterol de diferente concentración, para la determinación

de esteroles en la leche, leída a 650 nm en un Spectronic 20 D+.

y = 0.0012xR² = 0.9971

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0 20 40 60 80 100 120

y = 0.001x + 0.0481R² = 0.7634

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 50 100 150 200

y = 0.0377xR² = 0.9976

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 5 10 15

Absorban

cia

concentracion

y = 0.0028xR² = 0.9984

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

0.040

0.045

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00

Ab

sorb

anci

y = 0.0009xR² = 0.8243

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 100 200 300 400 500 600

Es importante recalcar que para la obtención

Fig.9 los patrones de colesterol utilizados fueron de

100, 200, 300, 400 y 500 µg/mL, debido a que la

disolución madre de colesterol que nos brindaron era

de 1 mg/mL, por lo que los patrones sugeridos en el

procedimiento de 2, 4, 6, 8 y 10 mg/mL no se podían

preparar a partir de esta disolución madre.

Como se muestra en el cuadro 3, la fase o

extracto acuoso mostró un resultado positivo para

Molisch, Antrona y Bial, por lo que sugiere que se

encuentran presentes azúcares, por este motivo este

extracto acuoso solamente se cuantificó mediante el

método de Fenol sulfúrico. El azúcar más importante

que se encuentra en la leche es la lactosa, un

carbohidrato soluble en agua, lo que concuerda que el

mismo se haya encontrado en la fase acuosa, ya que

cuando se agregó el ácido tricloroacético a la leche, se

formaron 2 fases: la fase sólida, que contenía las

grasas y proteínas y la fase acuosa que contenía los

carbohidratos. La presencia de carbohidratos en esta

fase es debido a que los mismos son solubles en el

ácido tricloroacético ya que forman puentes de

hidrógeno entre los grupos hidroxilo de los

carbohidratos con el grupo carboxílico del ácido.

En el cuadro 3 también observamos que para el

extracto etéreo Liebermann y Vainillina resultaron

positivos, lo que resulta en la presencia de lípidos

insaturados y esteroles como el colesterol. Lo cual es

concordante con lo esperado debido a que las grasas

se separaron de la fase acuosa por precipitación con

ácido tricloroacético y luego se realizaron

extracciones con éter de petróleo y etanol, dejando así

las grasas (no hidrosolubles) en la fase etérea y los

demás compuestos hidrosolubles en la fase

metanólica. La fase metanólica debía contener

proteínas solubles y otros compuestos hidrosolubles,

pero según el cuadro 3, al resultar negativo para todas

las pruebas, supone una cantidad muy pequeña de los

mismos, tal vez por la clase de leche que utilizamos.

Para el extracto alcalino según el cuadro 3,

solamente dio positivo para la prueba de Biuret,

prueba que detecta proteínas. En este caso se trata de

la caseína, proteína encontrada en mayor proporción

en la leche. La caseína se separó de la leche junto con

las grasas, mediante la adición del ácido

tricloroacético; la caseína no es soluble ni en éter de

petróleo ni en metanol, razón por la cual seguía sólida

en la extracción etérea-metanólica. La caseína al

tratarse con hidróxido de sodio se convierte en

caseinato de sodio y se solubiliza, razón por la cual

esta proteína la encontramos en este extracto.

A continuación mostramos para los distintos

extractos las absorbancias y concentraciones, junto

con la respectiva curva de calibración con que fueron

cuantificados los componentes de la leche.

Cuadro 4. Resumen de las absorbancias y

concentraciones de los distintos extractos, utilizando

para su cuantificación la prueba específica que aquí se

menciona.

Prueba

cuantitativa

Acuoso Etéreo Alcalino

Liebermann A NA 0,006 NA

C (µg/mL)

NA 5,4 x10-6

NA

Fenol

sulfúrico

A 0,312 NA NA

C

((µg/mL)

0,0936 NA NA

Vainillina A NA 0,000 NA

C (µg/mL)

NA 0,000 NA

Biuret A NA NA 0,152

C (µg/mL)

NA NA 5,73

*A: absorbancia, C: concentración

*NA: no aplica

El extracto metanólico no se sometió a cuantificación

debido a que el mismo presentó solamente resultados

negativos en todas las pruebas cualitativas

anteriormente mencionadas.

Para la cuantificación del extracto acuoso se

realizó una dilución de 0,4 mL de extracto en 100 mL

de agua destilada. En la cuantificación por Vainillina

y Liebermann del extracto etéreo, no se realizó

dilución alguna; y para la cuantificación por Biuret del

extracto alcalino no se realizó dilución alguna

tampoco. En el extracto etéreo la cuantificación con

la vainillina resultó en una concentración de ácidos

grasos de 0 µg/mL, puede ser porque la leche

semidescremada utilizada posee muy pocos de estos

lípidos insaturados. A parte que el procedimiento

sugiere el calentamiento adicional en baño maría, lo

cual no se debe realizar porque el calentamiento que

provoca el ácido sulfúrico es suficiente, y un extra

calentamiento puede provocar datos erróneos.

Además que la curva de calibración realizada utilizó

el ácido oleico como patrón, estaba viejo por lo que la

instauración del acido graso se oxida a un epóxido que

posteriormente se abre por medio de la hidrólisis del

epóxido, por lo cual al no haber doble enlace la

reacción con la fosfovainillina no se da o se da muy

baja. La concentración de esteroles en la leche, según

la cuantificación por Liebermann del extracto etéreo

nos da de 5,4 x10-6

µg/mL, lo cual es una cantidad

bastante pequeña, esto debido a que el procedimiento

según el manual sugería el calentamiento de las

disoluciones antes de hacer su lectura en el

espectrofotómetro, lo cual al realizarlo el color verde

desarrollado inicialmente se perdió y por ende su

absorbancia no es la correcta ni su concentración

tampoco.

Según las especificaciones detalladas en la

leche utilizada se informa que; contiene 5 gramos de

grasa, 12 gramos de carbohidratos y 8 gramos de

proteína, esto referido a 250 mL, por lo que para 1 mL

sería: 20 µg de grasa por mililitro de leche, 480 µg de

carbohidratos por mililitro de leche y 32 µg proteína

por mililitro de leche. Por lo que los resultados, según

el cuadro 4, de concentración obtenidos para grasas

(Liebermann), proteínas (Biuret) y carbohidratos

(Fenol sulfúrico) no coinciden con las teóricas

especificadas en la información nutricional de la

leche, esto debido a las razones anteriormente

mencionadas en el caso de Liebermann y Vainillina; y

para el caso de Biuret se obtuvo un resultado menor

que el teórico debido a que las proteínas se encuentran

en el extracto acuoso, el cual es el último extracto que

se obtiene, por ende luego de todo el tratamiento que

se le realizó a la leche, parte de la proteína pudo

quedar en los diferentes extractos, eso sí, quedando la

mayoría en el extracto alcalino. En el caso de la

cuantificación por Fenol sulfúrico, se obtuvieron datos

erróneos, por errores de los analistas que realizaron

esta curva de calibración.

CONCLUSIONES

En la prueba cuantitativa de Fosfo-sulfo-vainillina no

debe de ser calentada en baño maría luego de la

adición de los diferentes reactivos, ya que puede

resultar en datos erróneos.

En cuanto al patrón de Ácido Oleico para la

realización de la curva de calibración en la

cuantificación de lípidos en leche es necesario realizar

la preparación de la disolución patrón de este acido

antes de hacer el análisis y no utilizar uno que sea

viejo para evitar la oxidación de la instauración.

Es necesario realizar un blanco de 100 µL en etanol en

el primer patrón en la reacción con sulfo-

fosfovainillina y no con agua como indica el método

debido a que mejora la introducción de los patrones en

la curva de calibración y realizar los aforos de los

patrones con este mismo solvente.

En la prueba de Liebermann, la disolución resultante

no debe de calentarse antes de realizar la lectura

espectrofotométrica, ya que la intensidad del color

desarrollado previamente al calentamiento disminuye

significativamente y los resultados podrían resultar

erróneos.

Para la cuantificación exacta de los componentes de la

leche, se debería de utilizar un procedimiento en el

cual tome en cuenta la repartición de los diferentes

componentes a analizar en los distintos extractos de la

leche.

Para una mejor visualización, en modo de laboratorio,

de la repartición de los componentes de la leche en los

distintos extractos y una mejor cuantificación es

recomendable utilizar leche que no sea

semidescremada o descremada, sino leche entera.

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